一种基于理性设计改造的高热稳定性内切型褐藻酸裂解酶突变体及其应用

1.本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种基于理性设计改造的高热稳定性内切型褐藻酸裂解酶突变体及其应用。


背景技术：

2.在食品工业中，褐藻多糖和褐藻寡糖被用作增稠剂、乳化剂、配方助剂和稳定剂，也可以用作组织形成剂、表面活性剂和固化剂。在制药工业中，褐藻多糖及其衍生物可用作悬浮剂和增粘剂、粘合剂和崩解改性剂。褐藻多糖由于分子量大，水溶性差，生物利用度低，迄今为止其应用受到很大限制。而褐藻寡糖因其独特的化学性质和生物活性，在食品、医药、化工等领域具有广泛的应用价值，被认为是一种潜在的功能性产品。与化学和物理方法相比，酶促反应具有许多优点，例如在温和的条件下反应，避免辐射，消耗更少的能量，并产生高产率。因此，酶促反应广泛用于制备褐藻寡糖。
3.褐藻酸裂解酶(alginate lyase)可以通过β消除机制催化1,4-糖苷键发生水解，将褐藻多糖降解为褐藻寡糖。随着褐藻多糖裂解酶潜在价值的逐渐发现，其一些缺点限制了进一步的应用，如天然褐藻多糖裂解酶表达低、纯化困难、酶活性低、稳定性差等，其中酶的热稳定性尤为重要。通常，工业生产过程需要在高温下进行或是在中高温下长时间反应，这就需要酶具有良好的热稳定性。因此，开发具有高热稳定性性能的褐藻酸裂解酶对工业化制备褐藻寡糖十分重要。
4.自然界中的蛋白质主要由20种基本氨基酸组成，有一条或多条长度从几万到上万不等的肽链。蛋白质独特的生化特性在很大程度上取决于其结构。自20世纪50年代以来，求解蛋白质三维结构的研究得到了广泛的关注。但由于实验难度较大，基于蛋白质序列利用计算机算法预测各氨基酸的空间坐标，进而预测其三维结构被广泛关注。一般来说，目前基于氨基酸序列预测蛋白质结构的方法大致可以分为三大类:同源建模、穿线法以及从头预测法。同源建模的主要步骤是找到与目标序列同源且结构已通过实验确定的蛋白作为模板，然后建立目标序列的三维空间模型。同源建模要求两个序列的同源性至少为30％。当然，同源性越高，模型的精度就越高。目前常用的蛋白质同源建模程序有swiss-model、discovery studio、moe、sybyl、modeleller等。2020年，谷歌在cspa14竞赛中引入了alphafold2，实现了大多数蛋白质的预测结构与实际结构之间的偏差小于alphafold2采用尖端的深度学习模型，并借鉴物理学、生物学和相关领域的专业知识，提供端到端的蛋白质结构预测。它具有许多优势，例如高度准确的预测骨架结构、精确预测的侧链结构以及可以预测非常大的蛋白质，蛋白质分子量耐受度较高。即使在没有同源结构信息的情况下，它也可以准确预测长度为2180个氨基酸的蛋白质的结构。
5.酶的分子改造可以通过蛋白质理性设计或者定向进化技术来实现，通过对天然酶进行分子改造,可以为工业生产提供具有更高稳定性、更高活性、更高选择性和更高极端环境耐受性的新酶。定向进化是一种在实验室环境中模拟自然进化的实验方法。这种方法在
基因操作过程中引入突变，使用pcr扩增或dna重排构建突变体文库，随后通过高通量技术筛选有价值的突变体。然而，定向进化策略存在许多缺点，例如耗时、需要大量突变库、有益突变率低、筛选困难和成本高。蛋白质理性设计则需要结合蛋白质的结构信息，分析总结结构和功能之间的关系，以创建具有特定特征的突变体。与定向进化相比，理性设计构建的突变体更少，操作更简单，重复性好。理性设计是蛋白质工程中重要的方法之一，在明确蛋白质相关性质的结构、功能和分子机制的基础上，首先从理论上设计蛋白质分子中特定氨基酸位点的变化，从而获得一些具有特殊性质的突变体。这种研究的难点在于如何找到有效的改造点。
6.最近开发的网络服务器fireprot结合了基于能量和进化的方法来预测稳定的单点突变，并以累加的方式设计多点突变，同时最小化单个突变的潜在拮抗作用。fireprot利用16种工具和三种蛋白质工程策略来设计可靠的蛋白质，用户只需最少的努力，无需生物信息学知识即可计算和分析结果。这种策略已经成功地增强了几种蛋白质的热稳定性，包括卤代烷脱卤酶dhaa、γ-hch脱卤酶lina和丝氨酸蛋白酶sp。
7.蛋白质的热力学稳定性通过折叠自由能(δg)来评估，野生型和其突变体之间的折叠自由能差异指示突变效应。premps通过计算去折叠吉布斯自由能的变化来评估单个突变对蛋白质稳定性的影响。δδg》0的点突变显示对结构的不稳定作用，而δδg《0的突变显示对蛋白质结构的稳定作用；dynamut是一个用户友好的网络服务器，可用于通过对构象进行采样来分析蛋白质动力学，以及评估突变对蛋白质稳定性和动力学的影响。sdm2也是预测突变对蛋白质稳定性影响的服务器，作为一种开创性的基于知识的方法，sdm2被认为是与许多其他方法结合使用的最合适的方法。maestroweb允许预测用户定义突变的稳定性变化，为最大n＝5的最稳定(去稳定)n点突变提供扫描功能，创建突变敏感性图谱并评估潜在的二硫键。
8.在生物学中，保守序列指的是具有高度相似性或同一性的分子序列，这些序列可以是核酸序列(如rna或dna序列)，蛋白质序列，蛋白质结构或糖类中的序列。这些序列高度相似，却来自不同的物种或同一生物体产生的不同分子。很多科学家认为，保守序列的发生突变会导致生命体无法存活或被自然选择所淘汰。因此，对蛋白质氨基酸序列进行保守性分析是十分重要的。


技术实现要素：

9.本发明的目的是针对上述问题，第一方面提供一种基于理性设计改造的高热稳定性内切型褐藻酸裂解酶突变体：所述突变体为褐藻酸裂解酶alyrm6a氨基酸序列的第43位的苏氨酸突变为异亮氨酸，即突变体t43i；或，突变体为褐藻酸裂解酶alyrm6a氨基酸序列的第216位的谷氨酰胺突变为异亮氨酸，即突变体q216i；所述褐藻酸裂解酶alyrm6a的氨基酸序列如seq id no.1所示。
10.本发明第二方面提供了编码上述的高热稳定性内切型褐藻酸裂解酶突变体的基因。
11.本发明第三方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述突变体。
12.本发明第四方面提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌含有上述的表达载体。
13.本发明第五方面提供了上述的突变体的应用，上述突变体在催化褐藻胶发生β消
去反应制备褐藻寡糖中的应用。
14.在上述的应用的技术方案中，上述突变体以褐藻胶polymg、褐藻胶polym、褐藻胶polyg中的一种或几种为底物在催化制备褐藻寡糖中的应用。
15.本发明第六方面提供了一种基于理性设计改造筛选蛋白酶耐热突变体的方法，包括如下步骤：
16.s1、野生型蛋白酶的三维结构建模：打开swiss-model服务器，输入野生型蛋白酶的氨基酸序列，选择以序列相似性最高的蛋白结构为模板进行同源建模，根据swiss-model提供的全球模型质量估计gmqe和定性模型能量分析qmean对模型质量进行评估，gmqe和qmean分数分别是0～1和-4～0的则为可靠的同源三维结构；
17.s2、获得alphafold2预测的结构模型：将野生型蛋白酶的氨基酸序列输入alphafold2，对酶的三维结构进行预测，运行结束后，生成得到相关文件；
18.s3、蛋白质构象合理性评估：对前述步骤s1、s2获得的两种模型使用saves v6.0评分程序对蛋白质构象合理性进行评估，选择模型进行后续实验；
19.s4、通过fireprot服务器自动设计耐热突变体：打开fireprot服务器，输入野生型蛋白酶的结构模型或者氨基酸序列，选择需要突变的肽链，同时排除酶活性中心位点，使用默认参数基于能量和进化的方法自动设计耐热突变体；
20.s5、蛋白质的热力学稳定性预测：将获得的突变体提交至premps,dynamut,maestroweb和sdm2网络服务器进行第一轮筛选，预测野生型和其突变体之间的折叠自由能差异指示突变效应，取所有计算优势结果的交集得到突变点；
21.s6、氨基酸保守性分析：将野生型蛋白酶的结构模型或氨基酸序列提交至consurf服务器，运行，进行第二轮筛选，选择非高度保守的残基进行突变获得突变文库。
22.在上述的方法的技术方案中，所述步骤s5包括如下步骤：
23.a)将野生型蛋白酶的结构模型提交至premps服务器，选择需要突变的肽链，将步骤s4获得的突变点依次输入，当单个突变诱导的自由能变化δδg》0表示对结构的不稳定作用，而δδg《0的突变表示对蛋白质结构的稳定作用，选择δδg《0的突变位点；
24.b)将野生型蛋白酶的结构模型提交至dynamut服务器，选择需要突变的肽链，将步骤s4获得的突变点依次输入，当突变的折叠自由能的变化δδg《0表示突变对结构的不稳定作用，而δδg》0的突变表示对蛋白质结构的稳定作用，选择δδg》0的突变位点。
25.c)将野生型蛋白酶的结构模型提交至maestroweb服务器，选择任务为评估特定突变，选择需要突变的肽链，将步骤s4获得的突变点依次输入，选择独立突变，当δδgpred《0.0表示稳定突变，δδgpred》0.0表示不稳定突变，选择δδgpred《0.0的突变位点。
26.d)将野生型蛋白酶的结构模型提交至sdm2服务器，选择需要突变的肽链，将步骤s4获得的突变点依次输入，当突变的折叠自由能的变化δδg《0表示突变对结构的不稳定作用，而δδg》0的突变表示对蛋白质结构的稳定作用，选择δδg》0的突变位点。
27.在上述方法的技术方案中，所述步骤s6中将野生型蛋白酶的结构模型或氨基酸序列提交至consurf服务器，以默认参数自动运行。
28.在上述方法的技术方案中，所述步骤s4中如果选择alphafold2预测的结构模型，则输入的是步骤s2中获得的pdb文件。
29.本发明的有益效果是：
30.本发明的基于理性设计改造筛选蛋白酶耐热突变体的方法，首先利用swiss-model和alphafold2建立未知蛋白的结构模型，利用fireprot服务器自动设计耐热突变体，经过四个服务器(premps,dynamut,maestroweb和sdm2)第一轮筛选，取所有计算优势结果的交集得到突变点；利用consurf服务器进行氨基酸保守性分析，也就是第二轮筛选，选择非高度保守的残基进行突变，最终获得数量较少的突变体；整个过程在较短的时间就能完成，且对用户要求低，无需任何生化实验现场操作，节约了原料与能耗，降低了实验成本；在较小的突变文库就能获得理想的突变体，大大提高了工作效率。
31.采用本发明方法对褐藻酸裂解酶进行了理性设计改造，然后对得到的突变体库进行热稳定性的验证，最后获得两个高耐热的褐藻酸裂解酶突变体t43i和q216i，通过测定野生型酶与突变体酶的半衰期，得出q216i为最佳突变体；针对t43i和q216i这两个热稳定性显著提高的褐藻酸裂解酶进行活性验证，同时测定酶比活力，最适温度，最适ph以及终产物鉴定，表明突变体没有改变酶的作用机制，筛选出的突变体在工业化制备褐藻寡糖方面具有很好的应用前景。
附图说明
32.图1是褐藻酸裂解酶野生型及突变体热稳定性验证实验结果。
33.图2是褐藻酸裂解酶野生型及突变体的最适反应温度实验结果。
34.图3是褐藻酸裂解酶野生型及突变体的最适反应ph实验结果。
35.图4是褐藻酸裂解酶野生型及突变体的热失活半衰期(t
1/2
)的测定结果。
36.图5是褐藻酸裂解酶野生型及突变体在催化褐藻胶发生β消去反应生成褐藻寡糖的实验检测结果。
具体实施方式
37.下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
38.下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用化学、生物试剂如无特殊说明，均为本领域常规试剂，均可通过商购获得。
39.实施例1.褐藻酸裂解酶alyrm6a热稳定性改造
40.一、野生型褐藻酸裂解酶alyrm6a(wt)的三维结构建模
41.在ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上找到野生型褐藻酸裂解酶alyrm6a(genebankid wp_012843667.1)的氨基酸序列并下载，野生型褐藻酸裂解酶alyrm6a氨基酸序列如seq id no.1所示，打开swiss-model服务器，输入alyrm6a的氨基酸序列，选择以序列相似性最高的蛋白结构为模板进行同源建模。得到的结果如下，获得最高序列相似性为42.05％的来源于g.chathamensis s18k6t褐藻酸裂解酶alygc(pdb id:5gkq)。根据swiss-model提供的全球模型质量估计(gmqe)和定性模型能量分析(qmean)对模型质量进行评估，一个可靠的同源三维结构gmqe和qmean分数应该是0～1和-4～0,而根据swiss-model服务器得到的结构，我们模型的gmqe和qmean值分别为0.58和-1.17，表明通过同源建模的模型是可以采用的。
42.二、获得alphafold2预测的结构模型
43.同时，将野生型褐藻酸裂解酶alyrm6a氨基酸序列输入alphafold2(https://
colab.research.google.com/github/sokrypton/colabfold/blob/main/alphafold2.ipynb)对酶的三维结构进行了预测。运行结束后，会生成一系列文件(pdb文件)，其中ranked_0到4就是alphafold2预测出来的分数最高的五个模型，0是最好的，可信度依次往下。因此，我们选择可信度最高的结构模型。
44.三、蛋白质构象合理性评估
45.对前述步骤一、二获得的两种模型使用savesv6.0(https://saves.mbi.ucla.edu)评分程序对蛋白质构象合理性进行评估，并以拉式图形式呈现。一般来说落在允许区和最大允许区的氨基酸残基占整个蛋白质的比例高于90％的，我们可以认为该模型的构象符合立体化学的规则。在最有利的区域中具有超过90％的残基的模型被认为是高质量的，而可靠的模型应该具有超过80％的残基。评估的结果如下，经过步骤一同源建模的模型有87.0％的残基位于最有利的区域，而经过步骤二alphafold2预测的模型有86.71％的残基位于最有利的区域，两者数值相差不大，但经过alphafold2预测的模型具有信号肽结构以及部分结构域，具有更全面直观的形象。因此，相比较而言，我们选择alphafold2预测的模型以进行后续实验。
46.四、设计耐热突变体
47.打开fireprot服务器(https://loschmidt.chemi.muni.cz/fireprotweb/)，输入野生型褐藻酸裂解酶alyrm6a的结构模型(pdb文件)或者氨基酸序列，选择需要突变的肽链，野生型褐藻酸裂解酶alyrm6a只有一条肽链(a链)，因此选择a链进行突变；使用默认参数(力场突变、b因子分析、共识突变)，同时排除酶活性中心位点，酶活性中心位点为第240位的赖氨酸和第261位的精氨酸，基于能量和进化的方法自动设计耐热突变体。得到的结果如下，基于能量的方法，一共获得10个突变点；基于进化的方法，一共获得24个突变点。
48.五、蛋白质的热力学稳定性预测
49.将获得的突变体提交至premps(https://lilab.jysw.suda.edu.cn/research/premps/),dynamut(http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut/),maestroweb(https://pbwww.services.came.sbg.ac.at/maestro/web),和sdm2(http://structure.bioc.cam.ac.uk/sdm2)网络服务器，预测野生型和其突变体之间的折叠自由能差异指示突变效应，取所有计算优势结果的交集得到突变点。
50.a)将野生型褐藻酸裂解酶alyrm6a的结构模型(pdb文件)提交至premps服务器，选择需要突变的肽链(a链)，将步骤四获得的突变点依次输入，提交获得的结果如下，当单个突变诱导的自由能变化δδg》0表示对结构的不稳定作用，而δδg《0的突变表示对蛋白质结构的稳定作用；因此，我们选择δδg《0的突变位点。
51.b)将野生型褐藻酸裂解酶alyrm6a的结构模型(pdb文件)提交至dynamut服务器，选择需要突变的肽链(a链)，将步骤四获得的突变点依次输入，提交获得的结果如下，当突变的折叠自由能的变化δδg《0表示突变对结构的不稳定作用，而δδg》0的突变表示对蛋白质结构的稳定作用；因此，我们选择δδg》0的突变位点。
52.c)首先将野生型褐藻酸裂解酶alyrm6a的结构模型(pdb文件)上传至maestroweb服务器，选择任务为评估特定突变，选择需要突变的肽链(a链)，将步骤四获得的突变点依次输入，选择独立突变，提交获得的结果如下，当δδgpred《0.0表示稳定突变，δδgpred》0.0表示不稳定突变。因此，我们选择δδgpred《0.0的突变位点。
53.d)将野生型褐藻酸裂解酶alyrm6a的结构模型(pdb文件)提交至sdm2服务器，选择需要突变的肽链(a链)，将步骤四获得的突变点依次输入，提交获得的结果如下，当突变的折叠自由能的变化δδg《0表示突变对结构的不稳定作用，而δδg》0的突变表示对蛋白质结构的稳定作用；因此，我们选择δδg》0的突变位点。
54.综上，经过fireprot服务器首先预测的34个突变点，我们利用四个不同的服务器(premps、dynamut、maestroweb、sdm2)进行一步的筛选，一共获得八个突变点，如表1所示：
55.表1
[0056][0057]
六、氨基酸保守性分析
[0058]
将野生型褐藻酸裂解酶alyrm6a的结构模型(pdb文件)或氨基酸序列提交至consurf服务器(https://consurf.tau.ac.il/)，以默认参数自动运行，该程序在从最易变(蓝绿色)到最保守(褐红色)的梯度上对保守等级进行颜色编码，输出结果，得到多序列比对的结果文件以及不同着色程度的文件，通过多序列比对以及保守性打分分析，结果显示获得的八个突变位点均具有平均保守水平，处于非高度保守残基，表明它们适合后续的实验，得到最终的突变文库。
[0059]
实施例2.野生型褐藻酸裂解酶alyrm6a及其突变体的表达、纯化及酶活性测定、热稳定性验证
[0060]
一、alyrm6a突变体基因合成
[0061]
实施例1中获得的褐藻酸裂解酶alyrm6a突变体的编码基因序列由南京擎科生物科技有限公司通过基因合成完成。
[0062]
二、alyrm6a突变体表达、纯化
[0063]
以野生型褐藻酸裂解酶alyrm6a基因的序列(seq id no.4)为模板，设计引物alyrm6a-f(seq id no.7):5'-atgcgtcctggaatcattatcc-3'及alyrm6a-r(seq id no.8):5'-gggccgagcgatggtaatcagg-3'，通过pcr进行扩增。褐藻酸裂解酶alyrm6a突变体的编码基因序列通过基因合成完成。将野生型褐藻酸裂解酶alyrm6a及其突变体的基因序列与pet21a载体用t4连接酶在16℃下连接过夜，将连接产物转化到感受态细胞dh5α，涂布含100μg/ml氨苄青霉素luria-bertani(lb)平板，挑取阳性菌落，37℃摇床过夜培养后提取质粒，再转入大肠杆菌bl21(de3)细胞，得到野生型和点突变的重组菌株。
[0064]
重组野生型alyrm6a及其突变体在大肠杆菌bl21(de3)细胞中表达：首先将细胞接种于含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，37℃培养过夜。将过夜培养物转入含100μg/ml
氨苄青霉素的新鲜液体lb培养基中，37℃、200rpm培养。当od600值达到0.8-1.0时，加入终浓度为1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，在16℃下诱导重组酶表达12h。在4000
×
g下离心15min收集菌体。每10g左右湿菌体加入50ml 20mm磷酸钠缓冲液(ph 7.4)溶液重悬菌体得到菌液，每50ml菌液于100ml烧杯中，冰水浴条件下，以300w功率，超声2s，停止2s，破碎30min以裂解菌体细胞。在4℃条件下，使用冷冻离心机11000
×
g离心1h。使用针头和0.22μm微孔滤膜过滤上清液，得到粗蛋白。得到的粗蛋白经histrap亲和柱纯化，用梯度咪唑(50、100、200、300、500mm)洗脱重组蛋白，收集洗脱液，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析各组分。使用10kd超滤管在4℃，4500
×
g条件下离心以浓缩蛋白，用bradford法测定纯化蛋白的最终浓度。
[0065]
三、dns法测定褐藻酸裂解酶酶活
[0066]
褐藻酸裂解酶酶活力测定时的底物制备方法为：称取1.5g海藻酸钠至100ml 20mm的磷酸钠缓冲液(ph 7.0)中，90℃加热搅拌至完全溶解，冷却至室温。
[0067]
酶活力单位(1u)定义为每分钟可释放1μmol还原糖的酶量。
[0068]
酶活的测定方法为：用4μm的纯化酶在200μl含有1.5％(w/v)海藻酸钠的20mm磷酸钠缓冲液(ph 7.0)中在50℃下进行反应10分钟，然后在金属浴中加热5分钟终止反应，离心取上清液。取50μl反应液与100μl 3,5-二硝基水杨酸(dns)试剂混匀，95℃反应5min，以已灭活的酶反应体系作为对照，测定a
540
吸光值，并换算成相应酶活单位。四、褐藻酸裂解酶热稳定性验证
[0069]
1)将野生型酶与突变体酶在30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90℃条件下孵育1h后，在最适反应条件下测定相对酶活性，在8个突变体中获得两个热稳定性提高的突变体，一个为野生型褐藻酸裂解酶alyrm6a氨基酸序列的第43位的苏氨酸突变为异亮氨酸，即突变体t43i，其氨基酸序列如seq id no.2所示，其编码基因序列如seq id no.5所示。另一个为野生型褐藻酸裂解酶alyrm6a氨基酸序列的第216位的谷氨酰胺突变为异亮氨酸，即突变体q216i，其氨基酸序列如seq id no.3所示，其编码基因序列如seq id no.6所示。结果如图1，在55℃时，野生型酶活性开始下降，突变体酶t43i和q216i活性保持不变，较野生型提高约15％。随着温度的升高，野生型的活性急剧下降，在60℃时，野生型的酶活下降了26％左右，但q216i和t43i分别下降了6％和10％。同时，在65℃时，q216i和t43i的酶活分别为90.64％和85.93％，仍然保持85％以上的活性，而野生型则只有66.47％。在70℃时，t43i和q216i的酶活保持在60％左右，而野生型的活性下降到40％左右，失去了至少一半的活性。
[0070]
2)为了比较alyrm6a及其突变体的活性是否发生变化，在最适反应条件下测定了酶的比活力。野生型alyrm6a、t43i和q216i的酶比活分别为89.23
±
1.14u/mg、88.52
±
2.62u/mg和87.00
±
0.84u/mg。从酶的比活性来看，野生型alyrm6a、t43i和q216i具有相似的活性。
[0071]
3)最适反应条件测定
[0072]
最适温度：在ph为7.0(20mm磷酸钠缓冲液)的条件下，分别测定温度为30、40、50、60、70、80、90℃条件下的褐藻酸裂解酶的相对酶活性，图2显示野生型酶alyrm6a与突变体酶t43i和q216i最适温度均为50℃，表明突变不会改变酶的最适温度。
[0073]
最适ph：在温度为50℃的条件下，分别测定ph为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0
条件下的褐藻酸裂解酶的相对酶活性，其中使用了20mm乙酸钠缓冲液(ph4.0,5.0,6.0)、20mm磷酸钠缓冲液(ph 6.0,7.0,8.0)、20mm甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(ph8.0,9.0,10.0)，图3显示野生型酶alyrm6a与突变体酶t43i和q216i最适ph均为7.0，表明突变不会改变酶的最适ph。
[0074]
4)热失活半衰期(t
1/2
)的测定
[0075]
在50℃条件下，分别测定在0、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5h不同时间下的残余酶活性，并确定相应的残余酶活性下降到未处理酶活性的50％的时间为酶的半衰期。使用origin软件分析数据，得到t
1/2
值。图4显示野生型酶alyrm6a与突变体酶t43i和q216i半衰期分别为3.68h,4.29h和4.54h。与野生型酶alyrm6a相比，q216i和t43i突变体的酶活性分别增加了约25％和20％。
[0076]
5)蛋白质二级结构测定
[0077]
将纯化的褐藻酸裂解酶alyrm6a与t43i和q216i突变体酶液稀释至0.4mg/ml，使用圆二色谱仪，在温度为25℃下，波长范围为190-260nm，间隔为1nm，测量在路径长度为1nm的石英试管中进行，并通过去除缓冲液的影响(20mm磷酸钠缓冲液，ph 7.0)，对采集的数据进行校正。测定结果显示，褐藻酸裂解酶alyrm6a与突变体酶t43i和q216i在196nm和216nm处均有β-片状特征峰，表明蛋白质的二级结构没有发生明显变化，突变体的结构仍然完好无损。
[0078]
6)终产物鉴定
[0079]
将野生型酶与突变体酶以1.5％(w/v)海藻酸钠、1.5％(w/v)聚甘露糖醛酸(poly m)和1.5％(w/v)聚古罗糖醛酸(poly g)为底物，在最适反应条件下反应48h。孵育后，金属浴加热至95℃，5min停止反应，10000
×
g离心5min，收集上清液，使用针头和0.22μm微孔滤膜过滤上清液，得到终产物。以未经酶处理的底物溶液为对照。使用高效液相色谱法(hplc)分析反应产物，配备pl aquagel-oh 20尺寸排除柱(7.5
×
300mm)和示差检测器(rid)。色谱柱温度为30℃，流动相为0.02m nah2po4，流速为0.2l/min。图5显示，野生型酶alyrm6a和突变体酶t43i和q216i与海藻酸钠、poly m、poly g反应的最终产物均为二糖(dp2)、三糖(dp3)、四糖(dp4)，表明野生型酶与突变体酶具有相似的海藻酸裂解酶降解特性，突变体没有改变酶的作用机制。

技术特征：
1.一种基于理性设计改造的高热稳定性内切型褐藻酸裂解酶突变体，其特征在于：所述突变体为褐藻酸裂解酶alyrm6a氨基酸序列的第43位的苏氨酸突变为异亮氨酸，即突变体t43i；或，突变体为褐藻酸裂解酶alyrm6a氨基酸序列的第216位的谷氨酰胺突变为异亮氨酸，即突变体q216i；所述褐藻酸裂解酶alyrm6a的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.编码权利要求1所述的高热稳定性内切型褐藻酸裂解酶突变体的基因。3.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体含有权利要求1所述突变体。4.一种基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌含有权利要求3所述的表达载体。5.一种权利要求1所述的突变体的应用，其特征在于：权利要求1所述突变体在催化褐藻胶发生β消去反应制备褐藻寡糖中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：权利要求1所述突变体以褐藻胶polymg、褐藻胶polym、褐藻胶polyg中的一种或几种为底物在催化制备褐藻寡糖中的应用。7.一种基于理性设计改造筛选蛋白酶耐热突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、野生型蛋白酶的三维结构建模：打开swiss-model服务器，输入野生型蛋白酶的氨基酸序列，选择以序列相似性最高的蛋白结构为模板进行同源建模，根据swiss-model提供的全球模型质量估计gmqe和定性模型能量分析qmean对模型质量进行评估，gmqe和qmean分数是0～1和-4～0的则为可靠的同源三维结构；s2、获得alphafold2预测的结构模型：将野生型蛋白酶的氨基酸序列输入alphafold2，对酶的三维结构进行预测，运行结束后，生成得到相关文件；s3、蛋白质构象合理性评估：对前述步骤s1、s2获得的两种模型使用savesv6.0评分程序对蛋白质构象合理性进行评估，选择模型进行后续实验；s4、通过fireprot服务器自动设计耐热突变体：打开fireprot服务器，输入野生型蛋白酶的结构模型或者氨基酸序列，选择需要突变的肽链，同时排除酶活性中心位点，使用默认参数基于能量和进化的方法自动设计耐热突变体；s5、蛋白质的热力学稳定性预测：将获得的突变体提交至premps,dynamut,maestroweb和sdm2网络服务器进行第一轮筛选，预测野生型和其突变体之间的折叠自由能差异指示突变效应，取所有计算优势结果的交集得到突变点；s6、氨基酸保守性分析：将野生型蛋白酶的结构模型或氨基酸序列提交至consurf服务器，运行，进行第二轮筛选，选择非高度保守的残基进行突变获得突变文库。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤s5包括如下步骤：a)将野生型蛋白酶的结构模型提交至premps服务器，选择需要突变的肽链，将步骤s4获得的突变点依次输入，当单个突变诱导的自由能变化δδg>0表示对结构的不稳定作用，而δδg<0的突变表示对蛋白质结构的稳定作用，选择δδg<0的突变位点；b)将野生型蛋白酶的结构模型提交至dynamut服务器，选择需要突变的肽链，将步骤s4获得的突变点依次输入，当突变的折叠自由能的变化δδg<0表示突变对结构的不稳定作用，而δδg>0的突变表示对蛋白质结构的稳定作用，选择δδg>0的突变位点。c)将野生型蛋白酶的结构模型提交至maestroweb服务器，选择任务为评估特定突变，选择需要突变的肽链，将步骤s4获得的突变点依次输入，选择独立突变，当δδgpred<0.0
表示稳定突变，δδgpred>0.0表示不稳定突变，选择δδgpred<0.0的突变位点。d)将野生型蛋白酶的结构模型提交至sdm2服务器，选择需要突变的肽链，将步骤s4获得的突变点依次输入，当突变的折叠自由能的变化δδg<0表示突变对结构的不稳定作用，而δδg>0的突变表示对蛋白质结构的稳定作用，选择δδg>0的突变位点。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤s6中将野生型蛋白酶的结构模型或氨基酸序列提交至consurf服务器，以默认参数自动运行。10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤s4中如果选择alphafold2预测的结构模型，则输入的是步骤s2中获得的pdb文件。

技术总结
本发明公开了一种基于理性设计改造的高热稳定性内切型褐藻酸裂解酶突变体，所述突变体为褐藻酸裂解酶AlyRm6A氨基酸序列的第43位的苏氨酸突变为异亮氨酸，即突变体T43I；或，突变体为褐藻酸裂解酶AlyRm6A氨基酸序列的第216位的谷氨酰胺突变为异亮氨酸，即突变体Q216I。本发明还公开了所获得的AlyRm6A突变体在催化褐藻胶发生β消去反应制备褐藻寡糖中的应用。所获得的突变体，在保持原酶催化活性的基础上，提高了该酶的热稳定性，使其具有更好的工业应用前景。本发明还公开了一种基于理性设计改造筛选蛋白酶耐热突变体的方法。性设计改造筛选蛋白酶耐热突变体的方法。性设计改造筛选蛋白酶耐热突变体的方法。


技术研发人员：王大毛 郭庆 郑雨婷
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/9/23