一种降低土壤重金属镉含量的方法

1.本技术属于土壤重金属修复技术领域，尤其是涉及一种降低土壤重金属镉含量的方法。


背景技术：

2.近年来，随着我国工业化和城市化进程的不断推进，我国的农田土壤污染情况越来越严重。其中，镉是一种高毒性、难于生物降解的重金属，对土壤生态系统和人体健康都带来了很大的危害。生物修复主要是利用植物修复，通过选择适应重金属污染环境的植物，利用植物的富集和降解能力，降低土壤中重金属以及其他污染物的含量，实现污染物的有效治理和恢复生态的目的。超积累植物是一类特殊的植物，具有较高的重金属积累能力，被广泛应用于土壤修复中。
3.然而，超积累植物自身对于重金属的吸收能力和耐受能力有限，在不外加干预的情况下，超积累植物容易受重金属的毒害使其寿命大大缩短，从而起不到循环吸收修复的效果，同时一般的超积累植物具有生长缓慢、修复效率低、修复周期长等问题，使得修复效果不佳。


技术实现要素：

4.本技术的目的在于克服上述现有技术的不足，提供了一种降低土壤重金属镉含量的方法，其能够提高镉富集超积累植物对土壤中镉的吸收和耐受程度，从而延长镉富集超积累植物的寿命和对镉的吸收能力，提高土壤的修复效果。
5.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
6.一种降低土壤重金属镉含量的方法，包括以下步骤：
7.s10:将镉富集超积累植物种植在重金属镉污染土壤中；
8.s20:将谷胱甘肽促进剂喷洒在所述镉富集超积累植物的叶片上，以提高所述镉富集超积累植物中谷胱甘肽的产生量，从而提升所述镉富集超积累植物对土壤中镉的吸收和耐受程度。
9.进一步，所述降低土壤重金属镉含量的方法还包括：
10.所述镉富集超积累植物在种植一段时间后，对所述镉富集超积累植物进行收获；并再次将新的镉富集超积累植物种植在重金属镉污染土壤中，并重复上述s10步骤和s20步骤。
11.进一步，所述镉富集超积累植物为龙葵。
12.进一步，所述谷胱甘肽促进剂为l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液。
13.进一步，所述l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液的溶剂为超纯水，所述l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液的浓度范围为0.5mmol/l-1.5mmol/l。
14.进一步，所述镉富集超积累植物为龙葵，所述谷胱甘肽促进剂为l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液；所述降低土壤重金属镉含量的方法具体包括以下步骤：
15.步骤1：将龙葵幼苗移栽至重金属镉污染的土壤中；
16.步骤2：继续在所述重金属镉污染土壤中对所述龙葵幼苗进行培育，待龙葵成长至幼苗后期开始向其叶片喷洒所述l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液，并持续向龙葵的叶片喷洒所述l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液至其生长旺盛期。
17.进一步，所述步骤1中，龙葵幼苗在移栽前经过培育处理，所述龙葵幼苗的培育处理步骤具体包括：
18.步骤a：将龙葵种子浸于70％的乙醇溶液中30min，并冲洗干净；
19.步骤b：再将龙葵种子浸于2％次氯酸钠溶液中10min，并冲洗干净；
20.步骤c：将清洗干净的龙葵种子恒温培养，待龙葵种子长出幼苗时，将龙葵幼苗放置于自然光下，即完成所述龙葵幼苗的培育处理。
21.进一步，所述步骤c中，所述龙葵种子长出幼苗时，具体为龙葵种子恒温培养14天后龙葵植株长至3-4cm高时。
22.进一步，所述步骤2中，所述龙葵的幼苗后期指龙葵植株生长至4-6cm高，所述龙葵的生长旺盛期指龙葵植株开花结果后。
23.进一步，所述步骤2中，向龙葵的叶片喷洒所述l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液时，喷壶喷口距离所述龙葵的叶片8-12cm。
24.进一步，所述步骤2中，所述龙葵成长至幼苗阶段开始向龙葵的叶片喷洒所述l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液的频次为每日一次，具体喷施时间为晚上。
25.进一步，所述重金属镉污染土壤中的镉浓度小于60mg/kg。
26.本发明提供的降低土壤重金属镉含量的方法，通过向种植在重金属镉污染土壤中的镉富集超积累植物的叶片上喷洒谷胱甘肽促进剂，谷胱甘肽促进剂能够促进镉富集超积累植物中谷胱甘肽的产生量；谷胱甘肽具体是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成，其半胱氨酸上的巯基为谷胱甘肽活性基团，易与重金属结合，而具有整合解毒作用。谷胱甘肽在植物体内，可以由螯合肽合成酶催化在细胞质中聚合形成植物螯合肽，植物螯合肽具有很强的重金属亲和力，能够与土壤中重金属镉螯合成形成无毒的结合态重金属镉化合物，降低了细胞中游离态的重金属镉离子浓度，防止重金属离子敏感酶变性失活，这些结合态重金属镉化合物随后转运到液泡中暂时储存起来。而镉富集超积累植物中谷胱甘肽含量的增加，螯合吸收的游离态重金属镉愈多，能够促进土壤中更多的重金属镉进入镉富集超积累植物内，从而提高镉富集超积累植物对土壤中镉的吸收，同时，镉富集超积累植物中的谷胱甘肽能够与cd发生螯合反应，生成低毒性的结合态cd，从而减轻cd对镉富集超积累植物的毒性影响，提高镉富集超积累植物对镉的耐受程度，延长其生长寿命，达到循环吸收修复的效果，进而提高土壤的修复效果。
27.而且，本发明采用的向镉富集超积累植物的叶片上喷洒谷胱甘肽促进剂的方式，相较于直接将谷胱甘肽浇入土壤中、再经由植物生长吸收再利用的方式，其能够提高谷胱甘肽的产生效率，并降低成本，减少污染(若采用直接将谷胱甘肽浇入土壤中、再经由植物生长吸收再利用的方式，一方面谷胱甘肽的生产成本远高于本发明的谷胱甘肽促进剂的生产成本，另一方面超积累植物从根系吸收谷胱甘肽的效率远低于叶片吸收谷胱甘肽促进剂的效率；同时，向重金属镉污染的土壤浇施谷胱甘肽时需要额外浇入一部分水，会造成不必要的二次水污染，而且相较于叶面喷洒的方式不容易进行喷施操作)。
28.有益效果：
29.(1)本发明的降低土壤重金属镉含量的方法，通过外施谷胱甘肽促进剂，提高超金属积累植物体内谷胱甘肽含量，来提升镉富集超积累植物富集重金属镉的能力，最高可提升85.47％；
30.(2)本发明的降低土壤重金属镉含量的方法，可以显著提高镉富集超积累植物对土壤重金属镉的富集能力，具体地，在重金属镉含量为30mg/kg土壤上外施谷胱甘肽促进剂，使得镉富集超积累植物地上部分富集镉的能力提升了85.47％，镉富集超积累植物地下部分富集镉的能力提升了76.62％，镉富集超积累植物叶片对于镉的富集能力提升了10.33％。
附图说明
31.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
32.图1为本发明的实施例1与对比例1和对比例2中不同处理方式下龙葵体内富集cd含量的对比示意图；
33.图2为本发明的实施例1与对比例1和对比例2中不同处理方式下龙葵叶片中原生质体和液泡中总cd含量的对比示意图；
34.图3为本发明的实施例1与对比例1和对比例2中不同处理方式下龙葵叶片中原生质体和液泡中cd
2+
含量的对比示意图；
35.图4为本发明的实施例1与对比例1和对比例2中不同处理方式下龙葵叶片中原生质体和液泡中结合态cd含量的对比示意图；
36.图5为本发明中电子显微镜下龙葵叶片中原生质体与液泡的形态结构示意图；
37.图6为本发明中荧光显微镜下龙葵叶片染色前后原生质体的形态结构对比示意图。
具体实施方式
38.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举例子只用于解释本发明，并非用于限定发明的范围。
39.下面结合具体实例对本发明作进一步说明。
40.本发明的降低土壤重金属镉含量的方法，包括以下步骤：
41.s10:将镉富集超积累植物种植在重金属镉污染土壤中；
42.s20:将谷胱甘肽促进剂喷洒在所述镉富集超积累植物的叶片上，以提高所述镉富集超积累植物中谷胱甘肽的含量，从而提升所述镉富集超积累植物对土壤中镉的吸收。
43.本发明的上述方法，采用生物富集方法处理土壤中重金属时，所采用的超积累植物体内的谷胱甘肽含量对于超积累植物富集土壤重金属镉能力影响较大，谷胱甘肽含量高时超积累植物富集重金属镉的能力强，具体为采用谷胱甘肽促进剂喷施植物叶片，提高超积累植物富集的重金属镉的量，以提高土壤重金属镉的清除效率，降低土壤中的重金属镉
4-甲酸溶液具有提高植物体内谷胱甘肽含量效果，同时配制成本低，适合大批量生产与利用。
51.进一步地，l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液的溶剂为超纯水，l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液的浓度范围为0.5mmol/l-1.5mmol/l。
52.l-2-噻唑林二酮-4-甲酸(otc)溶液的具体制备方法：直接购买otc药品，并使用超纯水作为溶剂配置成浓度范围为0.5mmol/l-1.5mmol/l的溶液。
53.在上述浓度范围中，植物体内谷胱甘肽含量可以保持较高水平，同时谷胱甘肽利用效率也更加，可以积累更多的重金属镉。
54.优选地，l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液的浓度范围为1mmol/l，效果更佳。
55.本发明中降低土壤重金属镉含量的方法，具体包括以下步骤：
56.步骤1：将龙葵幼苗移栽至重金属镉污染的土壤中；
57.步骤2：继续在所述重金属镉污染土壤中对所述龙葵幼苗进行培育，待龙葵成长至幼苗后期开始向其叶片喷所述l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液，持续喷至龙葵生长旺盛期。
58.对大多数植物来说，土壤和水是植物营养物质的来源，植物在吸收养分的过程中，土壤和水中的重金属被植物吸收后，对植物的生长产生不利的影响。谷胱甘肽可结合植物机体内的重金属，使之排出体外，保持机体内的稳定状态。谷胱甘肽可通过络合机体内重金属的方式降低植物体内的重金属含量，降低重金属对植物的毒性。因此过早收获龙葵会导致龙葵富集的重金属镉量太少，过晚收获龙葵会将结合态的重金属镉化合物会被龙葵重新排出至环境中，起不到土壤修复的效果。
59.具体地，需要移栽龙葵主要是因为重金属镉污染的土壤不利于超积累植物种子的发芽与幼苗生长，重金属镉会对种子或者刚发芽的幼苗有毒害作用，导致发芽失败或生长失败，同时会严重延长整个幼苗期的生长过程，导致重金属污染土壤处理周期延长，不利于快速有效去除土壤中重金属镉，因此本发明采用移栽龙葵幼苗的方式来去除土壤中的重金属镉。
60.进一步地，步骤1中龙葵幼苗在移栽前经过培育处理，龙葵幼苗的培育处理步骤具体包括以下步骤：
61.步骤a：将龙葵种子浸于70％的乙醇溶液中30min，并冲洗干净；
62.步骤b：再将龙葵种子浸于2％次氯酸钠溶液中10min，并冲洗干净；
63.步骤c：将清洗干净的龙葵种子恒温培养，待龙葵种子长出幼苗时，将龙葵幼苗放置于自然光下，即完成所述龙葵幼苗的培育处理；然后再将龙葵幼苗移栽至被重金属镉污染的土壤中。
64.具体地，对龙葵种子的前处理，可以保障龙葵较高的发芽率与存活率，同时用2％次氯酸钠溶液处理，可以降低后续培育过程中龙葵感染其他病虫害的概率，提高龙葵的生存几率降低不利因素的干扰。
65.进一步地，在上述步骤2中，对龙葵幼苗在重金属镉污染的土壤中进行培育，具体包括：保持龙葵幼苗在日照时间为8-12h、温度为20-25℃、湿度保持在50％以上的环境中进行培育。
66.具体地，需要将龙葵移栽后继续培育一段时间一方面可以增加龙葵对新的环境的适应能力，另外一方面幼苗长大些整体植株对外界环境的耐受性会更好，方便后续对其进
行谷胱甘肽促进剂的喷施，提高其对谷胱甘肽促进剂的吸收利用率。维持光照、温度、湿度分别为日均光照时间10小时，温度25℃，相对湿度50％环境，此环境为龙葵生长的最佳环境条件，有利于龙葵幼苗的生长，能快速生长，增加龙葵幼苗的环境耐受性，方便进行后续操作步骤。
67.进一步地，在龙葵移栽前处理步骤c中，龙葵种子长出幼苗时，具体为龙葵种子恒温培养14天后龙葵植株长至3cm高时。在恒温培养14天后，龙葵植株可生长至3cm高，此时最适应进行移栽培育，过早不利于龙葵后续的移栽存活，过晚则会延长整体的土壤重金属镉的处理周期。
68.进一步地，本发明中降低土壤重金属镉含量的方法，具体步骤2中，龙葵幼苗后期指龙葵植株生长至4-6cm，龙葵生长旺盛期指龙葵植株开花结果后。
69.具体地，在重金属镉污染的土壤中继续培育龙葵幼苗至龙葵植株生长至4-6cm后再向龙葵叶片进行喷施谷胱甘肽促进剂，有利于龙葵幼苗适应新的土壤环境，同时龙葵生长更粗壮些也有利于后续喷施叶片时叶片的稳定性，龙葵叶片相对更加不容易掉落，能够顺利生长。龙葵生长旺盛期指龙葵植株开花结果后，此时龙葵植株对于土壤中重金属镉的吸收利用率达到最佳状态，再继续生长龙葵的富集能力会逐渐减弱。
70.进一步地，本发明中降低土壤重金属镉含量的方法，具体步骤2中，l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液喷洒所述龙葵叶片时，喷壶喷口距离所述龙葵叶片10cm，每盆每次喷洒10mll-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液。因为此时龙葵仅有5片叶片左右，太近的距离由此产生的喷雾力量也较大容易折了龙葵的茎，对叶片会有比较大的反作用力，龙葵叶片容易掉落，导致整个除镉过程的失败，喷施距离太远则在喷雾中溶液到达龙葵叶片的量会巨幅减少，不利于对谷胱甘肽促进剂的使用效率，造成l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液的浪费，同时龙葵能吸收到的l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液量也少，不利于后续除镉工作的开展。
71.进一步地，本发明中降低土壤重金属镉含量的方法，龙葵成长至幼苗阶段开始向其叶片喷施所述l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液，频次为每日一次，具体喷施时间为晚上。
72.具体地，晚上气温相对交低，没有阳光直射喷施的l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液可以最大可能的被龙葵所吸收。
73.优选地，晚上具体为：晚上到次日凌晨5点。
74.进一步地，本发明中降低土壤重金属镉含量的方法，重金属镉污染土壤中的镉浓度不超过60mg/kg。
75.过高的土壤重金属镉浓度会直接伤害到龙葵幼苗，导致其无法在污染的土壤中生存，不能进行后续的除镉处理。
76.以下通过具体的实施例对本发明的效果进行具体说明。
77.其中本发明实施例和对比例1及对比例2中的龙葵种子均购买自江苏省宿迁市沭阳县帅轩绿化苗木场，土样均取自江苏省无锡市江南大学试验田，土壤ph为6.45，有机质含量为0.41g/kg，总镉浓度为0.3mg/kg，有效态钾浓度为0.89mg/kg。
78.实施例1
79.本实施例采用本发明的方法对含有不同cd浓度的土壤分别进行处理，具体过程如下：
80.1.准备待处理的土壤：将过筛的干土分为三份，并将配制好的cdcl2分别添加至其
中的两份中，得到三份含有cd的浓度分别0、30、60mg/kg的土壤。将上述三份土壤在避光条件下放置两周，确保确保重金属得到稳定。待重金属稳定后，将上述三份土壤分别再次进行风干过筛，之后，将没份土壤加入三个花盆中，并且装入的质量相等。
81.本实施例使用的花盆直径为16cm，高度为13cm。
82.2.龙葵种子处理及龙葵移栽前处理：
83.s1：挑选饱满的龙葵种子，放置于70％的乙醇溶液中，消毒30min，用超纯水冲洗干净。
84.s2：将龙葵种子放置于2％次氯酸钠溶液中，消毒10min，再次用超纯水冲洗干净。通过以上操作可以减少龙葵病害的发生。
85.s3：为了让龙葵种子顺利发芽，在事先准备好的托盘上，平铺两层消毒过的纱布，将清洗干净的龙葵种子有序的排布于纱布之上，然后将托盘放入恒温培养箱内，恒温培养箱的温度设为27℃。需要保持龙葵种子的湿润，依据纱布的干湿情况适当补充水分。
86.s4：14天左右后，龙葵种子长出幼苗。当龙葵幼苗长到3cm时，将龙葵幼苗放置于自然光下。
87.s5：一段时间后，选取生长发育趋势相似的龙葵幼苗进行移栽。
88.3.龙葵移栽后处理：
89.首先将上述移栽前处理好的龙葵幼苗移栽至先前已经装入2kg含重金属各污染土壤的花盆中，其中土壤重金属镉浓度梯度分别为0mg/kg、30mg/kg、60mg/kg。
90.每个花盆移栽入四颗生长良好的龙葵幼苗。再将龙葵植株放置于温室中，温室的日均光照时间为10小时，平均温度为25℃，温室内相对湿度为50％，早晚各浇水一次。
91.4.将移栽至重金属镉浓度分别为0mg/kg、30mg/kg、60mg/kg的土壤中的龙葵幼苗继续培育至龙葵成长至幼苗后期(5叶片)开始向其叶片喷l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液(otc)，频次为每日一次，持续喷至龙葵生长旺盛期(在温室中培育45天后收获植物，龙葵植株开花结果后)；
92.收获龙葵，并分别测定龙葵植株内谷胱甘肽含量、龙葵富集的重金属镉含量和土壤中剩余重金属镉含量、龙葵叶片液泡中总镉含量以及游离态镉cd
2+
含量。
93.实施例1中，所测得不同土壤重金属镉浓度下，与下述对比例2中外施清水组对比龙葵植株体内谷胱甘肽含量分别提升了30.86％，25.95％，23.48％。
94.如图1所示，横轴上下两部分各代表了在不同土壤重金属镉浓度下，实施例1及下述对比例1和对比例2测定的龙葵地上部及地下部积累的重金属镉的含量。具体地，在土壤重金属镉浓度为30mg/kg的时，龙葵地上部富集镉的含量和龙葵地下部积累的镉含量与下述对比例2相比分别提升了85.47％、76.62％；在土壤重金属镉浓度为60mg/kg时，龙葵地上部富集镉的含量和龙葵地下部积累的镉含量与对比例2相比分别提升了52.69％、65.91％。
95.如图2至图4所示，实施例1和对比例1及对比例2测定的不同处理方式下，龙葵叶片原生质体和液泡中富集重金属镉含量具体测定结果。具体地，在相同的实施例或对比例中，龙葵叶片在重金属镉胁迫下的实验结果表明，随着镉胁迫程度的增加，原生质体和液泡中的总cd和游离态cd
2+
含量都呈现出明显的增加趋势。在龙葵叶片细胞中，单个原生质体和液泡中总cd含量分别在0.06～0.42pg和0.05～0.37pg之间，而单个原生质体和液泡中cd
2+
的含量分别在0.02～0.04pg和0.02～0.04pg之间。在调控谷胱甘肽后，实施例1中外施otc后，
龙葵叶片细胞中总cd和cd
2+
的平均质量均有所上升。
96.以上实施例1各组实验中龙葵积累的重金属镉含量均较下述对比例1和对比例2高，同时，在土壤重金属镉浓度为30mg/kg时，龙葵地上部分富集重金属镉的能力相较于对比例2最佳，富集的重金属镉含量提升了85.47％。
97.龙葵通过谷胱甘肽与富集的游离态镉cd
2+
螯合成结合态cd，当龙葵液泡中富集的游离态镉cd
2+
越高，螯合反应越活跃，龙葵能够固定的结合态cd也越多，同时游离态镉cd
2+
对龙葵植株的毒害作用最强，通过螯合反应可进一步降低重金属镉龙葵的生理伤害，提高龙葵植株对重金属镉污染土壤的适应性。
98.详细数据见下表：
[0099][0100][0101]
对比例1
[0102]
采用丁硫氨酸-亚砜胺(bso)作为谷胱甘肽抑制剂，其具体制备方法：
[0103]
直接购买的bso药品，使用超纯水作为溶剂配置成浓度范围为0.5mmol/l-1.5mmol/l的溶液。
[0104]
其中：
[0105]
1.准备待处理的土壤；
[0106]
2.龙葵种子处理及移栽前处理步骤；
[0107]
3.龙葵移栽后处理，以上三步处理的处理方法均与实施例1相同。
[0108]
4.将移栽至重金属镉浓度分别为0mg/kg、30mg/kg、60mg/kg的土壤中的龙葵幼苗继续培育至龙葵成长至幼苗后期(5叶片)开始向其叶片喷丁硫氨酸-亚砜胺(bso)，频次为每日一次，持续喷至龙葵生长旺盛期(在温室中培育45天后收获植物，龙葵植株开花结果后)。
[0109]
收获龙葵，分别测定龙葵植株内谷胱甘肽含量、龙葵富集的重金属镉含量和土壤中剩余重金属镉含量、龙葵叶片液泡中总镉含量以及游离态镉cd
2+
含量。
[0110]
对比例1中，所测得不同土壤重金属镉浓度下，龙葵植株体内谷胱甘肽含量均较实施例1有了大幅下降；在土壤重金属镉浓度为30mg/kg的时，龙葵地上部富集镉的含量和龙葵地下部积累的镉含量与对比例2相比分别下降了12.48％、1.29％；在土壤重金属镉浓度为60mg/kg时，龙葵地上部富集镉的含量和龙葵地下部积累的镉含量与对比例2相比分别降低了9.57％和上升了2.17％。
[0111]
对比例1中，龙葵液泡中积累的游离态镉cd
2+
含量与实施例1相比也均有大幅下降，且较对比例2也有一定程度下降，使用了谷胱甘肽抑制剂龙葵叶片富集的镉进一步降低。详细数据见下表：
[0112][0113]
对比例2
[0114]
1.准备待处理的土壤；
[0115]
2.龙葵种子处理及移栽前处理步骤；
[0116]
3.龙葵移栽后处理，以上三步处理的处理方法均与实施例1相同。
[0117]
4.将移栽至重金属镉浓度分别为0mg/kg、30mg/kg、60mg/kg的土壤中的龙葵幼苗继续培育至龙葵成长至幼苗后期(5叶片)，开始向其叶片喷清水，频次为每日一次，持续喷至龙葵生长旺盛期(在温室中培育45天后收获植物，龙葵植株开花结果后)。
[0118]
收获龙葵，分别测定龙葵植株内谷胱甘肽含量、龙葵富集的重金属镉含量和土壤中剩余重金属镉含量、龙葵叶片液泡中总镉含量以及游离态镉cd
2+
含量。
[0119]
对比例2中，所测得不同土壤重金属镉浓度下，龙葵植株体内谷胱甘肽含量均较实施例1有了大幅下降；在土壤重金属镉浓度为30mg/kg的时，龙葵地上部富集镉的含量和龙葵地下部积累的镉含量分别为1.12mg/plant和1.52mg/plant；在土壤重金属镉浓度为60mg/kg时，龙葵地上部富集镉的含量和龙葵地下部积累的镉含量分别为2.52mg/plant和2.64mg/plant。
[0120]
对比例2中，龙葵液泡中积累的游离态镉cd
2+
含量随着重金属镉胁迫的增强，龙葵通过谷胱甘肽与富集的游离态镉cd
2+
螯合成结合态cd的越多，螯合反应越活跃，龙葵能够固定的结合态cd也越多，龙葵通过螯合反应可进一步降低重金属镉龙葵的生理伤害，提高了对重金属镉污染土壤的适应性。详细数据见下表：
[0121][0122]
具体试验测定方法如下：
[0123]
(1)龙葵植株内谷胱甘肽含量测定方法：
[0124]
t-gsh和gssg含量测定利用比色法，通过紫外分光光度计完成。总谷胱甘肽的量决定了黄色tnb形成量，tnb由gsh与dtnb(5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸))反应生成，测定样品在412nm处的吸光度，从而计算出总谷胱甘肽的含量。清除样品中的gsh，即可得到gssg的含量。
[0125]
(2)龙葵地上和地下部分cd的含量测定方法：
[0126]
s1、用去离子水反复清洗收获的植株，擦干称量鲜重，于105℃烘箱中杀青30min，然后再60℃烘干至恒重，并记录下干重。
[0127]
s2、称取烘干后的龙葵地上部和地下部各0.2g(整颗植株质量较小，含多株龙葵地上/地下部分)，将这些样品放入消解罐中，然后加入2ml氢氟酸、6ml浓硝酸以及2ml过氧化氢，使用微波消解仪进行消解。
[0128]
s3、完成消解后，将溶液放置在加热板上赶酸以除去hno3。
[0129]
s4、原子吸收分光光度计测定样品中cd含量。
[0130]
s5、计算得出龙葵地上部和地下部cd的富集含量。
[0131]
(3)龙葵液泡中总cd含量测定方法:
[0132]
液泡中的总cd使用原子吸收分光光度计测定。
[0133]
s1、将分离和纯化后的原生质体或液泡悬液(0.5ml)与hno3(7ml)混合后，一起倒入消解罐中，而放入微波消解仪中消解。
[0134]
s2、取该悬液100μl置于显微镜下计数。
[0135]
s3、完成消解后，将溶液放置在加热板上赶酸以除去hno3，超纯水定容至10ml，aas测定溶液中cd浓度。
[0136]
s4、通过相应原生质体或液泡的数量计算单个细胞中总镉的定量。
[0137]
(4)龙葵液泡中cd
2+
含量测定方法:荧光染料为leadiumtm green am，用于cd
2+
的定位及定量。
[0138]
对龙葵叶片中cd
2+
的定量分析，选用cd的特异性荧光探针leadmiumtm green am进行测定。具体测定步骤如下：
[0139]
s1、首先取1ml纯化后的悬液，加入了5μl浓度为0.1g l-1的探针溶液与之混合，在
避光条件下，将样品常温孵育2h。
[0140]
s2、用原生质体或液泡重悬液洗涤2次，而后将样品置于荧光显微镜下，观察荧光情况并拍摄了荧光照片。
[0141]
s3、使用了imagej软件进行分析，并测量荧光强度，绘制cd
2+
标准曲线得出cd
2+
含量。
[0142]
图5为本技术中，电子显微镜下进行龙葵叶片中原生质体与液泡形态观测的电子显微镜下的照片截图。
[0143]
图6为本技术中，使用cd的特异性荧光探针leadmiumtm green am进行测定时龙葵叶片中原生质体染色前后荧光显微镜下形态照片截图。
[0144]
将实施例1、对比例1、对比例2所测定数据使用spss 24.0进行差异显著性分析，并利用origin 2018作图，结果如附图1-4所示。
[0145]
在不同浓度的土壤重金属镉情况下，重金属镉浓度越高对龙葵的cd胁迫越强，通过控制谷胱甘肽促进剂和抑制剂调控龙葵植株内谷胱甘肽的含量，龙葵的镉积累量不同，其中喷施谷胱甘肽促进剂的实施例1中，龙葵积累的镉含量最高可提升85.47％，同时超富集植物龙葵的地上部和地下部表现出不同的富集cd能力，相同处理条件下根部可以富集更多的cd。
[0146]
采用原子吸收分光光度法和荧光校准曲线测定原生质体和液泡中的总cd和cd
2+
的平均含量，如图2和图3所示。并计算得出结合态cd的含量，如图4所示。结果表明实施例1中龙葵在液泡中积累的总镉含量以及游离态cd
2+
含量最高，龙葵可以通过在液泡内储存大量的cd来减少重金属带来的损伤。随着cd胁迫的增加，龙葵叶片中原生质体和液泡中总cd的含量也逐渐增加，且液泡/原生质体的比值也呈上升趋势。这说明，超积累植物龙葵在应对cd胁迫时可以通过液泡的积累作用来减轻细胞内部的毒害程度。通过与对比例相比，在实施例中，龙葵植株的谷胱甘肽含量得到显著提升，使得植株能够耐受更多的重金属cd，所以在实施例1中的龙葵，测定到更高的cd含量。在不同处理下，高毒性的cd
2+
含量也逐渐增加，但增加幅度较小，要小于总cd的增加幅度。因龙葵植物在较高浓度的重金属cd胁迫下，超积累植物通过产生大量的谷胱甘肽进行螯合解毒，并通过去镉化将重金属cd储存在液泡内。液泡内谷胱甘肽与游离态cd
2+
发生螯合反应，形成低毒性的结合态cd。与游离态cd
2+
相比，这种结合态cd的含量也呈上升趋势，龙葵植物可以通过这种方式减轻cd带来的毒性影响。
[0147]
在同一实施例或对比例中，龙葵叶片在重金属cd胁迫下，随着cd胁迫程度的增加，原生质体和液泡中的总cd和游离态cd
2+
含量都呈现出明显的增加趋势。在对比例的龙葵叶片细胞中，单个原生质体和液泡中总cd含量分别在0.06～0.42pg和0.05～0.37pg之间，而单个原生质体和液泡中cd
2+
的含量分别在0.02～0.04pg和0.02～0.04pg之间。在调控谷胱甘肽后的实施例1中，龙葵叶片细胞中总cd和cd
2+
的平均质量均有所上升。因超积累植物龙葵叶片细胞内谷胱甘肽含量的提升，使得更多的重金属被诱导进入细胞，且被谷胱甘肽螯合的重金属含量也显著增加，龙葵植株对重金属cd的耐受性增加，同时也缓解了重金属cd对植物细胞的损伤，从而提升了植物对于重金属cd的富集含量。
[0148]
以上所述仅为本技术的较佳实施例而已，并不用以限制本技术，凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种降低土壤重金属镉含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：s10:将镉富集超积累植物种植在重金属镉污染土壤中；s20:将谷胱甘肽促进剂喷洒在所述镉富集超积累植物的叶片上，以提高所述镉富集超积累植物中谷胱甘肽的产生量，从而提升所述镉富集超积累植物对土壤中镉的吸收和耐受程度。2.如权利要求1所述的降低土壤重金属镉含量的方法，其特征在于，所述降低土壤重金属镉含量的方法还包括：所述镉富集超积累植物在种植一段时间后，对所述镉富集超积累植物进行收获；并再次将新的镉富集超积累植物种植在重金属镉污染土壤中，重复上述s10步骤和s20步骤。3.如权利要求1所述的降低土壤重金属镉含量的方法，其特征在于，所述镉富集超积累植物为龙葵。4.如权利要求1所述的降低土壤重金属镉含量的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽促进剂为l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液。5.如权利要求4所述的降低土壤重金属镉含量的方法，其特征在于，所述l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液的溶剂为超纯水，所述l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液的浓度范围为0.5mmol/l-1.5mmol/l。6.如权利要求1-5中任一项所述的降低土壤重金属镉含量的方法，其特征在于，所述镉富集超积累植物为龙葵，所述谷胱甘肽促进剂为l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液；所述降低土壤重金属镉含量的方法具体包括以下步骤：步骤1：将龙葵幼苗移栽至重金属镉污染土壤中；步骤2：继续在所述重金属镉污染土壤中对所述龙葵幼苗进行培育，待龙葵成长至幼苗后期开始向其叶片喷洒所述l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液，并持续向龙葵的叶片喷洒所述l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液至其生长旺盛期。7.如权利要求6所述的降低土壤重金属镉含量的方法，其特征在于，所述步骤1中，所述龙葵幼苗在移栽前经过培育处理，所述龙葵幼苗的培育处理步骤具体包括：步骤a：将龙葵种子浸于70％的乙醇溶液中30min，并冲洗干净；步骤b：再将龙葵种子浸于2％的次氯酸钠溶液中10min，并冲洗干净；步骤c：将清洗干净的龙葵种子进行恒温培养，待龙葵种子长出幼苗时，将龙葵幼苗放置于自然光下，即完成所述龙葵幼苗的培育处理。8.如权利要求7所述的降低土壤重金属镉含量的方法，其特征在于，所述步骤c中，所述龙葵种子长出幼苗时，具体为龙葵种子恒温培养14天后龙葵植株长至3-4cm高时。9.如权利要求6所述的降低土壤重金属镉含量的方法，其特征在于，所述步骤2中，所述龙葵的幼苗后期指龙葵植株生长至4-6cm高，所述龙葵的生长旺盛期指龙葵植株在开花结果后。10.如权利要求6所述的降低土壤重金属镉含量的方法，其特征在于，所述步骤2中，向龙葵的叶片喷洒所述l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液时，喷壶喷口距离所述龙葵的叶片8-12cm。11.如权利要求6所述的降低土壤重金属镉含量的方法，其特征在于，所述步骤2中，向龙葵的叶片喷洒所述l-2-噻唑林二酮-4-甲酸溶液的频次为每日一次，具体喷施时间为晚
上。12.如权利要求1所述的降低土壤重金属镉含量的方法，其特征在于，所述重金属镉污染土壤中的镉浓度小于60mg/kg。

技术总结
本申请适用于土壤重金属修复技术领域，提供了一种降低土壤重金属镉含量的方法，具体包括以下步骤：S10:将镉富集超积累植物种植在重金属镉污染土壤中；S20:将谷胱甘肽促进剂喷洒在所述镉富集超积累植物的叶片上，以提高所述镉富集超积累植物中谷胱甘肽的产生量，从而提升所述镉富集超积累植物对土壤中镉的吸收和耐受程度，进而延长镉富集超积累植物的寿命和对镉的吸收能力，提高土壤的修复效果。提高土壤的修复效果。提高土壤的修复效果。


技术研发人员：滕跃 王振军 杨妍 陈浩楠 郑海洋 邹路易 郁红艳
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/10/15