一种用以核酸检测的通用型胶体金侧流层析试纸条的制备及其应用

1.本发明涉及生物化学中核酸检测技术领域，提供一种用以核酸检测的通用型胶体金侧流层析试纸条的制备方法和应用。


背景技术：

2.侧流免疫层析是一种基于抗原、抗体免疫反应的经典床旁检测技术(point of care testing，poct)，常见的标记材料包括胶体金、量子点、时间分辨荧光微球、上转换纳米颗粒、磁性纳米颗粒等，其中最经典的一种标记检测技术是胶体金免疫层析技术，该免疫层析技术依靠大量金纳米颗粒的聚集形成肉眼可见的色带。但传统依赖抗原抗体的胶体金免疫层析试纸条检测灵敏度低，而且存在检测窗口期。而核酸检测胶体金侧流层析试纸条结合等温扩增-crispr/cas12a分子诊断技术可以提高核酸检测灵敏度和特异性，同时通过优化试纸条检测f-b探针的浓度，可以在保证试纸条检测可行性的同时缩短crispr/cas12a反应时间，实现超快速核酸检测。且胶体金侧流层析试纸条的制作简单、成本低、检测结果肉眼可见，可以用于检测人类和动物的病原体感染或生物标志物，在核酸即时快速检测方面发挥着不可替代的作用，因此制备胶体金层析试纸条是实现核酸即时的关键。


技术实现要素：

3.为了提高核酸检测的效率，本发明提供一种核酸检测的通用型胶体金侧流层析试纸条、制备方法以及应用。
4.本发明提供了一种通用型核酸检测胶体金侧流层析试纸条，其依次包括pvc板、金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜(nc膜)以及吸水垫：
5.进一步，所述金标垫为玻璃纤维素膜；
6.进一步，所述玻璃纤维素膜、样品垫用处理液浸泡，并自然风干；
7.进一步，所述处理液为1％bsa、5％蔗糖、0.5％tween-20、10mm pb缓冲液，ph为7.4；
8.进一步，所述玻璃纤维素膜包被胶体金颗粒标记的单克隆小鼠抗荧光素抗体(金标抗体)；所述nc膜上按照样品层析方向依次设置控制线(c线)和检测线(t线)，所述c线上包被链霉亲和素，所述t线上包被单克隆山羊抗兔igg；
9.本发明提供了一种核酸检测的通用型胶体金侧流层析试纸条的制备方法：
10.(1)制备金标垫；
11.(2)制备nc膜上的质控线和检测线；
12.(3)组装胶体金侧流层析试纸条；
13.(4)胶体金侧流层析试纸条性能测试。
14.进一步，步骤(4)中，所述胶体金侧流层析试纸条性能测试，包括：
15.(1)显色验证
16.用不同浓度的荧光探针f-b模拟阴性检测样本，滴在试纸条上进行测试，查看在相同时间内试纸条上c线和t线的颜色深浅，并拍照记录。
17.(2)稳定性验证
18.将同一批次的试纸条装入含有干燥剂的塑封袋里，放置在常温环境中保存，保存不同时间后进行显色验证；
19.本发明提供了一种通用型胶体金侧流层析试纸条在检测人乳头瘤病毒16型(hpv16)中的应用：
20.以hpv16l1基因重组质粒为模板，采用恒温扩增引物扩增目标片段，得到特异性扩增产物；特异性扩增产物加入到crispr/cas12a反应体系中，进行恒温反应，反应体系通过侧流层析试纸条进行检测。
21.本发明的优点在于：
22.本发明制作了一种通用型胶体金侧流层析试纸条可用来检测核酸，其制作简单，无需任何仪器，成本低，适合家庭化核酸自测。
附图说明
23.图1为本发明的胶体金侧流层析试纸条组装结构示意图；
24.图2为本发明的胶体金侧流层析试纸条组装实物图；
25.图3为本发明的胶体金侧流层析试纸条显色验证结果，从左到右f-b探针的终浓度为1nm、2nm、5nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm；
26.图4为本发明的胶体金侧流层析试纸条稳定性测试结果；
27.图5为本发明的胶体金侧流层析试纸条检测hpv16结果图；
28.附图标记说明
29.(1)pvc基板；(2)样品垫；(3)金标垫；(4)硝酸纤维素膜；(5)吸水垫；(6)c线；(7)t线。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施例对本发明的具体实施方式做出说明。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
31.实施例1提供了一种通用型胶体金侧流层析试纸条：
32.通用型胶体金侧流层析试纸条包括pvc板、金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜(nc膜)以及吸水垫，样品垫和吸水垫的长度为1.7cm，金标垫的长度我0.8cm，nc膜长度为2.4cm，pvc板长度为6cm，宽度都是3mm，结构示意图如图1所示。金标垫为玻璃纤维素膜，玻璃纤维素膜、样品垫用处理液(1％bsa、5％蔗糖、0.5％tween-20、10mm pb缓冲液，ph为7.4)浸泡，并自然风干。
33.在本实施例中，玻璃纤维素膜上包被金标抗荧光素抗体，nc膜上设有c线和t线，c线上包被链霉亲和素，t线上包被山羊抗兔igg。
34.当有目标核酸序列时，经过恒温扩增-crispr/cas12a反应，f-b探针被切割，探针两端修饰的生物素和荧光素分离，将制备的胶体金侧流层析试纸条插入上述反应溶液中进
行检测；由于探针被切割，c线的链霉亲和素无法通过生物素捕获到金标抗体，从而c线没有颜色，t线的igg抗体与金标抗体结合显示出红色。
35.当无目标核酸序列时，经过恒温扩增-crispr/cas12a反应，f-b探针不被切割，生物素和荧光素不会分离，c线的链霉亲和素通过生物素捕获到金标抗体，从而c线有颜色，多余的金标抗体与t线的山羊抗小鼠igg抗体结合显示出红色。所以，有待测靶标时，只有t线；无待测靶标时，c线和t线同时出线；若试纸条t线未出，则该试纸条失效。
36.实施例2提供了一种通用型胶体金侧流层析试纸条的制作方式，具体步骤为：
37.(1)制备金标垫：将玻璃纤维素膜浸泡到含有金标抗体的卡槽里，37℃烘干后得到金标垫，用锡纸包裹放置在室温备用；
38.(2)制备nc膜上的质控线和检测线：用钢笔吸取链霉亲和素和单克隆山羊抗兔igg分别划在nc膜上，得到包含有c线和t线的nc膜，37℃烘干，用锡纸包裹放置在室温备用；
39.(3)组装胶体金侧流层析试纸条；依次将nc膜、金标垫、吸水垫、样品垫粘贴在pvc板上，裁剪成3mm宽度的试纸条放置到封口袋中备用，如图2所示；
40.(4)胶体金侧流层析试纸条性能测试。
41.进一步，步骤(1)中，所述卡槽为3d打印机打印，宽为1.7cm，长为任意尺寸；
42.进一步，步骤(2)中，所述链霉亲和素浓度为6mg/ml，单克隆山羊抗兔igg浓度为1.5mg/ml；
43.进一步，步骤四中，所述胶体金侧流层析试纸条性能测试，包括：
44.(1)显色验证
45.在不同浓度的荧光探针f-b中加入10μl nebuffer2.1(50mm nacl，10mm tris-hcl，10mm mgcl2，1mm dtt，100μg/ml bsa，ph 7.9)，模拟阴性检测样本，补水到100μl，震荡混匀，插入试纸条进行测试，查看在相同时间内试纸条上c线和t线的颜色深浅，并拍照记录。结果如图3所示，当探针浓度低于5nm时，试纸条的c线很浅，t线正常，所以试纸条检测的最低探针浓度不能低于5nm。
46.(2)稳定性验证
47.将同一批次的试纸条装入含有干燥剂的塑封袋里，放置在常温环境中保存，并在第1周、第2周、第3周、第4周、第8周、第16周进行显色验证，如图4所示，胶体金侧流层析试纸条在第16周时c和t线依然清晰，说明本发明的胶体金侧流层析试纸条具有很好地稳定性。
48.实施例3提供了一种通用型胶体金侧流层析试纸条在检测人乳头瘤病毒16型(hpv16)中的应用
49.以hpv16l1基因重组质粒(浓度为106copies/μl)为阳性标准品，采用恒温扩增引物扩增目标片段，得到特异性扩增产物；特异性扩增产物加入到crispr/cas12a反应体系中，进行恒温反应，反应体系通过侧流层析试纸条进行检测。
50.进一步，所述hpv16l1基因重组质粒、引物、crrna、f-b探针序列为：
51.[0052][0053]
进一步，使用恒温扩增试剂盒(amplification future，china)对靶点基因进行扩增。配置恒温扩增体系，包括2μl阳性质粒标准品、引物hpv16-f(480nm)、引物hpv16-r(480nm)、醋酸镁(14mm)、缓冲溶液以及干粉管试剂，充分混匀，置于37℃反应15min。
[0054]
进一步，使用crispr/cas12a体系进一步进行信号放大。配置crispr/cas12a反应体系，包括lbcas12a(60nm)、crrna(100nm)、f-b探针(50nm)、nebuffer2.1缓冲溶液、上述扩增产物，充分混匀，置于37℃反应15min，反应结束后补水至100μl，使用本发明胶体金侧流层析试纸条进行检测。如图5所示，含有待测靶标的检测结果只有t线显色，不含待测靶标的检测结果c线和t线都显色，说明本发明的胶体金试纸条可以用以核酸检测。
[0055]
对于本领域技术人员而言，本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其它的具体形式实现本发明；因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
[0056]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同替换和改进，均应包含在本发明技术方案的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用以核酸检测的通用型胶体金侧流层析试纸条，其特征在于，所述胶体金侧流层析试纸条包括pvc板、金标垫、样品垫、nc膜以及吸水垫。所述金标垫是包含胶体金颗粒标记的单克隆小鼠抗荧光素抗体(金标抗体)的玻璃纤维素膜；所述nc膜上按照样品层析方向依次设置c线和t线，所述c线上包被链霉亲和素，所述t线上包被单克隆山羊抗兔igg。2.根据权利要求1所述的通用型胶体金侧流层析试纸条，其特征在于，所述玻璃纤维素膜和样品垫用处理液浸泡之后自然风干。3.根据权利要求2所述玻璃纤维素膜和样品垫的处理方式，其特征在于，处理液为1％bsa、5％蔗糖、0.5％tween-20、10mm pb缓冲液，ph为7.4。4.根据权利要求1所述的通用型胶体金侧流层析试纸条，具体制备方式如下：(1)制备金标垫：将玻璃纤维素膜浸泡到含有金标抗体的卡槽里，37℃烘干后得到金标垫，用锡纸包裹放置在室温备用；(2)制备nc膜上的c线和t线：用钢笔吸取链霉亲和素和单克隆山羊抗兔igg分别画在nc膜上，得到包含有c线和t线的nc膜，37℃烘干，用锡纸包裹放置在室温备用；(3)组装胶体金侧流层析试纸条；依次将nc膜、金标垫、吸水垫、样品垫粘贴在pvc板上，裁剪成3mm宽度的试纸条放置到封口袋中备用；(4)测试胶体金侧流层析试纸条性能。(5)根据权利4所述的制备方式，其特征在于，所述步骤(1)中卡槽为3d打印机打印。(6)根据权利4所述的制备方式，其特征在于，所述步骤(2)中链霉亲和素浓度为6mg/ml，单克隆山羊抗兔igg浓度为1.5mg/ml。5.根据权利4所述的制备方式，其特征在于，所述步骤(4)中，所述胶体金免疫层析试纸条的性能考察，包括：(1)显色验证用不同浓度的荧光探针f-b模拟实际样本检测环境，滴在试纸条上进行测试，查看在相同时间内试纸条上c线和t线的颜色深浅，并拍照记录。(2)稳定性验证将同一批次的试纸条装入含有干燥剂的塑封袋里，放置在常温环境中保存，保存不同时间后进行显色验证。6.一种应用如权利要求1-5中任意一项所述通用型胶体金侧流层析试纸条的制备方法制备得到的胶体金侧流层析试纸条。7.一种根据权利要求6所述的通用型胶体金侧流层析试纸条在检测hpv16中的应用。

技术总结
本发明涉及生物化学中核酸检测技术领域，提供一种用以核酸检测的通用型胶体金侧流层析试纸条的制备方法和应用，所述胶体金侧流层析试纸条包括PVC板、金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；所述金标垫上包被金标抗体，所述硝酸纤维素膜上分别画有C线和T线，所述C线和T线分别包被链霉亲和素和单克隆山羊抗兔IgG。本发明成功制作出通用型胶体金侧流层析试纸条，其制作简单、成本低，适合家庭化核酸自测，且利用本发明的试纸条可以实现快速、准确的HPV16核酸检测，在35min之内可以清楚观察到检测结果。检测结果。检测结果。


技术研发人员：王铁 刘梅 杜以晨
受保护的技术使用者：天津理工大学
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/9/23