一种柔性动态生物活性防污界面的制备方法及分离异质性循环肿瘤细胞的应用

1.本发明属于材料制备和循环肿瘤细胞分离技术领域，特指一种柔性动态生物活性防污界面的制备方法及分离异质性循环肿瘤细胞的应用。


背景技术：

2.从原发性肿瘤脱落到血液循环或淋巴系统的循环肿瘤细胞(ctcs)已成为“液体活检”的重要生物标志物，对于癌症的早期诊断、预测判断和实时疗效检测至关重要。然而，患者血液循环系统中ctcs的稀有性(每毫升数个至数百个)和表型异质性导致检测方面的技术挑战相当大。为了克服这些问题，人们开发了各种方法来有效和灵敏地从患者血液中捕获ctcs，主要使用基于癌细胞表面生物标志物的纳米结构底物来分离和富集ctcs。特别是，作为独特纳米结构的纳米线(nws)已经开发出来，例如多尺度二氧化钛纳米棒阵列和静电纺丝二氧化钛纳米纤维基板。然而，这些基板通常是基于玻璃板或金属板，它们不具备可能对细胞捕获有影响的类似ecm的柔软作用条件。除此之外，大多数体外细胞捕获材料的设计侧重于化学(分子识别)和物理(微/纳米拓扑相互作用)的结合，忽略了细胞与ecm相互作用的机械(包括柔软性)因素。因此，有必要开发高质量的细胞捕获平台，将软材料与化学和物理特性相结合，以模拟自然细胞微环境。此外，一些ctcs在血液循环过程中会发生表型变化，例如上皮间质转化(emt)，导致同一患者体内ctcs的生物学异质性。因此，基于单一抗体的亲和方法可能会降低捕获ctcs的能力。此外，抗体具有稳定性差、成本高等固有缺点，也限制了其应用。所有这些因素都给从患者血液中特异性捕获ctcs带来了很大困难。因此，迫切需要开发新的策略和特异性亲和分子来提高对不同表型下的癌细胞的高效捕获。


技术实现要素：

3.针对现有技术存在的问题，本发明首次报道了一种基于多价分子相互作用的新型柔性动态生物活性防污界面并用于特异性捕获不同表型的肿瘤细胞。首先，我们制备了具有类似珍珠和瓷漆的“砖和水泥”特殊结构的tio2纳米管复合膜,并使用生物相容性优异的多巴胺对膜进行表面修饰，最终得到pda@tio2纳米管复合膜不仅质地柔软，而且含有多种反应基团(如邻苯二酚、醌)，可以与生物活性仿生肽pba-(peg)
8-x和nh
2-(peg)
8-y进行接枝以特异性捕获肿瘤细胞。此外，牛血清白蛋白(bsa)作为一种抗污分子共价接枝在聚多巴胺层上，大大抑制了血液蛋白和细胞的粘附，以提高ctcs的捕获纯度。此外，向体系中添加果糖和谷胱甘肽可分别通过邻苯二酚基团的分子交换机制和二硫键断裂程序化释放细胞。
4.本发明制备出一种能够特异性捕获不同表型的肿瘤细胞并实现程序化细胞释放的新型柔性动态生物活性防污界面。其优点在于该方法从一种新颖的角度出发，在满足类ecm柔软的环境下提供了一种构建动态生物界面的新思路，在一定程度上解决了由于基底材料刚性问题造成的细胞损伤以及肿瘤细胞异质性带来的特异性捕获效率低等问题。
5.一种柔性动态生物活性防污界面的制备方法，步骤如下：
6.步骤1、tio2纳米管的制备：
7.采用简化的一步阳极氧化法制备tio2纳米管，其中阳极为高纯钛片，阴极为纯碳棒电极，电源采用直流稳压电源。
8.首先，对钛片进行预处理，依次用丙酮、无水乙醇及去离子水超声清洗以除去表面杂质并用氮气吹干备用。
9.柠檬酸和氟化铵均匀溶解在乙二醇/水的混合溶剂中以配制电解液。
10.在电极两端分别施加电压进行反应。反应结束后取出钛片用去离子水清洗干净后用氮气吹干，即得到tio2纳米管。
11.步骤2、tio2纳米管/丝素蛋白复合膜的制备：
12.将蚕茧壳放入na2co3水溶液中加热煮沸对其进行脱胶，再用去离子水清洗干净。烘干后的蚕丝溶解在含有cacl2的甲酸a中，将溶液倒在培养皿中并置于通风处待其完全干燥。将干燥后的脱胶蚕丝蛋白膜在循环水中浸泡以除去膜内残留的cacl2，烘干后将膜剪碎并溶解于甲酸b中。将膜溶液均匀涂覆在上述制备的tio2纳米管表面，并置于通风处自然干燥。待其完全干燥后，将膜从钛片上缓慢揭下来并固定在hf溶液上方，室温刻蚀，即得到tio2纳米管/丝素蛋白复合膜。
13.步骤3、柔性动态生物活性防污界面的制备：
14.将tio2纳米管/丝素蛋白复合膜浸泡在新鲜制备的多巴胺溶液中，用tris-hcl调节溶液ph，在室温下反应。之后，用去离子水清洗，并依次浸泡在含有生物活性仿生肽pba-(peg)
8-x和nh
2-s-s-(peg)
8-y的pbs溶液中，室温孵育过夜。用pbs洗涤后，将其转移到bsa水溶液中继续培养。最后，得到生物活性肽和抗污分子同时接枝的tio2纳米管/丝素蛋白复合膜，即柔性动态生物活性防污界面(tntm)。
15.步骤1中，所使用的高纯钛片的尺寸为0.1
×
30
×
70mm，超声清洗时间为10分钟；
16.电解液中，柠檬酸和氟化铵的浓度分别为0.11mol/l和0.15mol/l，乙二醇和水的体积比为9:1,电压20v，反应温度为25℃～70℃，反应1.0h。
17.步骤2中，na2co3水溶液的浓度为1.5g/l，加热煮沸处理时间为1.0h，
18.蚕丝、cacl2、甲酸a的质量比例为43：3：4；
19.循环水中浸泡时间为24h，
20.膜和甲酸b的质量比为6:94；
21.刻蚀时间为为5min。
22.步骤3中，
23.多巴胺溶液的浓度为2mg/ml；
24.ph值为8.5，室温下反应2h，
25.pba-(peg)
8-x浓度为80～120μg/ml，x的氨基酸序列为w-(d-nle)-eaayqrfl(remark:r is d-arg)。
26.nh
2-(peg)
8-y浓度为80～120μg/ml，y的氨基酸序列为grqlfdnpdqalldtandg。
27.bsa质量分数为1％，样品于4℃保存。
28.上述技术方案中所述的柠檬酸和氟化铵，其作用为电解质。
29.上述技术方案中所述的蚕茧壳，其作用为蚕丝蛋白本体。
30.上述技术方案中所述的甲酸，其作用为溶剂，溶解脱胶蚕丝蛋白膜。
31.上述技术方案中所述的hf，其作用为刻蚀液。
32.上述技术方案中所述的tio2纳米管，其作用为提供纳米尺度的地形作用，增强细胞的捕获效率。
33.上述技术方案中所述的蚕丝蛋白膜，其作用为固定tio2纳米管，并赋予材料优异的柔韧性。
34.上述技术方案中所述的多巴胺，其作用为对tio2纳米管进行表面修饰，赋予表面邻苯二酚和醌反应基团，同时增强材料的生物相容性和柔软性。
35.上述技术方案中所述的生物活性肽pba-(peg)
8-x和nh
2-(peg)
8-y，其作用为分别与邻苯二酚和醌进行反应接枝到多巴胺修饰的tio2纳米管上，赋予材料特异性识别ctcs的能力。
36.上述技术方案中所述的pbs，其作用为溶剂，溶解生物活性肽。
37.上述技术方案中所述的bsa，其作用为抑制血液蛋白和非特异性细胞的粘附，提高ctcs的捕获纯度。
38.上述技术方案中所述的丙酮、无水乙醇及去离子水，其作用为非溶剂。
39.将本发明制备的柔性动态生物活性防污界面用于非诊断和治疗为目的的，选择性分离循环肿瘤细胞的应用。
40.界面修饰的方法及其机理：
41.细胞和细胞外基质(ecm)之间的动态受体-配体相互作用对于细胞过程至关重要，例如细胞粘附和扩散、干细胞增殖和分化。作为ecm的模拟物，具有低刚度的柔性动态生物界面材料显着更有利于细胞的行为过程。在细胞相关领域，尤其是在稀有细胞分离中，与细胞相互作用的材料的柔软性极其重要。因此，本发明对tio2纳米管/丝素蛋白复合膜进行了一列的修饰，制备出了一种柔性动态生物活性防污界面(tntm)。
42.首先，在tio2纳米管/丝素蛋白复合膜的柔性界面的基础上，使用生物相容性良好的多巴胺对tio2纳米管/丝素蛋白复合膜进行表面修饰，在其表面引入多种反应基团(如邻苯二酚和醌)，从而可以与生物活性物质进一步结合。同时设计了生物活性仿生肽pba-(peg)
8-x，它由c端的细胞结合序列(x)、非生物活性peg防污链和具有苯硼酸基团(pba)的n端组成。其中，苯基硼酸基团可以与多巴胺引入的邻苯二酚基团通过形成动态邻苯二酚/pba酯锚定在tio2纳米管/丝素蛋白复合膜上，同时暴露生物活性x序列与肿瘤细胞膜受体相互作用以捕获x受体高表达的肿瘤细胞。为了实现界面与细胞的多价相互作用，本设计还合成了生物活性肽nh
2-s-s-(peg)
8-y，包括细胞结合序列(y)、非生物活性peg防污链和锚定基团(nh2)。其中，锚定基团(nh2)可与多巴胺修饰的tio2纳米管/丝素蛋白复合膜上的醌基团通过席夫碱反应形成亚胺动态共价键而被锚定在tio2纳米管/丝素蛋白复合膜上，使得生物活性y序列暴露在外部与细胞相互作用以捕获y受体高表达的肿瘤细胞。
43.概括来说，实验设计了一种新型的界面修饰方法：在多巴胺修饰的柔性基底上，通过形成邻苯二酚/pba酯和亚胺动态共价键将不同的生物活性肽共价接枝到柔性基底上，从而获得具有癌症靶向活性的柔性动态生物活性防污界面。此外，拥有万能粘附剂称号的多巴胺可以粘附在几乎所有材料的表面，因此可以利用我们所提出的动态共价键的接枝方法，将所设计的任何生物活性肽接枝到多巴胺修饰的基底材料上。而且，生物活性肽不仅仅局限于x和y，可以是任何细胞识别肽，只要这条多肽满足修饰上苯硼酸/氨基基团的条件。
因此我们所设计的一种新型的界面修饰方法可以不限基底材料，不限靶向目标，具有普适性。
44.本发明的技术优点：
45.(1)通过对柔性基底材料进行多巴胺改性以接枝两段生物活性肽pba-(peg)
8-x和nh
2-(peg)
8-y，制备一种能够特异性捕获异质性肿瘤细胞并实现细胞可控释放的新型柔性动态软生物界面，实现对生物学异质性肿瘤细胞的特异性捕获，在一定程度上解决了由于基底材料刚性问题造成的细胞损伤以及肿瘤细胞异质性带来的特异性捕获效率低等问题。同时，得益于生物活性肽上、非生物活性peg防污链以及牛血清白蛋白的共同作用，界面可有效地抑制血液蛋白和细胞的非特异性粘附，以提高肿瘤细胞的捕获纯度。最后向体系中添加果糖和谷胱甘肽可分别通过邻苯二酚基团的分子交换机制和二硫键断裂程序化释放细胞。
46.(2)用一种程序化可控的方式将捕获的肿瘤细胞从界面上释放，将有利于肿瘤细胞的下游分析。
47.(3)利用本发明获得的tio2纳米管基柔性复合膜具有明显的纳米尺度的地形作用，优异的拉伸性能以及高效的肿瘤细胞分离能力。
48.(4)本发明中tntm的制备步骤简单易操作，且整个修饰过程只在蚕丝的溶液过程(即步骤二)使用了甲酸，且在后续步骤已将甲酸完全去除。其他环节未使用化学试剂，属于绿色环保范畴.该方法打破了传统界面材料制备(多采用化学试剂聚合接枝的方法)的弊端，生物相容性优异，有望在未来生物医学检测等方向得以应用。
附图说明
49.图1为tio2纳米管基柔性复合膜的sem和afm图；
50.图2为tio2纳米管基柔性复合膜的实物图；
51.图3sk-br-3细胞和mcf-7细胞在石英板和tntm上的增殖情况。
52.图4tntm(bsa
+
和bsa-)上黏附的prp的荧光图像。
53.图5tntm选择性分离肿瘤细胞。a)tntm捕获前混合细胞的荧光图像；b)tntm捕获后界面上细胞的荧光图像。
54.图6a)细胞释放前的荧光图像；b)果糖处理后细胞的荧光图像；c)谷胱甘肽处理后细胞的荧光图像。
具体实施方案
55.下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明。
56.实施例1
57.一种柔性动态生物活性防污界面的制备方法，步骤如下：
58.(1)tio2纳米管的制备：
59.采用简化的一步阳极氧化法制备tio2纳米管，其中阳极为高纯钛片(0.1
×
30
×
70mm)，阴极为纯碳棒电极，电源采用直流稳压电源。首先，对钛片进行预处理，依次用丙酮、无水乙醇及去离子水超声清洗10分钟以除去表面杂质并用氮气吹干备用。柠檬酸(0.11mol/l)和氟化铵(0.15mol/l)均匀溶解在乙二醇/水的混合溶剂(v/v,9/1)中以配制
电解液。在电极两端分别施加20v的电压，25℃反应1.0h。反应结束后取出钛片用去离子水清洗干净后用氮气吹干，即得到tio2纳米管。
60.(2)tio2纳米管/丝素蛋白复合膜的制备：
61.将蚕茧壳放入1.5g/l的na2co3的沸水中加热煮沸对其进行脱胶，加热煮沸处理1.0h后用去离子水清洗蚕丝。烘干后的蚕丝溶解在含有6％(wt)cacl2的甲酸中，将溶液倒在培养皿中并置于通风处待其完全干燥。将干燥后的脱胶蚕丝蛋白膜在循环水中浸泡24h以除去膜内残留的cacl2，烘干后将膜剪碎并溶解于8％(wt)甲酸中。将500μl膜溶液均匀涂覆在上述制备的tio2纳米管表面，并置于通风处自然干燥。待其完全干燥后，将膜从钛片上缓慢揭下来并固定在hf溶液上面，室温刻蚀5min即得到tio2纳米管/丝素蛋白复合膜。
62.(3)柔性动态生物活性防污界面的制备：
63.将tio2纳米管/丝素蛋白复合膜浸泡在新鲜制备的2mg/ml多巴胺溶液中，用tris-hcl调节溶液ph至8.5，在室温下反应2h。将多巴胺修饰后的tio2纳米管/丝素蛋白复合膜用去离子水清洗干净，然后依次浸泡在含有生物活性仿生肽pba-(peg)
8-x和nh
2-(peg)
8-y的pbs溶液中(ph＝8.5,80μg/ml)，室温孵育过夜。用pbs洗涤后转移到质量分数为1％的bsa溶液中。最后，得到生物活性肽和抗污分子接枝的tio2纳米管/丝素蛋白复合膜，即柔性动态生物活性防污界面(tntm)于4℃储存备用。
64.tntm的sem图像(a)，水接触角图像(a的插图)以及afm图像(b)如图1所示，其表面三维拓扑粗糙结构和亲水性(接触角为46.1
°
)，有利于肿瘤细胞的黏附。
65.如图2所示，tntm具有优异的柔韧性，可以弯曲和折叠而不被损坏。
66.将实施例1制备的tntm用于分离异质性循环肿瘤细胞：
67.(1)柔性基底材料的优势
68.使用sk-br-3细胞和mcf-7细胞增殖实验探究软基质材料tntm和硬基质材料石英片的影响。可以得出结论，sk-br-3细胞(图3a、b)和mcf-7细胞(图3c、d)在软基地材料tntm上的增殖作用显著高于刚性石英板，表明细胞倾向于在软生物界面材料中粘附和生长。
69.(2)抗污性能
70.血小板粘附实验用于评估样品的防污性能。首先通过离心分离提取富含血小板的血浆(prp)，然后将富含血小板的血浆分别与在bsa溶液中浸泡的tntm(bsa
+
)和未在bsa溶液中浸泡的tntm(bsa-)在37℃下一起孵育。孵育完成后，用1％戊二醛固定，并用dii c18染色。最后，通过倒置荧光显微镜观察样品上粘附的prp。如图4，在和富含血小板的血浆孵育后，经bsa溶液中浸泡的tntm(a图)上的红色荧光强度明显低于未在bsa溶液中浸泡的tntm(b图)，这说明bsa的存在可在一定程度上减少血小板的黏附，起到一定抗污作用。
71.(3)循环肿瘤细胞的特异性捕获
72.使用mcf-7细胞(ck高表达，dio预染色)，sk-br-3细胞(her 2高表达，dapi预染色)和hl 60细胞(对照，dii预染色)来检验所制备材料的细胞分离性能。具体操作如下：
73.首先，将tntm放进24孔板中，然后将1ml mcf-7细胞，sk-br-3细胞和hl 60细胞混合液加入到孔板中，且混合液中三种的细胞密度(1
×
105cells/ml)相同。把孔板放进37℃和5％ co2的培养箱中静置一段时间后取出，用pbs溶液对tntm表面轻轻冲洗。最后在荧光显微镜下观察tntm上捕获的细胞的荧光图像，如图5所示，a为分别往体系中加入的三种细胞的初始荧光图，b为对应细胞捕获后tntm上捕捉到的三种细胞的荧光图。可以明显看出，
tntm对靶向肿瘤细胞mcf-7细胞(绿色荧光)和sk-br-3细胞(蓝色荧光)有较好捕获能力，而对非靶向细胞hl 60细胞基本不捕获(红色荧光)。这说明我们所制备的tntm对目标肿瘤细胞具有良好的选择性分离作用。
74.(4)程序化细胞释放
75.细胞捕获完成后，将含有果糖的培养基添加到24孔板中，并将孔板放在低速摇床上培养30分钟，最用荧光显微镜观察tntm上剩余细胞的情况。继续向系统中添加谷胱甘肽的培养基，并重复上述步骤。如图6，a代表细胞捕获后tntm上捕捉的细胞荧光图，b为往体系中添加果糖后，大部分mcf-7细胞(绿色荧光)释放后，tntm上存留细胞的荧光图。c为继续往体系中添加谷胱甘肽后，大部分sk-br-3细胞(蓝色荧光)释放后，tntm上存留细胞的荧光图。可以看出，经果糖和谷胱甘肽处理后的tntm上基本没有细胞荧光出现，说明两种细胞从tntm上得到释放。
76.实施例2
77.一种柔性动态生物活性防污界面的制备方法，步骤如下：
78.(1)tio2纳米管的制备：
79.采用简化的一步阳极氧化法制备tio2纳米管，其中阳极为高纯钛片(0.1
×
30
×
70mm)，阴极为纯碳棒电极，电源采用直流稳压电源。首先，对钛片进行预处理，依次用丙酮、无水乙醇及去离子水超声清洗10分钟以除去表面杂质并用氮气吹干备用。柠檬酸(0.11mol/l)和氟化铵(0.15mol/l)均匀溶解在乙二醇/水的混合溶剂(v/v,9/1)中以配制电解液。在电极两端分别施加20v的电压，50℃反应1.0h。反应结束后取出钛片用去离子水清洗干净后用氮气吹干，即得到tio2纳米管。
80.(2)tio2纳米管/丝素蛋白复合膜的制备：
81.将蚕茧壳放入1.5g/l的na2co3的沸水中加热煮沸对其进行脱胶，加热煮沸处理1.0h后用去离子水清洗蚕丝。烘干后的蚕丝溶解在含有6％(wt)cacl2的甲酸中，将溶液倒在培养皿中并置于通风处待其完全干燥。将干燥后的脱胶蚕丝蛋白膜在循环水中浸泡24h以除去膜内残留的cacl2，烘干后将膜剪碎并溶解于8％(wt)甲酸中。将500μl膜溶液均匀涂覆在上述制备的tio2纳米管表面，并置于通风处自然干燥。待其完全干燥后，将膜从钛片上缓慢揭下来并固定在hf溶液上面，室温刻蚀5min即得到tio2纳米管/丝素蛋白复合膜。
82.(3)柔性动态生物活性防污界面的制备：
83.将tio2纳米管/丝素蛋白复合膜浸泡在新鲜制备的2mg/ml多巴胺溶液中，用tris-hcl调节溶液ph至8.5，在室温下反应2h。将多巴胺修饰后的tio2纳米管/丝素蛋白复合膜用去离子水清洗干净，然后分别浸泡在含有生物活性仿生肽pba-(peg)
8-x和nh
2-(peg)
8-y的pbs溶液中(ph＝8.5,100μg/ml)，室温孵育过夜。用pbs洗涤后，将其转移到质量分数为1％的bsa溶液中。最后，得到生物活性肽和抗污分子接枝的tio2纳米管/丝素蛋白复合膜，即柔性动态生物活性防污界面(tntm)于4℃储存备用。
84.实施例3
85.一种柔性动态生物活性防污界面的制备方法，步骤如下：
86.(1)tio2纳米管的制备：
87.采用简化的一步阳极氧化法制备tio2纳米管，其中阳极为高纯钛片(0.1
×
30
×
70mm)，阴极为纯碳棒电极，电源采用直流稳压电源。首先，对钛片进行预处理，依次用丙酮、
无水乙醇及去离子水超声清洗10分钟以除去表面杂质并用氮气吹干备用。柠檬酸(0.11mol/l)和氟化铵(0.15mol/l)均匀溶解在乙二醇/水的混合溶剂(v/v,9/1)中以配制电解液。在电极两端分别施加20v的电压，70℃反应1.0h。反应结束后取出钛片用去离子水清洗干净后用氮气吹干，即得到tio2纳米管。
88.(2)tio2纳米管/丝素蛋白复合膜的制备：
89.将蚕茧壳放入1.5g/l的na2co3的沸水中加热煮沸对其进行脱胶，加热煮沸处理1.0h后用去离子水清洗蚕丝。烘干后的蚕丝溶解在含有6％(wt)cacl2的甲酸中，将溶液倒在培养皿中并置于通风处待其完全干燥。将干燥后的脱胶蚕丝蛋白膜在循环水中浸泡24h以除去膜内残留的cacl2，烘干后将膜剪碎并溶解于8％(wt)甲酸中。将500μl膜溶液均匀涂覆在上述制备的tio2纳米管表面，并置于通风处自然干燥。待其完全干燥后，将膜从钛片上缓慢揭下来并固定在hf溶液上面，室温刻蚀5min即得到tio2纳米管/丝素蛋白复合膜。
90.(3)柔性动态生物活性防污界面的制备：
91.将tio2纳米管/丝素蛋白复合膜浸泡在新鲜制备的2mg/ml多巴胺溶液中，用tris-hcl调节溶液ph至8.5，在室温下反应2h。将多巴胺修饰后的tio2纳米管/丝素蛋白复合膜用去离子水清洗干净，然后分别浸泡在含有生物活性仿生肽pba-(peg)
8-x和nh
2-(peg)
8-y的pbs溶液中(ph＝8.5,120μg/ml)，室温孵育过夜。用pbs洗涤后转移到质量分数为1％的bsa溶液中。最后，得到生物活性肽和抗污分子接枝的tio2纳米管/丝素蛋白复合膜，即柔性动态生物活性防污界面(tntm)于4℃储存备用。

技术特征：
1.一种柔性动态生物活性防污界面的制备方法，其特征在于：步骤如下：步骤1、tio2纳米管的制备：采用一步阳极氧化法制备tio2纳米管，其中阳极为高纯钛片，阴极为纯碳棒电极，柠檬酸和氟化铵溶解在乙二醇/水的混合溶剂中为电解液，电源采用直流稳压电源；反应结束后取出钛片用去离子水清洗干净后用氮气吹干，即得到tio2纳米管；步骤2、tio2纳米管/丝素蛋白复合膜的制备：将蚕茧壳放入na2co3水溶液中加热煮沸对其进行脱胶，再用去离子水清洗干净，烘干后的蚕丝溶解在含有cacl2的甲酸a中，将溶液倒在培养皿中并置于通风处待其完全干燥，将干燥后的脱胶蚕丝蛋白膜在循环水中浸泡以除去膜内残留的cacl2，烘干后将膜剪碎并溶解于甲酸b中，将膜溶液均匀涂覆在上述制备的tio2纳米管表面，并置于通风处自然干燥，待其完全干燥后，将膜从钛片上缓慢揭下来并固定在hf溶液上方，室温刻蚀，即得到tio2纳米管/丝素蛋白复合膜；步骤3、柔性动态生物活性防污界面的制备：将tio2纳米管/丝素蛋白复合膜浸泡在新鲜制备的多巴胺溶液中，用tris-hcl调节溶液ph，在室温下反应，之后，用去离子水清洗，并依次浸泡在含有生物活性仿生肽pba-(peg)
8-x和nh
2-s-s-(peg)
8-y的pbs溶液中，室温孵育过夜，用pbs洗涤后，将其转移到bsa水溶液中继续培养，最后，得到生物活性肽和抗污分子同时接枝的tio2纳米管/丝素蛋白复合膜，即柔性动态生物活性防污界面tntm。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1中，所使用的高纯钛片的尺寸为0.1
×
30
×
70mm，钛片在使用前需进行预处理：依次用丙酮、无水乙醇及去离子水超声清洗10min以除去表面杂质并用氮气吹干备用。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1中，电解液中，柠檬酸和氟化铵的浓度分别为0.11mol/l和0.15mol/l，乙二醇和水的体积比为9:1。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1中，电压20v，反应温度为25～70℃，反应1.0h。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2中，na2co3水溶液的浓度为1.5g/l，加热煮沸处理时间为1.0h；蚕丝、cacl2、甲酸a的质量比例为43：3：4；循环水中浸泡时间为24h，膜和甲酸b的质量比为6:94；刻蚀时间为为5min。6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3中，多巴胺溶液的浓度为2mg/ml；ph值为8.5，室温下反应2h。7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3中，pba-(peg)
8-x浓度为80～120μg/ml，x的氨基酸序列为w-(d-nle)-eaayqrfl(remark:r is d-arg)。8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3中，nh
2-(peg)
8-y浓度为80～120μg/ml，y的氨基酸序列为grqlfdnpdqalldtandg。9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3中，bsa质量分数为1％，样品于4℃
保存。10.将权利要求1～9任一项所述方法制备的柔性动态生物活性防污界面用于非诊断和治疗为目的的，选择性分离循环肿瘤细胞的应用。

技术总结
本发明公开了一种柔性动态生物活性防污界面的制备方法及分离异质性循环肿瘤细胞的应用。步骤为：(1)TiO2纳米管的制备；(2)TiO2纳米管/丝素蛋白复合膜的制备；(3)柔性动态生物活性防污界面的制备。本发明通过构建一种柔性基底材料并对表面进行修饰以接枝两段生物活性肽，制备出一种能够特异性捕获异质性肿瘤细胞并实现细胞可控释放的新型柔性动态生物界面，在一定程度上解决了由于基底材料刚性问题造成的细胞损伤以及肿瘤细胞异质性带来的特异性捕获效率低等问题。同时，得益于生物活性肽上、非生物活性PEG防污链以及牛血清白蛋白的共同作用，界面可有效地抑制血液蛋白和细胞的非特异性粘附。的非特异性粘附。的非特异性粘附。


技术研发人员：白蒙起 刘磊 王增凯
受保护的技术使用者：江苏大学
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/10/15