一种长期培养、鉴定人睾丸管周细胞的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体地说，是关于一种长期培养、鉴定人睾丸管周细胞的方法。


背景技术：

2.管周细胞(peritubular cell pc)是分布在生精上皮基膜外围绕曲细精管呈环形排列的一到多层肌样细胞，有伸缩和分泌功能。细胞扁平呈星形或长形，核椭圆，轮廓平滑，随物种不同，有些动物如啮齿类的排列成单层上皮状，人的则伸出多个细长突起，相邻管周细胞的突起形成连接复合体，胞质有微丝束和细丝，两者都是肌动蛋白或类肌动蛋白样物质。
3.管周细胞存在于所有哺乳动物的睾丸中，但不同种属动物的管周细胞排列与数量会有差别。管周细胞的发育依赖于雄激素作用间质细胞合成雄激素过程被阻断或抗雄激素抗体的出现都能抑制管周细胞的发育。单独雄激素不能促使管周细胞分化，它需要同时有促性腺激素作用于支持细胞以间接地刺激管周细胞分化。管周细胞分泌旁分泌因子等调节支持细胞功能，促进支持细胞合成雄激素合成蛋白和转铁蛋白。管周细胞、间质细胞和支持细胞相互之间密切联系，协调促进精子发生和睾丸雄激素合成；管周细胞在曲细精管中起收缩作用，参与调控睾丸精子、睾丸液的输出；管周细胞间的缝隙连接为低电阻区，与细胞收缩波扩散有关。
4.早期管周细胞的体外培养都取材于实验动物，人类管周细胞的培养很少，仅能通过睾丸组织贴壁培养法分离管周细胞，培养时间短且没有长期培养后鉴定管周细胞功能。cigorraga等从2位青春前期睾丸女性化综合征患者的睾丸曲细精管碎片中分离和培养得到了管周细胞，首次体外培养了人类管周细胞。至2006年，德国albrecht等首次报道成人管周细胞系(htpcs)，该细胞系取材于睾丸活检患者的睾丸组织以o-sma为标记进行分离，为了解管周纤维化、睾丸肥大细胞和管周细胞的作用机制提供了一种可行方法。
5.目前关于本发明一种长期培养、鉴定人睾丸管周细胞的方法尚未有过报道。


技术实现要素：

6.本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种长期培养、鉴定人睾丸管周细胞的方法。
7.本发明的第二个目的是，提供一种长期培养、鉴定人睾丸管周细胞的方法的用途。
8.为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
9.一种长期培养、鉴定人睾丸管周细胞的方法，包括以下步骤：
10.a)取样：在df-12培养液中，机械地切割睾丸，从睾丸组织中分离出细胞，用2毫克/毫升的iv型胶原酶在37℃下缓慢摇动；
11.b)过滤：用40μm的过滤器过滤悬浮液，离心三分钟，然后去除上清液；
12.c)培养：将沉淀物重新悬浮在含有10％胎牛血清的dmem/f-12中，管周细胞附着在
培养皿中，培养7天；
13.d)酶解：培养的细胞用胰蛋白酶进行酶解，离心3分钟，去除上清液；
14.e)孵育：用磷酸盐缓冲盐水冲洗两次，然后用抗体孵育60分钟，离心3分钟并重新悬浮；然后将细胞悬液在黑暗中孵育抗体60分钟；
15.f)传代培养：通过流式细胞仪富集ngfr+/itga9-和ngfr-/itga9+细胞，然后在培养基中培养；细胞在37℃和5％的二氧化碳条件下培养，每2天更换一次培养基。
16.作为一个优选例，所述步骤a)中摇动条件为100次/分钟、15分钟。
17.作为一个优选例，所述步骤b)、d)、e)中离心力为300
×
g。
18.作为一个优选例，所述步骤d)中胰蛋白酶的浓度为0.25％。
19.作为一个优选例，所述步骤e)中的磷酸盐缓冲盐水不含ca
2+
/mg
2+
。
20.作为一个优选例，所述步骤e)中的抗体分别为抗ngfr和抗itga9抗体、抗兔和抗山羊抗体。
21.作为一个优选例，所述步骤f)中扩展培养基由dmem/f12与10％fbs、1％glutamax(gibco)组成。
22.为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
23.上述方法在制备管周细胞分离及长期培养模型中的应用。
24.本发明优点在于：
25.(1)本发明使用人睾丸组织分离管周细胞并进行稳定长期培养，为睾丸生精微环境及精子发生调控研究提供体外细胞模型。
26.(2)本发明使用人睾丸组织管周细胞功能进行鉴定，发现其成球成管功能，为体外类睾丸研究及体外生精微环境重构提供细胞模型。
27.(3)本发明建立的管周细胞分离及长期培养模型，具有分离方便，培养周期短，造模时间短，功能稳定等优点。
附图说明
28.附图1为培养后光镜下显示其特征性细胞形态图；
29.附图2为体外鉴定管周细胞图(a：管周细胞表达sma、cnn1，并且对lc(nes、hsd3b、star)和sc(sox9)的标记物呈阴性；b：pcr显示管周细胞表达ptm特异性基因acta2、dcn和gdnf，但不表达lc特异性基因；c：在分离管周的细胞中可以发现肌纤维结构)；
30.附图3为长期培养管周细胞后，未见管周细胞形态明显变化图；
31.附图4为长期培养管周细胞后，未见管周细胞成球成管及分泌功能明显变化图。
具体实施方式
32.下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
33.实施例1 人睾丸管周细胞传代培养
34.1.实验材料
35.睾丸组织(上海市第一人民医院手术病人)、2毫克/毫升的iv型胶原酶(gibco，17104-019)、40μm过滤器(beyogold，fstr040)、10％胎牛血清的dmem/f-12(gibco，11320-033)、培养皿(falcon)、胰蛋白酶(gibco)、磷酸盐缓冲盐水、抗ngfr(abcam ab8874)和抗itga9抗体(r&d af3827)、10％fbs(sigma,12103c)、1％glutamax(gibco,35050061)。
36.2.实验步骤
37.a)取样：在df-12培养液中，机械地切割睾丸，从睾丸组织中分离出细胞，用2毫克/毫升的iv型胶原酶在37℃下缓慢摇动，100次/分钟，15分钟；
38.b)过滤：用40μm的过滤器过滤悬浮液，300g下离心3分钟，然后去除上清液；
39.c)培养：将沉淀物重新悬浮在含有10％胎牛血清的dmem/f-12中，管周细胞附着在培养皿中，培养7天；
40.d)酶解：培养的细胞用0.25％胰蛋白酶进行酶解，300g下离心3分钟，去除上清液；
41.e)孵育：用不含ca2+/mg2+的磷酸盐缓冲盐水，然后抗ngfr和抗itga9抗体孵育60分钟，300g下离心3分钟并重新悬浮；然后将细胞悬液在黑暗中孵育抗兔和抗山羊抗体60分钟；
42.f)传代培养：通过流式细胞仪富集ngfr+/itga9-和ngfr-/itga9+细胞，然后在10％fbs、1％glutamax(gibco)组成的扩展培养基中培养；细胞在37℃和5％的二氧化碳条件下培养，每2天更换一次培养基。
43.实施例2 人睾丸管周细胞功能的鉴定
44.1.鉴定
45.管周细胞通过管周细胞特异免疫荧光染色cnn1，sma进行鉴定。
46.2.鉴定结果
47.2.1传代培养观察
48.运用流式分选分离管周细胞，df12+10％fbs培养后光镜下显示其特殊环形形态(白色箭头)(图1)。
49.2.2体外鉴定管周细胞
50.分离后培养管周细胞，进行免疫荧光鉴定显示其表达管周细胞特异蛋白标记物，高倍光镜下显示管周细胞胞内可见肌纤维结构，同时管周细胞培养上清检测显示其分泌管周细胞特异因子(图2)。
51.2.3形态观察
52.长期培养管周细胞后，未见管周细胞形态明显变化(图3)。
53.2.4成球成管功能观察
54.长期培养管周细胞后，未见管周细胞成球成管及分泌功能明显变化(图4)。
55.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种长期培养、鉴定人睾丸管周细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：a)取样：在df-12培养液中，机械地切割睾丸，从睾丸组织中分离出细胞，用2毫克/毫升的iv型胶原酶在37℃下缓慢摇动；b)过滤：用40μm的过滤器过滤悬浮液，离心三分钟，然后去除上清液；c)培养：将沉淀物重新悬浮在含有10％胎牛血清的dmem/f-12中，管周细胞附着在培养皿中，培养7天；d)酶解：培养的细胞用胰蛋白酶进行酶解，离心3分钟，去除上清液；e)孵育：用磷酸盐缓冲盐水冲洗两次，然后用抗体孵育60分钟，离心3分钟并重新悬浮；然后将细胞悬液在黑暗中孵育抗体60分钟；f)传代培养：通过流式细胞仪富集ngfr+/itga9-和ngfr-/itga9+细胞，然后在培养基中培养；细胞在37℃和5％的二氧化碳条件下培养，每2天更换一次培养基。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a)中摇动条件为100次/分钟、15分钟。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b)、d)、e)中离心力为300
×
g。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d)中胰蛋白酶的浓度为0.25％。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤e)中的磷酸盐缓冲盐水不含ca
2+
/mg
2+
。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤e)中的抗体分别为抗ngfr和抗itga9抗体、抗兔和抗山羊抗体。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤f)中扩展培养基由dmem/f12与10％fbs、1％glutamax(gibco)组成。8.根据权利要求1-7所述的方法在制备管周细胞分离及长期培养模型中的应用。

技术总结
本发明涉及一种长期培养、鉴定人睾丸管周细胞的方法。通过体外传代培养管周细胞，培养后显示其特殊环形形态；通过管周细胞特异免疫荧光染色CNN1，SMA进行鉴定，可见成球成管功能未见显著变化。从而该方案可用于研究睾丸体细胞功能建立体外模型，并为睾丸管周细胞研究提供理论依据和前期基础。供理论依据和前期基础。供理论依据和前期基础。


技术研发人员：韩厦 李朋 李铮 赵亮宇 罗嘉强 徐帅 姚晨成
受保护的技术使用者：上海市第一人民医院
技术研发日：2023.06.14
技术公布日：2023/9/23