水稻OsZF基因在调控种子大小中的应用

水稻oszf基因在调控种子大小中的应用
技术领域
1.本发明属于分子育种技术领域，具体涉及水稻oszf基因在调控种子大小中的应用。


背景技术：

2.水稻是最重要的粮食作物之一，全球一半以上人口以之为主粮。水稻产量的稳定对粮食安全和人类发展具有重大意义。水稻产量受穗粒数、有效分蘖数和粒重共同制约。其中，粒重由种子大小决定。种子大小的决定因素又可以进一步细分为种子长度、种子宽度、种子厚度和灌浆程度。种子大小主要受遗传因素调控，不易受环境因素影响，因此，挖掘和鉴定调控种子大小的基因一直是科学家追求的目标。
3.从细胞水平来讲，种子大小与颖壳的细胞分裂和细胞伸长直接相关。目前，已经发现了几条控制种子大小的通路，主要包括g蛋白信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mapk)通路、泛素-蛋白酶体途径、激素途径和转录因子途径。例如，编码水稻g蛋白α、β亚基的rga1、rgb1和编码γ亚基的gs3和dep1分别调控细胞分裂正向和负向影响种子大小。其中，mapk通路中的mkk4和mapk6影响了颖壳细胞数目，其功能缺失突变体均会导致种子变小。gw2编码一个ringe3泛素连接酶，其功能缺失突变会导致种子变宽，粒重增加。油菜素内酯受体和共受体缺失突变体bri1和bak1会导致br不敏感，种子变小。此外，一些转录因子(如osspl13、osgrf4等)也对种子大小有正调控作用。然而，关于水稻锌指蛋白oszf在水稻中的应用目前尚未见报道。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种水稻锌指蛋白的编码基因oszf，该基因可以调节水稻种子的大小，对改良水稻的产量性状具有重要意义。
5.为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
6.本发明第一方面提供了oszf基因在调控水稻种子大小中的应用，所述oszf基因具有如seq id no:1所示的核苷酸序列。
7.需要说明的是，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。同时，本发明也适用于调控其他禾本科植物的种子大小。
8.优选地，通过提高oszf基因在水稻中的表达量，从而增加水稻种子的大小。
9.本发明经研究发现，水稻oszf基因的敲除会显著减少种子的大小，表明oszf是水稻种子大小的正调控基因。因此，可通过调节oszf基因的表达改变种子大小，对改良水稻的产量性状具有重要意义。
10.优选地，所述种子大小包括种子粒长和种子粒宽。
11.优选地，所述oszf基因还包括与其相关的生物材料，所述相关的生物材料包括编码oszf基因的蛋白，含有oszf基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
id no:3)，等量混合后于pcr仪中退火，程序为95℃、2min，以0.1℃/s的速率降至室温。将退火后得到的sgrna连到bsai酶切后的入门载体pentrya(构建方法参见“he,f.,zhang,f.,sun,w.et al.a versatile vector toolkit for functional analysis of rice genes.rice11,27(2018)”)中，制得u6启动子-引导序列-grna表达盒。随后，用psti和spei对u6启动子-引导序列-grna表达盒进行酶切，并连接至prhcas9载体(构建方法参见“he,f.,zhang,f.,sun,w.et al.a versatile vector toolkit for functional analysis of rice genes.rice11,27(2018)”)中，构建得到oszf crispr/cas9敲除质粒(图1)。
29.oszf基因的核苷酸序列(seq id no:1)：
30.atgatcttcccccctgccttcctggattcctcgagctggaatgataacaacaacaacaaccacaaccagcagcagcagcagcaacatgctcacggccaccaccagcatcatcaggtcgccgccggttgtggaggcggcggcggcggcggcgacggcaatagccatgagcttctgcagcagcagtcaatgattccgggcacgcttgccgatggcggcggcggaggcggcgcggtggggccggcgaagccgatgtcgatgtcggagagggcgcggctggcgaggatcccgctgccggagccggggctcaagtgcccgcgctgcgactccaccaacaccaagttctgctacttcaacaactactccctctcccagccccgccacttctgccgcgcctgccgccgctactggacccgcggcggcgcgctccgcaacgtccccgtcggcggcggctaccgccgccacgccaagcgcgccaagcccaagccggcgtccgcggcgggctccgcctcagccgccaccaccaccgccggctcgacgccagcggggtcgacgacgacgacgacgacgtcctccacctgcgccacgcccaacgcgcccgccctcccggcgatgctgggcggcaacctctccatcctgccgccgctgctccgcctcgccgacttcgacgccatgagcctcggctccaccttctctggcatggcggcggccgccggcaagccaccgcccgtcgacgcggccggctgctactccgtcggcgccgccaccggcctcgagcaatggagactacagcagatgcagagcttcccgttcttccacgccatggatcaccaggcggcgatggcggcgccaccgccggcaatggcaatgccggggatgttccagctaggcctagacggcgacggccatggcagcggcggcggcgaagacggtggagagctccaccatgcgatgccatcatcgaagagagaaggctacccaaggggcatgtatggcgatcatcacctcgctggaggatacacctcctactccagtgcaaccacaggtaaccatctcttgtaa。
31.2、oszf crispr/cas9敲除质粒转化水稻愈伤组织
32.将水稻zh11(中花11号，为中国农业科学院作物科学研究所培育的常用水稻品种)成熟种子剥去颖壳，用75％酒精消毒1min，用无菌水清洗3次，后于2％naclo溶液消毒两次，每次30min，期间不断摇动。用无菌水清洗3次后，在无菌的滤纸上吸干水分。把消毒后的种子接种到诱导培养基上(n6+2.0mg/l 2,4-d)，28℃光照培养10d。将得到的黄色的新鲜愈伤组织转移至新的诱导培养基进行继代培养1次。选取得到的淡黄色、颗粒状、生长状态良好的胚性愈伤组织进行后续的农杆菌转化实验。
33.将步骤1构建好的oszf crispr/cas9敲除质粒转化农杆菌eha105感受态，所述转化方法为化学转化法，即dna直接转化农杆菌，具体为：1)往50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒dna 0.1～1μg(5-10μl)，之后冰浴30min；2)放入液氮中5min(或1min)，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3)取出离心管，加入0.5ml lb，28℃、220rpm振荡培养3～5h；4)取出菌液于含50mg/l卡那霉素和50mg/l利福平的lb平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养，2天左右可见菌落。
34.将鉴定过的含oszfcrispr/cas9质粒的正确单克隆农杆菌扩大培养至50ml yep培养基中(含50mg/l卡那霉素和50mg/l利福平)，加入终浓度为100μm的乙酰丁香酮(as)，28℃、200rpm培养3-5h至od
600
为0.6-1.0，制得农杆菌侵染液。将胚性愈伤组织倒入农杆菌侵
染液中浸染20min，用无菌滤纸吸干水分，在共培养基(ms+2,4-d 2.0mg/l+as 100μm)上于28℃暗培养2-3d。共培养后的愈伤组织用无菌水清洗3次，然后用含400mg/l头孢霉素的无菌水清洗3次，每次15min，期间不断摇动。之后，将愈伤组织吸干水分，接种到选择培养基(ms+2.0mg/l 2,4-d+25mg/l hyg+250mg/l cef)上，于26℃黑暗培养21天。将新长出且生长良好的抗性愈伤转入分化培养基(ms+2.0mg/l kt+0.2mg/l naa+2.0mg/l 6-ba+25mg/l hyg)中，于28℃下进行光照培养。待再生苗长至3-4cm高时，移至生根培养基(1/2ms)进行培养。待幼苗长至10cm高时，洗净根部附着的培养基，移至泥土(来源自广东省农业科学院实验基地)中培养。
35.3、oszf crispr/cas9敲除材料的鉴定
36.(1)dna提取
37.剪取t0代植株叶片约1cm置于1.5ml离心管中，加入液氨用研磨棒磨碎，加入300μldna提取缓冲液(1m tris-hcl(ph8.0),0.5medta(ph8.0),5m nacl,1.24％(v/v)sds)于65℃水浴加热15min，加入300μltris饱和酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，涡旋混匀，12000rpm离心5min，将上清转移至新的1.5ml离心管中，加入300μl异丙醇，室温静置5min。12000rpm离心5min，弃上清。加入500μl 75％乙醇洗涤沉淀，7500rpm离心5min，弃上清，真空干燥残余乙醇，加入30μl te缓冲液溶解沉淀，即得dna样品。
38.(2)pcr扩增转基因植株基因组oszf片段
39.利用oszf-gt-f(5
’‑
acctcatctatcccttccacctcactctcac-3’，seq id no:4)与oszf-gt-r(5
’‑
tgatgctggtggtggccgtg-3’，seq id no:5)为引物，以上一步中提取的dna为模板，用toyobokod fx dna聚合酶pcr扩增oszf的基因组片段。将pcr扩增产物送公司进行测序，测序结果用在线软件http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/进行分析。表明oszf crispr/cas9敲除株为移码突变(图2)。
40.4、oszf突变株水稻的种植与表型分析
41.将t2代纯合突变株的种子与野生型种子用水萌发，在泥土(来源自广东省农业科学院实验基地)中种植一周后，移栽至大田(广东省农业科学院实验基地)中培养至种子完全成熟。最后，将完全成熟的种子进行烘干，测量种子长度、宽度及干粒重，并拍照及统计。测量结果显示，与野生型植株相比，oszf crispr/cas9敲除株较矮小、直立(图3)，种子粒长短很多(图4)，种子粒宽略窄(图5)，干粒重比野生型的轻很多(图6)。上述结果说明oszf基因有望用于调节水稻种子的大小，对改良水稻的产量性状具有重要意义。
42.以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

技术特征：
1.oszf基因在调控水稻种子大小中的应用，其特征在于，所述oszf基因具有如seq id no:1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过提高oszf基因在水稻中的表达量，从而增加水稻种子的大小。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述种子大小包括种子粒长和种子粒宽。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述oszf基因还包括与其相关的生物材料，所述相关的生物材料包括编码oszf基因的蛋白，含有oszf基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5.一种培育高产水稻的方法，其特征在于，利用基因编辑技术提高oszf基因在水稻中的表达量。6.根据权利要求5所述的一种培育高产水稻的方法，其特征在于，利用crispr/cas9介导的基因编辑技术提高oszf基因在水稻中的表达量。7.根据权利要求6所述的一种培育高产水稻的方法，其特征在于，先利用prhcas9载体构建oszf的敲除载体质粒，然后将质粒转化水稻愈伤组织，最后筛选抗性愈伤组织，并进行分化即得。8.根据权利要求7所述的一种培育高产水稻的方法，其特征在于，oszf敲除载体质粒的构建方法为：利用网页targetdesign在seq id no:1所示的核苷酸序列的外显子5’端设计1个靶位点，合成seq id no:2和seq id no:3所示的双链引物，双链退火后连接至bsai酶切的pentrya载体，再用psti和spei对所得的u6启动子-引导序列-grna表达盒进行酶切，并连接至prhcas9载体中。

技术总结
本发明属于分子育种技术领域，具体涉及水稻OsZF基因在调控种子大小中的应用。为挖掘和鉴定调控种子大小的基因，本发明经研究发现，敲除水稻锌指蛋白基因OsZF可以显著减少种子大小和粒重，表明OsZF是种子大小的正调控基因，OsZF的表达调控可以用于培育种子增大的水稻品种。本发明首次公开了OsZF基因在调节水稻种子大小中的应用，在高产水稻的创制中具有良好的应用前景。好的应用前景。好的应用前景。


技术研发人员：冯彦钊 于洋 陈沛 朱庆锋 薛皦
受保护的技术使用者：广东省农业科学院农业生物基因研究中心
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/9/23