家蚕细胞自噬关键基因BmPAT4及其表达产物和应用

家蚕细胞自噬关键基因bmpat4及其表达产物和应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学领域，涉及一种新的功能基因，尤其涉及家蚕细胞自噬关键基因bmpat4及其表达产物和应用。


背景技术：

2.由单链dna病毒(bombyx mori densonucleosis virus,bmdnv)、dsrna病毒(bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,bmcpv)和家蚕核型多角体病毒(bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,bmnpv)等家蚕病毒引起的损失占了蚕茧损失的80％左右，特别是由bmnpv感染引起的家蚕血液型浓病造成的经济损失占据蚕病总损失的六成以上。目前对家蚕抵御bmnpv的研究，主要是通过过表达和rna干扰(rnai)这两种基因调控策略，寻找家蚕自身的抗病毒基因增强自身免疫能力。
3.bmnpv是一种隶属于杆状病毒，以家蚕为唯一宿主的圆形双链dna病毒。该病毒具有强传染性与高爆发性。家蚕属于鳞翅目昆虫模式生物，不同于哺乳动物具有获得性免疫，在抵御外源病毒入侵时只能依靠自身先天免疫系统来进行防御保护自己免受侵害。因此，寻找家蚕自身的免疫蛋白也一直是研究家蚕抵抗bmnpv侵染的主要研究方向。其中运用rnai和转基因技术在细胞水平上过表达或敲降具有抗病毒的内源性免疫蛋白基因是比较常规的方法。昆虫中存在三种rnai途径，其中“小干扰rna”(sirna)途径是主要的抗病毒防御机制。在昆虫遭受病毒入侵时，宿主最强烈的反应就是通过rnai途径利用病毒产生双链rna产生sirna，从而到达对病毒降解，抑制病毒复制、增殖。
4.(mechanistic target of rapamycin,mtor1)是中心细胞生长调节器，能感知多种细胞信号，例如营养物质、生长因子、激素以及能量状态，可通过调控下游因子核糖体靶蛋白s6k(ribosomal s6 kinase 1,s6k)和真核翻译起始因子4e结合蛋白(eukaryotic translation initiation factor 4e-binding protein 1,4e-bp1)磷酸化参与蛋白质翻译，从而参与细胞生长和增殖。同时，mtor1可通过调控下游因子蛋白激酶复合体(ulk1)的磷酸化以及ulk1与ampk的相互作用来影响细胞自噬。细胞自噬是一种保守的自我降解系统，可将细胞的分解代谢过程与合成代谢过程联系起来，将细胞内错误折叠或突变的蛋白、衰老或破损的细胞器等不需要的物质降解，并为细胞重新提供能量促进生长。自噬在生理和病理生命过程中调节细胞的动态平衡。自噬功能的缺陷对健康与疾病均有严重影响，包括心肌病、细胞器和蛋白质的清除、细胞的衰老与死亡、感染性疾病癌症等。
5.pat家族属于溶质载体(solute carrier,slc)转运蛋白超家族。该家族成员均介导氨基酸及其衍生物的跨膜运动。已有研究证明，pat家族中除了pat3成员外均可激活mtorc1。在人结肠癌细胞(hct116)中，pat4可以调节耐雷帕霉素的mtorc1，同时可优先结合mtorc1下游因子4e-bp1，降低其磷酸化水平，从而影响癌症患者的术后复发。但是，pat4基因在家蚕中尚未见任何报道，是否参与家蚕抵御bmnpv的感染尚不明确。
6.自噬作为真核细胞中重要的降解系统，既能降解细胞内不需要的物质如损害的蛋白质和细胞器，又能为细胞的生存产生新的能量与模板。自噬在细胞的生命过程中起着关
键作用，除了物质的清除，在适应代谢应激、分化和发育过程中的更新和防止基因组损伤等过程也有着重要功能，在预防感染、癌症、衰老等生理过程中起着非常重要的作用。同时在细菌与病毒感染中，自噬也发挥着类似于保护的功能，例如单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type1,hsv-1)的感染会触发自噬以达到病毒降解的目的；在甲型流感病毒(influenza a virus,iav)感染中，自噬可以通过其降解功能降解iav颗粒而激活宿主先天性或获得性免疫，从而达到清除病毒的作用。然而，越来越多的研究证明，某些病毒需要自噬细胞去识别，甚至可以操作劫持和利用自噬途径来促进病毒的感染，为病毒的存活提供能量。在蚕丝线虫感染中，寄生虫生存的能量和营养的来源之一可能就是其诱导的自噬产生；在脊髓灰质炎病毒和鼻病毒感染中，病毒会篡夺自噬体机制来进行病毒合成；在家蚕的病毒感染中，bmnpv的感染会诱导细胞生成自噬小体触发自噬，从而促进病毒的复制。在iav感染中，虽然病毒诱导自噬激活了宿主的免疫系统，但是病毒也会反过来劫持自噬，通过阻止自噬成熟并进一步干扰宿主抗病毒信号来促进病毒复制，从而增加后代病毒的产生，加强病毒感染，而通过小干扰rna(sirna)或者利用药物破坏自噬后发现减少了病毒后代的产生。这些研究都表明，在病毒感染过程中，细胞自噬起着显著的作用可能改变病毒生命周期影响宿主对病毒感染。


技术实现要素：

7.解决的技术问题：为了探究家蚕抵御bmnpv新的功能基因，并对该基因的功能做全面验证，本发明提供了家蚕细胞自噬关键基因bmpat4及其表达产物和应用。
8.技术方案：家蚕细胞自噬关键基因bmpat4，所述基因编码的氨基酸序列为seq id no:1，具体为：
9.mvnepngaipapqeletfispdeknkekivskynmtkdaesgdfdpfterkldtptsnmdtlthllkaslgtgilampkafkaaglingilftvivavvcthcsyilvkcahvlykktkktqmsfaevgeaaldngpqplrkwanafrifivislfityfgtcsvytviiarnilqiiqfycgdiinerfliiillvplilmawirnlkylapvsmianlfmavglgitlyylvgtgqlqydkikdmlfkhpsewpeffsltifameaigvvmplensmktpramlgicgvlnkgmsgvtlvyillgflgylrfgeevqdsitlslgdaipaqivklsiaiavyctfglqffvcidimwngikdkftkrpeladyimrtimvtvcvsiaaavpqisplmgvigafcfsilgliapamievitywepgvgpgkyliwknilvvifgtfslvfgtkdailailkdf。
10.优选的，所述基因的核苷酸序列为seq id no:2，具体为：
11.atggtgaacgaaccaaatggcgccattccagcgccacaggagttggaaacatttatatctccggatgaaaagaacaaagaaaagattgttagcaaatataacatgacgaaagatgcggagtcaggagactttgatccgttcaccgaaaggaagttggacactcctacttcgaatatggacactctaacacacttattgaaggcttccctgggtactggaatcttagccatgcccaaagccttcaaggcagccggattgatcaatggaatactcttcacggttatcgtggccgtcgtctgcactcactgctcgtatatacttgttaaatgtgcccacgttttgtacaagaagacgaaaaaaactcagatgtcctttgcggaagtgggcgaggcggctttggataacggtccacagccgttaagaaaatgggcgaatgctttcaggatattcatcgtcattagtctctttataacgtactttgggacgtgctccgtctatacggtcataatagcacgaaacattttacagataattcagttctactgcggcgatattatcaatgaacgttttctcattataatattactggtcccacttattctcatggcctggattcgaaatctcaagtacttagctcctgtgtcaatgatcgcgaatttattcatggctgtgggtctagggatcaccctttactacttagtaggtactggacaactgcaatacgataagatcaaggacatgctcttcaaaca
tcccagcgaatggcccgaattcttttcgctcacaattttcgcaatggaagccatcggagttgtgatgcctctcgaaaactcaatgaagacccctcgtgcgatgctcggtatctgcggtgtattgaacaaaggcatgtccggtgttacactagtctacattcttcttggcttcctcggctacctgcggttcggagaagaagtccaagattccatcactcttagtttaggggacgcgatccctgctcaaatagtaaaactgtctatagccattgcagtatactgcacttttggcctgcagttcttcgtgtgcattgatattatgtggaacggtattaaggataaattcacgaaacgaccggagctcgccgattacatcatgagaacgattatggtcacggtgtgcgtgtcgattgccgcggccgttccccagattagtcctttgatgggagtcattggcgcattctgtttctccatcctcggtcttatcgcaccagcaatgattgaagtcattacgtattgggaaccgggagtcggcccaggaaagtatttgatctggaaaaacattctagtggttatttttggtacattctccttagtttttggtactaaagacgccatacttgcaattttaaaagacttctaa。
12.优选的，所述基因全长cdna序列克隆的特异性引物为：bmpat4-f，序列为seq id no:7；bmpat4-r，序列为seq id no:8。
13.优选的，所述基因荧光定量pcr引物为：qbmpat4-f，序列为seq id no:3；qbmpat4-r，序列为seq id no:4。
14.优选的，抑制bmpat4基因过表达的sirna为：sirna-bmpat4-430-s，序列为seq id no:11；sirna-bmpat4-430-as，序列为seq id no:12。
15.由以上所述氨基酸序列编码的表达产物。
16.优选的，所述表达产物为含有10个跨膜结构域的蛋白质，且没有信号肽。
17.优选的，所述表达产物存在于细胞质或细胞膜上。
18.以上所述的家蚕细胞自噬关键基因bmpat4在调控家蚕细胞内bmnpv复制或增殖中的应用。
19.优选的，bmpat4基因通过自噬参与家蚕对bmnpv的抵抗。
20.有益效果：(1)所述bmpat4基因过表达后，家蚕细胞中的bmnpv病毒dna复制减少，且与细胞自噬相关的基因的转录水平也明显降低，而在细胞中干扰bmpat4，其病毒复制增多；(2)所述bmpat4基因的表达产物可能作为一个免疫蛋白参与家蚕对bmnpv病毒的抵抗，且通过细胞自噬信号通路参与家蚕对bmnpv病毒的抵抗。
附图说明
21.图1为bmpat4的跨膜结构域分析图。
22.图2为bmpat4信号肽分析结果图。
23.图3为bmpat4进化分析。
24.图4为家蚕受bmnpv感染后各组织中bmpat4的转录水平检测结果；其中，a：bmpat4在家蚕中肠、血淋巴等十一个组织的转录水平；b：1-5d血淋巴中bmpat4检测；c：1-5中肠组织中bmpat4检测；d：1-5脂肪体组织中bmpat4检测，“*”表示差异显著。
25.图5为bmpat4在bmn中的亚细胞定位图；从左到右依次为：用带有绿色荧光标记的山羊抗小鼠二抗标记bmpat4；用dapi对细胞核进行蓝色染色；bmpat4定位分析。
26.图6为过表达bmpat4抑制了bmnpv在bmn中的增殖、复制；其中，a：分别转染pizt/v5-his-mcherry空载与pizt/v5-his-mcherry-bmpat4重组载体的bmn中bmpat4的转录水平。b：过表达bmpat4与对照处理bmn中bmnpv的相对表达水平。c：转染pizt/v5-his-mcherry后bmn中各时间点荧光图。d:转染pizt/v5-his-mcherry-bmpat4的bmn细胞各时间点荧光
图。e:过表达bmpat4与对照处理后bmn中bmnpv结构蛋白vp39的表达水平。
27.图7为bmpat4的干扰促进了bmnpv在细胞中的增殖与复制；其中，a:转染sirna-bmpat4-430和sirna-egfp-nc的家蚕细胞中bmpat4的转录水平。b：转染sirna-bmpat4-430和sirna-egfp-nc的家蚕细胞中bmnpv的相对表达水平。c：转染sirna-egfp-nc的bmn细胞各时间点荧光图。d:转染sirna-bmpat4-430后的bmn细胞各时间点荧光图。e:干扰bmpat4后bmn中bmnpv结构蛋白vp39的表达水平。
28.图8为bmpat4过表达降低细胞自噬；其中，a：过表达bmpat4后家蚕细胞中bmatg5的转录水平；b：过表达bmpat4后家蚕细胞中自噬基因bmatg8的转录水平；c：转过表达bmpat4后家蚕细胞中自噬基因bmatg9的转录水平；d：过表达bmpat4后家蚕细胞中自噬基因bmatg13的转录水平；e：过表达bmpat4与对照处理的细胞中家蚕细胞中细胞自噬蛋白atg8与atg8-pe的表达水平。
具体实施方式
29.以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
30.实施例1
31.1、材料与方法
32.1.1家蚕品种与细胞、病毒
33.本实验使用的家蚕品系p50由江苏科技大学蚕业研究所提供。其幼虫在恒温25℃、恒湿75％的培养箱中，以12h光照/12h黑暗的条件饲养。实验组桑叶以108ml-1
浓度的多角体病毒均匀涂抹，对照组以蒸馏水处理，家蚕经口添食病毒24h后，更换新鲜桑叶继续饲养。家蚕卵巢细胞系(bmn)由中国农业科学院研究所保存，在添加10％胎牛血清、1％100ug/ml青霉素和100μg/ml链霉素的tc-100培养基(北京利维宁生物科技有限公司，北京，中国)中恒温28℃培养。感染细胞的bmnpv-egfp重组病毒由本实验室构建保存。
34.1.2载体构建与sirna
35.随机取5龄1-5天的p50家蚕在冰上解剖获得中肠、马氏管、血淋巴、脂肪体等11个组织。以trizol试剂(生工生物工程(上海)股份有限公司，上海，中国)裂解家蚕组织得到总rna，并利用逆转录酶(天根生化科技有限公司，北京，中国)得到cdna。以正向引物bmpat4-f(seq id no:7)、反向引物bmpat4-r(seq id no:8)，具体序列信息如表1所示，并在引物两端分别加上kpn i(takara，大连，北京，中国)和ecor v(takara，大连，北京，中国)两个酶切位点及保护碱基在中肠cdna中获得bmpat4。测序验证后，将bmpat4通过t4 dna连接酶((takara，大连，北京，中国))连接在昆虫表达载体pizt/v5-his-mcherry(invitrogen)中相应的酶切位点，最终获得pizt/v5-his-mcherry-bmpat4过表达载体。在网站tmhmm和signalp分别分析bmpat4的跨膜结构域与信号肽。干扰bmpat4表达的sirna提供至苏州吉玛基因股份有限公司合成(苏州吉玛基因股份有限公司合成，苏州，中国)。
36.表1引物序列使用表
[0037][0038]
1.3细胞转染与病毒感染
[0039]
将bmn均匀铺满细胞培养板继续培养，待细胞稳定贴壁且密度约60％时，参照dna转染试剂entranstertm-h4000(engreen biosystem，北京，中国)与rna转染试剂(苏州吉玛基因股份有限公司合成，苏州，中国)分别将重组质粒与sirna转入细胞。转染4h后，更换细胞培养液继续培养。细胞转染处理24h后，加入等量的bmnpv-egfp，在荧光倒置显微镜下分别观察分析感染后24、48、72h各组细胞中egfp阳性细胞的量，并收取细胞留作备用。
[0040]
1.4细胞定位
[0041]
将细胞固定在细胞爬片上，并转染带有his标签的pizt/v5-his-mcherry-bmpat4重组载体，以小鼠抗6
×
his一抗(生工生物工程(上海)股份有限公司，上海，中国)与重组质粒上his标签结合，以绿色荧光标记的山羊抗小鼠二抗(上海百赛生物有限公司，上海，中国)去标记过表达的bmpat4，并用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)(生工生物工程(上海)股份有限公司，上海，中国)对细胞核进行染色。在荧光倒置显微油镜下观察细胞。
[0042]
1.5细胞基因组dna获取
[0043]
吸取细胞培养板中的培养基，并加入体积合适的dna提取缓冲液(10mm tris-hcl,100mm edta,100mm nacl,0.5％ sds；ph＝8.0)收集细胞。离心后收集上清并加入等体积苯酚(ph7.7-ph8.1)震荡混匀，再次离心后收集上清并加入24:1比例的氯仿和异丙醇混合液混匀，再次离心收集上清并加入2倍体积的含3m醋酸钠(naac)的无水乙醇进行沉淀与纯化，
最后用rnase水溶解沉淀。
[0044]
1.6实时定量聚合酶链式反应(qpcr)
[0045]
qrt-pcr实验以20μl反应体积、用2
×
sybr premix ex taq
tm
试剂(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，南京，中国)通过lightcycle 96实时荧光定量pcr仪(roche，瑞士)实施。每组样品进行三次实验重复。反应条件为95℃反应10min，然后在95℃反应5s、60℃反应10s和72℃反应10s循环40次。
[0046]
1.7western blot
[0047]
以每1mg/10ul水化液的比例(具体配方如表2所示)处理细胞样品，静置5min后加入1/2体积蛋白loading buffer，煮沸3min用于杂交蛋白验证。将蛋白迁移到pvdf膜上，用5％的脱脂奶粉溶液封闭1h，tbst清洗三次,其中以anti-vp39(兔多抗，1:1500)、bmatg8(兔多抗，1:1000)为一抗4℃过夜孵育，并选用微管蛋白tubllin(1:1000)(上海碧云天生物有限公司，上海，中国)作为内参蛋白，再次tbst清洗三次，以山羊抗兔igg/碱性磷酸酶标记二抗孵育(1:1500，碧云天)常温孵育2h，再次tbst清洗三次，并用igg/碱性磷酸酶显色试剂盒(碧云天，上海，中国)避光显色，拍照留存。
[0048]
表2蛋白水化液配置方法
[0049][0050][0051]
1.8数据分析
[0052]
qrt-pcr数据通过graphpad prism6(graphpad，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)统计分析。并利用软件自带的t检验方法分析实验结果的显著性。当p值《0.05表示差异显著，p值《0.01表示差异非常显著。图示中用“*”表示“p《0.05”，用“**”表示“p值《0.01”。所有结果均表示为三次重复实验结果的平均值。
[0053]
2、结果分析
[0054]
2.1 bmpat4基因克隆与分析
[0055]
为了分析bmpat4序列的特征，我们从p50家蚕中肠组织中克隆了bmpat4序列。结果显示，bmpat4基因编码序列全长为1395bp，可编码464个氨基酸残基。通过tmhmm软件与signalp软件分析bmpat4蛋白的跨膜结构域与信号肽，结果显示bmpat4共有10个跨膜结构域(图1)，但是没有信号肽(图2)。除此之外，将bmpat4蛋白与其他物种中的同源蛋白(表3)进行多重比对分析其同源性，结果显示bmpat4基因相对保守，与草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)和斜纹夜蛾(spodoptera littoralis)相似性最高，相似性为77.68％，其次是亚洲玉米螟和印度蜡螟，而与人的亲缘关系最远(图3)。
[0056]
表3 bmpat4同源蛋白比对表
[0057][0058][0059]
2.2bmpat4在家蚕感染bmnpv的各组织中的表达谱分析
[0060]
为了分析bmpat4的生物学功能，我们用悬浮的多角体病毒(108pibs/ml)溶液均匀涂抹桑叶经口感染p50家蚕后，解剖获得家蚕在5龄1-5天的血淋巴、中肠、头、气管簇、脂肪
体、马氏管、神经索、丝腺、精巢、卵巢以及表皮11个组织，并提取各组织中的总rna获得cdna。通过qrt-pcr技术检测bmpat4在家蚕各组织中表达水平。结果显示，bmpat4在家蚕各组织中均有表达，并且在不同组织中有着不同的表达差异，在家蚕的免疫组织中肠、血淋巴和脂肪体中，bmpat4的转录水平相较于未经bmnpv感染的对照组有着明显的上升趋势(如图4a)。在家蚕的血淋巴组织中，家蚕感染bmnpv后bmpat4的转录水平在24h、48h、96h明显高于未受病毒感染的对照组(如图4b)。同时，在中肠组织中，经口感染bmnpv的家蚕在24h、72h、120h取样时间点的bmpat4的转录水平显著高于未感染bmnpv的对照组，特别是在24h与72h时差异极显著(如图4c)。除此之外，在取样24、48、72h的时间点，bmpat4在添食bmnpv的脂肪组织中转录水平也明显高于对照组(图4d)。
[0061]
2.3bmpat4的亚细胞水平表达分析
[0062]
为了探究bmpat4基因在亚细胞水平上的分布情况，我们构建了带有his标签的pizt/v5-his-mcherry-bmpat4重组质粒，并通过细胞转染将重组载体转入家蚕细胞中，用小鼠抗6xhis一抗与重组质粒上his标签结合，然后用带有绿色荧光标记的山羊抗小鼠二抗去标记过表达的bmpa4，同时使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)使细胞核呈蓝色。结果表明，bmpat4不在细胞核中表达，而是存在于细胞质中与细胞膜上(如图5)。
[0063]
2.4过表达bmpat4抑制了bmnpv的增殖
[0064]
为了确定bmpat4是否参与家蚕抵抗bmnpv的侵染，我们构建了过表达bmpat4的重组质粒pizt/v5-his-mcherry-bmpat4。同时，将对照载体pizt/v5-his-mcherry(control)与过表达bmpat4的重组质粒pizt/v5-his-mcherry-bmpat4(bmpat4)分别转染到家蚕细胞中，qrt-pcr检测发现bmpat4过表达的细胞中bmpat4的转录水平极显著提高(图6a)。在转染48h后，用相同浓度体积的bmnpv-egfp病毒感染两组经转染处理的细胞，并分析在病毒感染24、48、72h后bmn中的感染状态。结果表明，在病毒感染后的24、48、72h，经过表达bmpat4处理后的细胞中egfp阳性细胞相较于control组明显减少(图6c-d)。为了进一步验证bmpat4抑制细胞中bmnpv的复制，我们收集了病毒感染后24、48、72h细胞，并通过qrt-pcr与western blot分别检测家蚕细胞中病毒基因vp39的拷贝数与病毒晚期表达39k蛋白(vp39)的表达水平，结果表明，在过表达bmpat4的细胞中，病毒的复制与增殖显著受到抑制(图6b、e)。
[0065]
2.5bmpat4的干扰促进了bmnpv的增殖
[0066]
以上试验已经证实过表达bmpat4抑制了bmnpv在家蚕细胞中的复制、增殖，增强了bmn对bmnpv的抗性。为了验证bmpat4的干扰是否促进bmnpv的增殖，本技术合成了抑制bmpat4表达的sirna(sirna-bmpat4-430，序列为seq id no:11和12)，通过转染sirna抑制家蚕细胞中bmpat4的表达，探究bmpat4的干扰是否可以促进bmnpv在细胞中的复制与增殖。将作为对照组处理的sirna(sirna-egfp-nc，序列为seq id no:9和10)与干扰bmpat4表达的sirna(sirna-bmpat4-430)分别转入bmn，qrt-pcr结果显示，相比于转染sirna-nc对照组，转染sirna-bmpat4-430实验组细胞中bmpat4的转录水平明显受到抑制(图7a)。参照上述方法，在转染处理48h后向两组细胞中加入等量bmnpv-egfp感染细胞，并在bmnpv感染后24、48、72h观察两组bmn中阳性感染细胞数。结果显示，与对照组相比，在细胞中干扰bmpat4表达后的48h和72h后，细胞中bmnpv感染后的egfp阳性细胞明显更多(图7c-d)。为了进一步验证bmpat4的敲降对bmnpv的复制、增殖的影响，本技术收集了添毒后24h、48h、72h的细胞，
并通过qrt-pcr与western blot分别检测家蚕细胞中病毒基因vp39的拷贝数与病毒晚期表达39k蛋白(vp39)的表达水平，其中，基因vp39的qrt-pcr引物序列为seq id no:5和6。结果表明，在细胞中干扰bmpat4的表达明显促进了细胞中bmnpv的复制与增殖(图7b、e)。
[0067]
2.6bmpat4可能通过自噬参与家蚕对bmnpv的抵抗
[0068]
上述研究已经证实bmpat4在家蚕抵御bmnpv侵染过程中，对bmnpv复制、增殖具有抑制作用。但是，bmpat4具体是通过细胞免疫的哪一条途径参与bmnpv的抵抗尚未可知。在哺乳动物的研究报道中，已知pat4参与mtocr1的调节，mtocr1可通过磷酸化下游因子ulk1复合物使其失活，影响自噬囊膜的形成而调节自噬。在rab12的研究中，pat4的过表达与rab12敲降对自噬有相同的调节作用。自噬是一种高度保守的细胞降解途径，常作为防御机制参与抵御病毒感染。为了验证bmpat4是否通过细胞自噬途径参与家蚕对bmnpv的抵抗，我们通过转染上述合成的bmpat4过表达重组载体和抑制bmpat4表达的sirna在bmn对bmpat4进行过表达和敲降，同时利用qrt-pcr检测bmn中与自噬相关基因的转录水平，并利用western blot技术检测各组细胞中自噬相关蛋白bmatg8的蛋白表达水平，分析bmpat4是否参与调节细胞自噬从而参与家蚕对bmnpv的抵抗。结果显示，在过表达bmpat4的实验组中，这四个基因的转录水平相比于对照组都显著下调(如图8a-d)。其中，四个基因的定量检测引物分别为：bmatg5-f，序列为seq id no:13，bmatg5-r，序列为seq id no:14；bmatg8-f，序列为seq id no:15，bmatg8-r，序列为seq id no:16；bmatg9-f，序列为seq id no:17，bmatg9-r，序列为seq id no:18；bmatg13-f，序列为seq id no:19，bmatg13-r，序列为seq id no:20；内参基因定量检测引物为：gapdh-f，序列为seq id no:21，gapdh-r，序列为seq id no:22。同时，本技术还检测了自噬标志物atg8到atg8-pe的转变过程。结果显示，细胞感染bmnpv后，过表达bmpat4中atg8-pe的表达水平明显低于对照组(如图8e)。
[0069]
综上，对家蚕5龄期经诱导表达检测bmpat4的转录水平，结果发现在感染bmnpv的实验组家蚕的中肠、脂肪与血淋巴组织中，bmpat4的转录水平相比于对照组明显上升。中肠、脂肪体、血淋巴都是家蚕的先天免疫器官。在家蚕中，所有组织器官都和血淋巴或者间质混合液混合的血液组成一个体腔，影响着家蚕的新陈代谢、免疫反应、物质的运输与储存和伤口修复等功能。创伤感染时，病毒首先感染血淋巴组织，然后渗透到其它组织器官，血淋巴细胞可以通过包裹过程消灭病毒。中肠组织不仅是一个消化器官，也是作为抵抗伴随食物摄入的各种致病微生物的关键免疫器官，是抵御病毒经口入侵的第一道屏障，直接暴露于潜在环境污染物的昆虫的中肠往往会导致免疫功能障碍，使宿主容易受到病原体感染。这些结果说明，bmpat4可能作为一个免疫蛋白参与家蚕对bmnpv的抵抗。
[0070]
为了进一步验证bmpat4是否参与家蚕抵御bmnpv的侵染，我们在家蚕细胞中过表达和干扰bmpat4的表达来确定bmpat4在家蚕抵御bmnpv的作用。研究结果表明，过表达bmpat4抑制家蚕细胞中bmnpv的复制与增殖；相反，在细胞中敲降bmpat4后，其病毒复制增多。为了探究bmpat4可能参与的细胞免疫路径，我们在细胞中过表达了bmpat4，并检测了细胞自噬关键基因mrna的表达量以及关键蛋白bmatg8的蛋白表达水平，结果发现，在过表达bmpat4后，细胞中自噬相关基因bmatg5、bmatg8、bmatg9和bmatg13的转录水平都显著下降，同时bmatg8、bmatg8-pe蛋白表达量也有明显的降低。
[0071]
自噬的过程主要包含诱导、物质的识别与选择、囊泡形成与降解等步骤。在自噬的众多基因中，其中有18个自噬蛋白参与自噬体的形成，分别是atg1-10,atg12-14、atg16-18
以及atg29和atg31。atg13既可以同fip200、atg101和ulk1组成ulk1复合物参与自噬囊泡的形成，同时可以与atg9a相互作用。atg9a是自噬核心蛋白中唯一的一个多次跨膜蛋白，是自噬的重要调节因子。同时，自噬的发生还与两个泛素系统有关，分别是atg12-atg5-atg16系统和atg8-pe系统，atg8-pe是atg 8家族蛋白与脂质磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,pe)的共价结合，是自噬小体生长不可或缺的部分，这两个系统调节自噬小体的扩张和完成。atg7是两个泛素系统的中心，在atg12-atg5-atg16系统中，atg7可以激活atg12使其与atg5结合，在atg8-pe系统中也是促进atg8的结合。除此之外，atg7与atg5还可以通过perk信号通路影响自噬、细胞凋亡和er的应激反应。atg7与atg5是诱导自噬的必需因子。而atg9负责pi3k复合物的招募。bmatg5和bmatg6已被鉴定为介导20-羟基蜕皮素和饥饿诱导的自噬后的细胞凋亡。因此，bmpat4可能通过细胞自噬信号通路参与家蚕对bmnpv的抵抗。

技术特征：
1.家蚕细胞自噬关键基因bmpat4，其特征在于，所述基因编码的氨基酸序列为seq id no:1。2.根据权利要求1所述的家蚕细胞自噬关键基因bmpat4，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为seq id no:2。3.根据权利要求2所述的家蚕细胞自噬关键基因bmpat4，其特征在于，所述基因全长cdna序列克隆的特异性引物为：bmpat4-f，序列为seq id no:7；bmpat4-r，序列为seq id no:8。4.根据权利要求2所述的家蚕细胞自噬关键基因bmpat4，其特征在于，所述基因荧光定量pcr引物为：qbmpat4-f，序列为seq id no:3；qbmpat4-r，序列为seq id no:4。5.根据权利要求2所述的家蚕细胞自噬关键基因bmpat4，其特征在于，抑制bmpat4基因过表达的sirna为：sirna-bmpat4-430-s，序列为seq id no:11；sirna-bmpat4-430-as，序列为seq id no:12。6.由权利要求1所述氨基酸序列编码的表达产物。7.根据权利要求6所述的表达产物，其特征在于，所述表达产物为含有10个跨膜结构域的蛋白质，且没有信号肽。8.根据权利要求6所述的表达产物，其特征在于，所述表达产物存在于细胞质和细胞膜上。9.权利要求1所述的家蚕细胞自噬关键基因bmpat4在调控家蚕细胞内bmnpv复制或增殖中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，bmpat4基因通过自噬参与家蚕对bmnpv的抵抗。

技术总结
本发明公开了家蚕细胞自噬关键基因BmPAT4及其表达产物和应用，所述基因包含1395bp核苷酸、共编码464个氨基酸残基。同时BmPAT4并非一个高度保守的基因，与其它物种的同源性不高，该蛋白包含十个跨膜结构域且没有信号肽。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)所述BmPAT4基因过表达后，家蚕细胞中的BmNPV病毒DNA复制减少，且与细胞自噬相关的基因的转录水平也明显降低，而在细胞中干扰BmPAT4，其病毒复制增多；(2)所述BmPAT4基因的表达产物可能作为一个免疫蛋白参与家蚕对BmNPV病毒的抵抗，且通过细胞自噬信号通路参与家蚕对BmNPV病毒的抵抗。与家蚕对BmNPV病毒的抵抗。与家蚕对BmNPV病毒的抵抗。


技术研发人员：夏定国 江丹 赵巧玲 沈东旭 贾开放 王金阳
受保护的技术使用者：江苏科技大学
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/9/23