一种长期培养、鉴定人成体睾丸间质细胞的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体地说，是关于一种长期培养、鉴定人成体睾丸间质细胞的方法。


背景技术：

2.睾丸间质细胞(leydig cell)分布于睾丸生精小管之间的疏松结缔组织中，占所有睾丸组织内细胞数量的2％～4％，其主要功能是合成和分泌睾酮，其分泌的睾酮占血浆睾酮总量的95％。目前人成体睾丸间质细胞无分离后长期培养技术报道，且无长期培养后间质细胞功能及是否衰老的报道。对于鼠睾丸间质细胞有长期培养衰老研究，但尚未在人睾丸间质细胞中验证。
3.中华男科学杂志，2005，(05)，356-358，公开了“成人睾丸间质细胞的培养和鉴定”、利用4个梯度(60％、34％、26％、21％)的percoll液分离、纯化成人睾丸间质细胞。对分离的细胞进行细胞学观察、锥虫蓝染色、3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hsd)染色、分泌睾酮能力和绒毛膜促性腺激素(hcg)对分离睾丸间质细胞的作用等检测。结果：通过该方法能够获得高纯度(》90％)的成人睾丸间质细胞,并通过上述实验检测证实分离、纯化的睾丸间质细胞有良好的分泌睾酮能力。
4.鉴于睾丸间质细胞所具有的重要作用，建立一种长期培养、鉴定人成体睾丸间质细胞的方法，对于进一步开展睾丸间质细胞相关功能的研究具有重要意义。目前关于本发明一种长期培养、鉴定人成体睾丸间质细胞的方法尚未有过报道。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种长期培养、鉴定人成体睾丸间质细胞的方法。
6.本发明的第二个目的是，提供一种长期培养、鉴定人成体睾丸间质细胞的方法的用途。
7.为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
8.一种长期培养、鉴定人成体睾丸间质细胞的方法，包括以下步骤：
9.a)取样：在df-12培养液中，机械地切割睾丸，从睾丸组织中分离出细胞，用2毫克/毫升的iv型胶原酶在37℃下缓慢摇动；
10.b)过滤：用40μm的过滤器过滤悬浮液，离心三分钟，然后去除上清液；
11.c)培养：将沉淀物重新悬浮在含有10％胎牛血清的dmem/f-12中，间质细胞附着在培养皿中，培养7天；
12.d)酶解：培养的细胞用胰蛋白酶进行酶解，离心3分钟，去除上清液；
13.e)孵育：用磷酸盐缓冲盐水冲洗两次，然后用抗体孵育60分钟，离心3分钟并重新悬浮；然后将细胞悬液在黑暗中孵育抗体60分钟；
14.f)传代培养：通过流式细胞仪富集ngfr+/itga9-和ngfr-/itga9+细胞，然后在培
养基中培养；细胞在37℃和5％的二氧化碳条件下培养，每2天更换一次培养基。
15.作为一个优选例，所述步骤a)中摇动条件为100次/分钟、15分钟。
16.作为一个优选例，所述步骤b)、d)、e)中离心力为300
×
g。
17.作为一个优选例，所述步骤d)中胰蛋白酶的浓度为0.25％。
18.作为一个优选例，所述步骤e)中的磷酸盐缓冲盐水不含ca
2+
/mg
2+
。
19.作为一个优选例，所述步骤e)中的抗体分别为抗ngfr和抗itga9抗体、抗兔和抗山羊抗体。
20.作为一个优选例，所述步骤f)中扩展培养基由dmem/f12与10％fbs、1％glutamax(gibco)组成。
21.为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
22.上述方法在制备间质细胞分离及长期培养模型中的应用。
23.本发明优点在于：
24.(1)本发明使用人睾丸组织分离间质细胞并进行稳定长期培养，为睾丸生精微环境及精子发生调控研究提供体外细胞模型。
25.(2)本发明使用人睾丸组织间质细胞功能进行鉴定，发现其具有雄激素分泌功能，为体外睾丸衰老研究及体外生精微环境重构提供细胞模型。
26.(3)本发明建立的间质细胞分离及长期培养模型，具有分离方便，培养周期短，造模时间短，功能稳定等优点。
附图说明
27.附图1为培养后光镜下显示其特征性细胞形态图；
28.附图2为体外鉴定间质细胞图(a：间质细胞表达hsd3b、star，并且对管周细胞(cap1,sma)和sc(sox9)的标记物呈阴性；b：光镜显示间质细胞内可见脂滴形成；c：pcr显示间质细胞表达特异性基因hsd3b，nr5a1，star，tspo，cyp11a，cyp17a但不表达管周细胞特异性基因；d：elisa显示体外培养间质细胞可分泌雄激素，且受lh调控)；
29.附图3为长期培养间质细胞后，未见间质细胞形态明显变化图；
30.附图4为长期培养间质细胞后，未见间质细胞激素分泌功能明显变化图。
具体实施方式
31.下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
32.实施例1 人睾丸管周细胞传代培养
33.1.实验材料
34.睾丸组织(上海市第一人民医院手术病人)、2毫克/毫升的iv型胶原酶(gibco，17104-019)、40μm过滤器(beyogold，fstr040)、10％胎牛血清的dmem/f-12(gibco，11320-033)、培养皿(falcon)、胰蛋白酶(gibco)、磷酸盐缓冲盐水、抗ngfr(abcam ab8874)和抗itga9抗体(r&d af3827)、10％fbs(sigma,12103c)、1％glutamax(gibco,35050061)。
35.2.实验步骤
36.a)取样：在df-12培养液中，机械地切割睾丸，从睾丸组织中分离出细胞，用2毫克/毫升的iv型胶原酶在37℃下缓慢摇动，100次/分钟，15分钟；
37.b)过滤：用40μm的过滤器过滤悬浮液，300g下离心3分钟，然后去除上清液；
38.c)培养：将沉淀物重新悬浮在含有10％胎牛血清的dmem/f-12中，间质细胞附着在培养皿中，培养7天；
39.d)酶解：培养的细胞用0.25％胰蛋白酶进行酶解，300g下离心3分钟，去除上清液；
40.e)孵育：用不含ca2+/mg2+的磷酸盐缓冲盐水，然后抗ngfr和抗itga9抗体孵育60分钟，300g下离心3分钟并重新悬浮；然后将细胞悬液在黑暗中孵育抗兔和抗山羊抗体60分钟；
41.f)传代培养：通过流式细胞仪富集ngfr+/itga9-和ngfr-/itga9+细胞，然后在10％fbs、1％glutamax(gibco)组成的扩展培养基中培养；细胞在37℃和5％的二氧化碳条件下培养，每2天更换一次培养基。
42.实施例2 人睾丸间质细胞功能的鉴定
43.1.鉴定
44.成体间质细胞通过间质细胞特异免疫荧光染色nes，hsd3b，star进行鉴定。
45.2.鉴定结果
46.2.1传代培养观察
47.运用流式分选分离间质细胞，df12+10％fbs培养后光镜下显示其特殊梭型形态(白色箭头)(图1)。
48.2.2体外鉴定间质细胞
49.分离后培养间质细胞，进行免疫荧光鉴定显示其表达间质细胞特异蛋白标记物，高倍光镜下显示间质细胞胞内可见脂滴结构，同时间质细胞培养上清检测显示其分泌雄激素，并受到lh浓度调控(图2)。
50.2.3间质细胞形态观察
51.长期培养间质细胞后，未见间质细胞形态明显变化(图3)。
52.2.4间质细胞激素分泌功能观察
53.长期培养间质细胞后，未见间质细胞激素分泌功能明显变化(图4)。
54.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种长期培养、鉴定人成体睾丸间质细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：a)取样：在df-12培养液中，机械地切割睾丸，从睾丸组织中分离出细胞，用2毫克/毫升的iv型胶原酶在37℃下缓慢摇动；b)过滤：用40μm的过滤器过滤悬浮液，离心三分钟，然后去除上清液；c)培养：将沉淀物重新悬浮在含有10％胎牛血清的dmem/f-12中，间质细胞附着在培养皿中，培养7天；d)酶解：培养的细胞用胰蛋白酶进行酶解，离心3分钟，去除上清液；e)孵育：用磷酸盐缓冲盐水冲洗两次，然后用抗体孵育60分钟，离心3分钟并重新悬浮；然后将细胞悬液在黑暗中孵育抗体60分钟；f)传代培养：通过流式细胞仪富集ngfr+/itga9-和ngfr-/itga9+细胞，然后在培养基中培养；细胞在37℃和5％的二氧化碳条件下培养，每2天更换一次培养基。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a)中摇动条件为100次/分钟、15分钟。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b)、d)、e)中离心力为300
×
g。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d)中胰蛋白酶的浓度为0.25％。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤e)中的磷酸盐缓冲盐水不含ca
2+
/mg
2+
。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤e)中的抗体分别为抗ngfr和抗itga9抗体、抗兔和抗山羊抗体。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤f)中扩展培养基由dmem/f12与10％fbs、1％glutamax(gibco)组成。8.根据权利要求1-7所述的方法在制备间质细胞分离及长期培养模型中的应用。

技术总结
本发明涉及一种长期培养、鉴定人成体睾丸间质细胞的方法。通过体外传代培养间质细胞，培养后显示其特殊梭型形态；成体间质细胞通过特异免疫荧光染色NES，HSD3B，STAR进行鉴定，未见间质细胞激素分泌功能明显变化。从而该方案可用于研究睾丸体细胞功能建立体外模型，并为睾丸间质细胞研究提供理论依据和前期基础。睾丸间质细胞研究提供理论依据和前期基础。睾丸间质细胞研究提供理论依据和前期基础。


技术研发人员：李朋 韩厦 李铮 夏术阶 赵亮宇 姚晨成
受保护的技术使用者：上海市第一人民医院
技术研发日：2023.06.14
技术公布日：2023/9/23