一种高效广谱的抗冠状病毒多肽的吸入制剂及其制备方法与流程

1.本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种高效广谱的抗冠状病毒多肽的吸入制剂及其制备方法。


背景技术：

2.(sars-cov-2)是一种传染性和致病性极强的病毒。目前虽有多种针对sars-coa-2的疫苗和抗体、及其小分子药物获得批准，但sars-coa-2在流行期间不断产生特别令人关注的变异株(voc)，往往导致疫苗和药物的效果下降甚至失去活性。
3.多肽类药物是由10～100个氨基酸通过肽键连接而成的化合物，多为亲水性的极性大分子，因其高活性低毒性，已越来越多地用于各种疾病的治疗。但蛋白多肽类药物经口服给药时，需要通过各种生物屏障(如肠上皮细胞膜、肠腔内消化液、消化道酶等)，由于胃液的破坏、消化道酶的降解以及难以透膜等问题，因而生物利用度极低，譬如，口服多肽索马鲁肽的体内生物利用度不足1％。基于此，临床上多采用注射途径给药，但考虑到治疗周期长，患者频繁注射顺应性差，因此多肽类药物给药途径的研究热点仍聚焦于基于鼻黏膜、肺黏膜、直肠黏膜等的黏膜递送。其中，吸入给药被认为是最有希望替代注射给药的方式。因为肺脏具有巨大的吸收面积和丰富的毛细血管，肺上皮细胞极薄并有良好的通透性，下呼吸道的清除作用比较缓慢，酶的降解作用较少，因此大分子药物经肺部吸入给药时，生物利用度相对较高，可以比鼻腔给药高数倍，比口服给药高数十倍。同时因为多肽药物分子量适中，可以通过雾化吸入进入上下呼吸道(包括肺部)，而新冠病毒主要是在呼吸道这些部位入侵和复制。所以，雾化吸入法可以迅速地就把药物递送到了最关键的部位。
4.为了解决某些制剂产品起效慢，生物利用率低，污染环境，或者使用不方便等问题，亟待提供了一种吸入特性、复溶效果、递送效果和稳定性良好的、用于预防和治疗新冠病毒导致感染的吸入制剂。


技术实现要素：

5.针对上述需求，本发明首次制备了一种高效广谱的抗冠状病毒多肽的吸入制剂，所述吸入制剂稳定性、复溶效果、吸入特性良好，并且在不同模式均显现出优异的递送效果；通过口鼻吸收快速、直接的作用在上、下呼吸道，在呼吸道形成预防新冠病毒或其他冠状病毒入侵的第一线免疫屏障，可用于预防和/或治疗冠状病毒所致疾病。
6.本发明提供了一种吸入制剂，其中，药物活性成分包括多肽。
7.在一些优选地实施方案中，所述多肽包括20～60个氨基酸。
8.在一些优选地实施方案中，所述多肽用于治疗冠状病毒导致的感染。
9.在一些优选地实施方案中，还包括ph缓冲对和溶剂。
10.所述吸入制剂的ph＝3.0～6.0；在一些优选地实施方案中ph＝3.0～4.0；在一些更优选地实施方案中ph＝3.7。
11.在一些优选地实施方案中，所述的吸入制剂，其中，还包括赋形剂。
12.在一些更优选地实施方案中，所述的吸入制剂，包括药物活性成分、ph缓冲对、赋形剂和冻干溶剂，吸入制剂的ph＝3.0～6.0。
13.在一些优选地实施方案中，所述ph缓冲对选自酸性物质和碱性物质的组合；
14.所述酸性物质选自以下中的一种或多种：柠檬酸、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、醋酸、酒石酸、乳酸、谷氨酸、马来酸、琥珀酸、tris缓冲盐、盐酸、硫酸；
15.所述碱性物质选自以下中的一种或多种：柠檬酸钠、碳酸钠、磷酸氢二钠、醋酸钠、酒石酸钠、乳酸钠、甘氨酸、tris缓冲盐、氢氧化钠、氢氧化钾。
16.在一些更优选地实施方案中，所述ph缓冲对选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲对。
17.在一些优选地实施方案中，所述ph缓冲对的加入顺序为：酸性物质在碱性物质之前。
18.在一些更优选地实施方案中，所述加入顺序依次为：酸性物质、药物活性成分、碱性物质。
19.在一些优选地实施方案中，所述赋形剂选自：葡萄糖、海藻糖、蔗糖、右旋糖酐、山梨醇、甘露醇、木糖醇、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙中的任意一种或多种，优选为甘露醇。
20.在一些优选地实施方案中，所述ph调节剂选自：盐酸、硫酸、酒石酸、枸橼酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的任意一种或多种。
21.在一些优选地实施方案中，所述冻干溶剂选自注射用水、氯化钠溶液或葡萄糖溶液。
22.在一些优选地实施方案中，药物活性成分占吸入制剂的重量比为0.1％～10％，优选0.2％～2％。
23.在一些优选地实施方案中，所述赋形剂占吸入制剂的重量比为1％～30％，优选2％～10％。
24.在一些优选地实施方案中，单剂量规格为0.5～20ml。
25.在一些优选地实施方案中，药物活性成分占吸入制剂的重量为1～2mg/ml以上即可发挥作用，优选为1～100mg/ml，更优选为2～20mg/ml。
26.在一些优选地实施方案中，所述赋形剂占吸入制剂的重量为1～300mg/ml，优选为20～100mg/ml。
27.在一些优选地实施方案中，所述多肽为式(i)所示的化合物或其药用盐或其衍生物；
[0028][0029]
x1为氨基端保护基团或不存在；优选地，氨基端保护基团为酰基；更优选地，酰基为乙酰基(ac-)；
[0030]
x2为多肽，氨基酸序列为(eaaak)n或a[(eaaak)n]a；n为5以下的自然数，表示eaaak序列的重复次数；优选地，x2为eaaak；
[0031]
x3为赖氨酸或半胱氨酸或2,3-二氨基丙酸或鸟氨酸或2,4-二氨基丁酸或2,7-二
氨基庚酸；优选地，x3为赖氨酸；
[0032]
x4为修饰于x3的亲脂性化合物基团；优选地，亲脂性化合物为胆固醇琥珀酸单酯(chol)或硬脂酰氯；更优选地，亲脂性化合物为胆固醇琥珀酸单酯(chol)；
[0033]
x5为羧基端保护基团或不存在；优选地，羧基端保护基团为氨基(-nh2)。
[0034]
在一些更优选地实施方案中，所述多肽包括ykyy017，其肽序列为：
[0035]
ac-svvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikeaaakk(chol)-nh2。
[0036]
在一些优选地实施方案中，其中，所述多肽的合成方法如下：
[0037]
a)选用树脂从碳端到氮端依次按照顺序偶联所有氨基酸，固相合成全保护多肽；优选采用rink amide-mbha resin；
[0038]
b)选择性脱除lys的侧链保护基；优选采用肼作为催化剂，选择性脱除所述侧链保护基；
[0039]
c)在偶联剂存在条件下偶联侧链胆固醇琥珀酸单酯；
[0040]
d)在裂解剂存在条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护得到所述多肽。
[0041]
本发明还提供一种所述的吸入制剂的制备方法，其包括如下步骤：
[0042]
1)配液：
[0043]
将ph缓冲对中酸性物质、药物活性成分、ph缓冲对中碱性物质依次溶于冻干溶剂中，然后调节ph＝3.0～6.0，加入冻干溶剂至全量；
[0044]
2)冻干；
[0045]
3)吸入制剂的制备：将步骤2)得到的冻干产品溶于复溶溶剂中，得到吸入制剂。
[0046]
在一些优选地实施方案中，在步骤1)配液之后、步骤2)冻干之前，还包括步骤i)过滤和/或ii)灌装。
[0047]
在一些优选地实施方案中，在步骤2)冻干之后、步骤3)吸入制剂的制备之前，还包括步骤a)轧盖和/或b)复溶溶剂的制备。
[0048]
在一些优选地实施方案中，所述的吸入制剂的制备方法包括如下步骤：
[0049]
1)配液：
[0050]
将ph缓冲对中酸性物质、药物活性成分、ph缓冲对中碱性物质依次溶于冻干溶剂中，然后调节ph＝3.0～6.0，加入冻干溶剂至全量；
[0051]
2)过滤；
[0052]
3)灌装；
[0053]
4)冻干；
[0054]
5)轧盖；
[0055]
6)复溶溶剂的制备；
[0056]
7)将步骤5)得到的冻干产品溶于步骤6)制备的复溶溶剂中，得到吸入制剂。
[0057]
在一些优选地实施方案中，在所述步骤1)调节ph后，加入复溶溶剂之前，添加赋形剂。
[0058]
在一些优选地实施方案中，所述复溶溶剂选自注射用水、氯化钠溶液或葡萄糖溶液。
[0059]
在一些优选地实施方案中，所述吸入制剂的单剂量包装选自以下中的任意一种：西林瓶和塑料安瓿瓶组合、西林瓶和预灌封注射器组合、双腔西林瓶、双腔预灌封、双腔卡
式瓶、粉液双室袋；优选为西林瓶和塑料安瓿组合。
[0060]
在一些优选地实施方案中，所述吸入制剂的剂型包括雾化吸入溶液、吸入气雾剂。
[0061]
此外，本发明也提供一种所述的吸入制剂在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染药物中的用途。
[0062]
有益效果：
[0063]
1、本发明首次制备了一种高效广谱的抗冠状病毒多肽的吸入制剂，所述吸入制剂稳定性、复溶效果、吸入特性良好，并且在不同模式均显现出优异的递送效果；通过口鼻吸收快速、直接的作用在上、下呼吸道，在呼吸道形成预防新冠病毒或其他冠状病毒入侵的第一线免疫屏障，可用于预防和/或治疗冠状病毒所致疾病。
[0064]
i)制剂效果
[0065]
一、ph缓冲对
[0066]
1、相较于不加ph缓冲对，加入ph缓冲对制备的吸入制剂的稳定性大大增加，具体表现在：
[0067]
加速后的总杂低至1.63～1.89％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)；且加速放置后杂质增长量控制在0.35～0.61％，稳定性良好且显著；相较于未添加ph缓冲对，加速后杂质增长量降低了2.07～2.33％；
[0068]
2、采用本发明的ph缓冲对(例如，柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠、酒石酸-酒石酸钠、碳酸氢钠-碳酸钠)制备的吸入制剂的稳定性良好，具体表现在：
[0069]
加速后的总杂为1.63～1.89％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)，且未超过3.0％；且加速放置后杂质增长量控制在0.35～0.61％，稳定性良好且显著；
[0070]
3、采用柠檬酸-柠檬酸钠作为ph缓冲对制备的吸入制剂的稳定性最优，具体表现在：
[0071]
加速后的总杂为1.63％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)，且未超过3.0％；且加速放置后杂质增长量仅为0.35％，稳定性最好。
[0072]
二、ph缓冲对的加入顺序
[0073]
1、采用本发明的ph缓冲对加入顺序，即ph缓冲对中酸性物质-在碱性物质之前添加(例如，ph缓冲对中酸性物质-药物活性成分-ph缓冲对中碱性物质)，制备的吸入制剂的稳定性最优，具体表现在：
[0074]
药物活性成分溶解完全，溶液澄清，无絮状物析出；并且加速后的总杂为1.63％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)，且未超过3.0％；且加速放置后杂质增长量仅为0.35％，稳定性良好；
[0075]
2、采用其他ph缓冲对的加入顺序，药物活性成分均不能完全溶解，溶液不澄清，絮状物析出，无法进行后续的冻干制备过程。
[0076]
三、药液ph值
[0077]
1、调节ph为3.0～6.0，制备的吸入制剂的稳定性良好，具体表现在：
[0078]
新鲜制备的样品有关物质总杂为1.28～1.38％，；加速后的总杂为1.63～2.45％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)；且加速放置后杂质增长量控制在0.35～1.1％，稳定性良好；
[0079]
2、调节ph为3.7时制备的吸入制剂的稳定性最佳，具体表现在：
[0080]
加速后的总杂为1.63％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)，且未超过3.0％；且加速放置后杂质增长量仅为0.35％，稳定性最好。
[0081]
3、采用本发明范围外的ph，无法制备稳定性合格的吸入制剂产品；具体表现在：
[0082]
新鲜制备样品的有关物质总杂、加速6月之后的有关物质总杂及增长量，均显著增加，并且远高于总杂含量限定标准(≤5.0％)。
[0083]
四、赋形剂
[0084]
1、采用甘露醇、海藻糖、葡萄糖和右旋糖酐作为赋形剂，制备的吸入制剂稳定性、复溶效果、吸入特性良好，并且在不同模式均显现出优异的递送效果；具体表现在：
[0085]
1-1)0天有关物质总杂为1.27～1.32％，放置加速后，有关物质总杂为1.63～1.88％，远小于质量标准5.0％的要求，杂质增长量低，控制在0.35～0.58％范围内，稳定性良好。
[0086]
1-2)样品性状为类白色蛋糕状、疏松细腻块状物，复溶时间为28～35s，复溶时间较快，复溶后溶液澄清，复溶效果良好。
[0087]
1-3)空气动力学粒径均小于5μm，有利于药物进入肺部沉积；微细粒子剂量均大于0.8mg；微细离子分数大于50％；表明进入肺部的药物粒子较多。
[0088]
1-4)在不同模式下的递送速率和递送总量以及雾化总量在可雾化总量中所占的比例均呈现较高趋势，递送效果表现良好。
[0089]
2、采用甘露醇作为赋形剂，制备的吸入制剂稳定性、复溶效果、吸入特性最好，并且在不同模式的递送效果和雾化效果最优；具体表现在：
[0090]
2-1)加速后的总杂为1.63％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)，且未超过3.0％；且加速放置后杂质增长量仅为0.35％，稳定性最好。
[0091]
2-2)样品性状为类白色蛋糕状、疏松细腻块状物，复溶时间最快达28s，复溶后溶液澄清，复溶效果良好且显著。
[0092]
2-3)空气动力学粒径低至3.854μm远小于5μm，有利于药物进入肺部沉积；微细粒子剂量为1.03mg，大于0.8mg；微细离子分数为63.754％、大于50％；表明进入肺部的药物粒子较多。
[0093]
2-4)在不同模式下的递送速率和递送总量以及雾化总量在可雾化总量中所占的比例均显著高于其他水平，递送效果最优。
[0094]
3、不添加赋形剂或者采用本发明范围外的赋形剂，制备的吸入制剂的无法制备稳定性和复溶效果合格的制剂产品；并且吸入特性差，递送效果和雾化效果差；具体表现在：
[0095]
3-1)不添加赋形剂或者采用本发明范围外的赋形剂，0天的有关物质总杂高达1.62％，加速后有关物质总杂增长量为5.19～5.83％，明显超过质量标准5.0％的要求，杂质含量增加显著，稳定性差；无法制备合格的制剂产品；
[0096]
3-2)未加入赋形剂的样品冻干后性状为类白色块状物、萎缩，复溶时间延长至121s，超过2min，复溶效果差。
[0097]
3-3)雾化吸入剂的空气动力学粒径增加至约6.7～6.8μm，均大于5μm；药物微细粒子均小于0.8mg；微细离子分数(fpf)小于50％，粒径显著增加，进入肺部的药物粒子少，进而无法进入肺部有效沉积。
[0098]
3-4)递送速率和递送总量以及雾化总量在可雾化总量中所占的比例均显著降低，递送效果和雾化效果变差。
[0099]
ii)药理效果
[0100]
本发明一种高效广谱的抗冠状病毒多肽的吸入制剂用于预防和/或治疗冠状病毒(例如，sars-cov-2病毒)导致的感染。
[0101]
本发明通过吸入给药，使本发明的广谱冠状病毒膜融合抑制剂能够显著抑制冠状病毒sas-cov-2(omicron变异株)在仓鼠肺组织内的复制，显著降低仓鼠肺组织病毒载量，可以有效缓解病毒感染后引起的肺部病理损伤。表明本发明的广谱冠状病毒膜融合抑制剂对冠状病毒如sas-cov-2(omicron变异株)具有有效且稳定的预防及治疗作用。
[0102]
1、体外药效
[0103]
1.1脱靶风险较小或无明显脱靶反应
[0104]
体外评估本发明雾化吸入剂在g蛋白偶联受体、离子通道、转运体、激酶、酶和核激素受体等6类药理靶点上的潜在脱靶作用。单浓度点测试结果显示本发明雾化吸入剂对本次筛选选择的45个靶点(除herg和ar)没有明显的脱靶反应，进一步的ic50测试结果显示本发明雾化吸入剂对herg(ic50＝6.88μm)和ar(ic50＝3.03μm)的潜在脱靶风险较小。
[0105]
1.2毒性小
[0106]
试验采用vero e6细胞，评价本发明的广谱的冠状病毒膜融合抑制剂的细胞毒性，并计算cc50值。同时，细胞水平测定本发明的广谱的冠状病毒膜融合抑制剂对sars-cov-2(omicron ba.2变异株)的ic50值，计算治疗指数(ti＝cc50/ic50)。体外药效学研究表明，广谱的冠状病毒膜融合抑制剂对vero e6细胞有一定的毒性，但毒性较小，cc50为41.83μm。本发明的广谱的冠状病毒膜融合抑制剂对sars-cov-2(omicron ba.2变异株)有很好的抑制作用，ic50为0.41nm，ti指数为102024。
[0107]
2、体内药效
[0108]
2.1预防作用：显著降低鼠肺组织的病毒载量
[0109]
试验建立了sars-cov-2(omicron ba.2变异株)仓鼠感染模型，攻毒剂量为1
×
104tcid50/只。为探索多肽ykyy017雾化吸入剂对体内感染sars-cov2奥密克戎ba.2变异株的预防作用，随机分为6个组，分别为溶媒对照组，于攻毒前0.5h单次雾化吸入给予注射用水30min；预防组1、预防组2、预防组3和预防组4，分别于攻毒前0.5h、4h、8h和12h单次雾化吸入给予5mg/ml的ykyy017雾化吸入剂30min；预防组5，于攻毒前8h单次雾化吸入给予10mg/ml的ykyy017雾化吸入剂30min，此后均不再给药。攻毒前第0天及攻毒后每天至实验终点检测动物的体重及体温，攻毒后第2天检测仓鼠肺组织病毒载量。试验结果表明，与溶媒对照组相比，感染2天(2dpi)时，预防雾化吸入ykyy017雾化吸入剂的各组均可显著降低仓鼠肺组织的病毒载量。
[0110]
2.2治疗作用：显著缓解感染引起的鼠肺部病理损伤
[0111]
体内药效学研究表明，在攻毒0.5h给予雾化吸入2mg/ml-5mg/ml的本发明雾化吸入剂，可以显著地抑制sars-cov-2(omicron ba.2变异株)在叙利亚仓鼠体内的复制，并可以有效缓解sars-cov-2(omicron ba.2变异株)感染后引起的肺部病理损伤。
[0112]
iii)工艺效果
[0113]
本发明工艺简单、能耗低、对设备要求不高、物美价廉。适于大规模工艺化生产和
应用。
附图说明
[0114]
图1ykyy017对vero e6细胞的毒性作用；
[0115]
图2对叙利亚仓鼠感染sars-cov-2奥密克戎ba.2变异株预防作用研究-肺组织grna；
[0116]
图3仓鼠体重变化图(分组)(d0-d3)；
[0117]
图4仓鼠体重变化图(分组)(d0-d5)；
[0118]
图5仓鼠肺组织病毒载量(grna)(d0-d3)；
[0119]
图6仓鼠肺组织病毒载量(grna)(d0-d5)；
[0120]
图7仓鼠肺组织病毒滴度(d0-d3)；
[0121]
图8仓鼠肺组织病毒滴度(d0-d5)。
具体实施方式
[0122]
下面通过实施例来进一步说明本发明。应当理解为：本发明的实施例仅仅是用于说明本发明而给出，而不是对本发明的限制，在本发明技术方案的前提下对本发明的简单改进均属于本发明的保护范围。
[0123]
实施例1
[0124]
1-1、处方：
[0125]
本发明的广谱的冠状病毒膜融合抑制剂的吸入制剂，具体处方组成如下：
[0126]
表1：实施例1的组分表
[0127][0128]
1-2、制备工艺：
[0129]
1)配液：
[0130]
先将柠檬酸加入适量的10～30℃温度下体积占比20％～80％的注射用水中，再加入药物活性成分ykyy017搅拌溶解至溶解，再加入柠檬酸钠溶解，再加入适量的ph调节剂调节ph至3.7，再加入甘露醇搅拌溶解后，加入剩余注射用水定容或定重至全量，搅拌均匀。
[0131]
2)过滤：药液经一道0.45μm聚醚砜滤芯，再经过一道0.22μm聚醚砜滤芯精滤至缓冲罐。
[0132]
3)灌装：将药液灌装至10ml西林瓶内。
[0133]
4)冻干
[0134]
5)轧盖
[0135]
6)灭菌注射用水制备：将2ml注射用水灌装入塑料聚丙烯安瓿，121℃12min灭菌。
[0136]
7)吸入使用时，将步骤5)冻干轧盖后的ykyy017加入步骤6)注射用水复溶后装入雾化杯使用。
[0137]
实施例2：不加ph缓冲对
[0138]
参照实施例1的处方和制备工艺，与实施例1的区别在于，处方中不添加ph缓冲对，处方用量、处方中其他组分与实施例1一致；制备工艺除不添加ph缓冲对外，与实施例1一致。
[0139]
实施例3：ph缓冲对种类
[0140]
参照实施例1的处方和制备工艺，与实施例1的区别在于，改变柠檬酸-柠檬酸钠的种类，将实施例1的柠檬酸-柠檬酸钠替换为，
[0141]
方法1：醋酸-醋酸钠
[0142]
方法2：磷酸二氢钠-磷酸氢二钠
[0143]
方法3：酒石酸-酒石酸钠
[0144]
方法4：碳酸氢钠-碳酸钠
[0145]
处方用量、处方中其他组分和制备工艺与实施例1一致。
[0146]
实施例4：缓冲对加入顺序
[0147]
参照实施例1的处方和制备工艺，与实施例1的区别在于，缓冲对的加入顺序调整，具体将先加柠檬酸的加料顺序分别调整为：
[0148]
方法1：柠檬酸钠+api+柠檬酸
[0149]
方法2：柠檬酸+柠檬酸钠+api
[0150]
方法3：醋酸钠+api+醋酸
[0151]
方法4：磷酸氢二钠+api+磷酸二氢钠
[0152]
处方用量、处方中其他组分和制备工艺与实施例1一致。
[0153]
实施例5：ph调节
[0154]
参照实施例1的处方和制备工艺，与实施例1的区别在于，用ph调节剂调节ph分别至：
[0155]
方法1：2.0
[0156]
方法2：3.0
[0157]
方法3：4.0
[0158]
方法4：5.0
[0159]
方法5：6.0
[0160]
方法6：7.0
[0161]
方法7：8.0
[0162]
处方用量、处方中其他组分和制备工艺与实施例1一致。
[0163]
实施例6：不加赋形剂物质
[0164]
参照实施例1的处方，即处方中不添加赋形剂物质，处方用量、处方中其他组分与实施例1一致；制备工艺与实施例1一致。
[0165]
实施例7：赋形剂的选择
[0166]
参照实施例1的处方和制备工艺，与实施例1的区别在于，改变糖类或糖醇类物质的种类，将实施例1的甘露醇替换为，
[0167]
方法1：海藻糖；
[0168]
方法2：葡萄糖；
[0169]
方法3：右旋糖酐；
[0170]
方法4：乳糖；
[0171]
处方用量、处方中其他组分和制备工艺与实施例1一致。
[0172]
实施例8：赋形剂的用量
[0173]
参照实施例1的处方和制备工艺，与实施例1的区别在于，处方中甘露醇的用量替换为：
[0174]
方法1：20mg/支(10mg/ml)
[0175]
方法2：140mg/支(70mg/ml)
[0176]
实施例9：药物活性成分的用量
[0177]
参照实施例1的处方和制备工艺，与实施例1的区别在于，处方中ykyy017的用量替换为：
[0178]
方法1：2mg/ml
[0179]
方法2：5mg/ml
[0180]
实施例10：吸入气雾剂
[0181]
处方与工艺步骤1)～6)均与实施例1一致，步骤7)为将含药复溶溶液与适宜的抛射剂共同分装于具有特制阀门系统的耐压容器中，制备成压力定量吸入器(mdi)、有储雾罐的pmdi剂型。
[0182]
对比例1
[0183]
根据专利cn114533706b的一种用于防治呼吸道疾病的雾化吸入制剂及其应用中的专利处方，将抗病毒活性因子替换为ykyy017，处方如下：
[0184]
表2：对比例1的组分表
[0185][0186]
制备工艺：
[0187]
1)配液：
[0188]
先将磷酸二氢钠及磷酸氢二钠加入适量的10～30℃温度下体积占比20％～80％的注射用水中，再加入药物活性成分ykyy017搅拌溶解至溶解，再加入氯化钠、甘露醇搅拌溶解后，加入剩余注射用水定容或定重至全量，搅拌均匀。
[0189]
2)过滤：药液经一道0.45μm聚醚砜滤芯，再经过一道0.22μm聚醚砜滤芯精滤至缓冲罐。
[0190]
3)灌装：将药液灌装至10ml西林瓶内。
[0191]
4)冻干
[0192]
5)轧盖
[0193]
6)灭菌注射用水制备：将2ml注射用水灌装入塑料聚丙烯安瓿，121℃12min灭菌。
[0194]
7)吸入使用时，将步骤5)冻干轧盖后的ykyy017加入步骤6)注射用水复溶后装入雾化杯使用。
[0195]
实验例1：稳定性
[0196]
在温度和湿度条件下25℃
±
2℃/60％rh
±
5％rh的分别考察不同实施例样品加速6月的有关物质总杂含量数据作为稳定性考察的依据，结果如下：
[0197]
表3：稳定性数据
[0198]
[0199][0200]
结果分析：
[0201]
实施例1的样品0天的有关物质总杂为1.28％，加速6月之后的总杂为1.63％，未超过5.0％，增长量为0.35％，稳定性较好。
[0202]
不加缓冲对的实施例2的样品0天的有关物质总杂为2.44％，加速6月之后的总杂为5.12％，超过5.0％，增长量为2.68％，稳定性差于实施例1，原因是不加缓冲对，只加盐酸或氢氧化钠调节的注射液的ph不稳定，在稳定性放样期间，ph值不断增加，导致有关物质量增加。
[0203]
加不同缓冲对的是实施例3的方法1～4的样品0天的有关物质总杂分别为1.29％、1.22％、1.34％、1.33％与实施例1的1.28％无显著差异，放置加速6月后分别为1.86％、1.83％、1.89％、1.78％，均小于5.0％，增长量分别为0.57％、0.61％、0.55％、0.45％，与实施例1相比无显著性差异。
[0204]
针对缓冲对的顺序，先加碱性缓冲对的实施4的方法1、方法3和方法4在配制过程中发现，先加入碱性缓冲对，再加ykyy017原料药，出现絮状物，搅拌不溶解的现象。
[0205]
实施例4方法2缓冲盐的加入顺序为：酸性与碱性缓冲盐一起加入，再加入ykyy017，溶解现象为ykyy017溶解不完全，溶液不澄清，絮状物析出。
[0206]
ph分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的实施例5的方法1～7样品的0天有关物质总杂分别为1.88％、1.38％、1.31％、1.31％、1.35％、2.54％、2.76％，加速6月之后分别为4.44％、2.03％、1.86％、1.95％、2.45％、6.68％、7.17％，分别增长为2.56％、0.65％、0.55％、0.64％、1.10％、4.14％、4.41％。ph2.0的实施例5的方法1和ph7.0、ph8.0的实施例5的方法6和7的样品的0天有关物质总杂、加速6月之后的有关物质总杂及增长量均大于实施例1和ph3.0～6.0的实施例5的方法2～5。
[0207]
不加赋形剂实施例6的0天的有关物质总杂为1.62％、加速6月之后为5.19％，增长量为3.57％。赋形剂及稳定性分别为海藻糖、葡萄糖、右旋糖酐、乳糖的实施例7的方法1～4的0天的有关物质总杂分别为1.27％、1.32％、1.28％、1.48％，加速6月之后分别为1.85％、1.88％、1.83％、5.83％，分别增长0.58％、0.56％、0.55％、4.35％。由此可知不加赋形剂或者赋形剂为乳糖的实施例与赋形剂分别为甘露醇(实施例1)、海藻糖(实施例7方法1)、葡萄糖(实施例7方法2)、右旋糖酐(实施例7方法3)相比，稳定性会大大降低。
[0208]
对比例1发现配制过程中ykyy017溶解现象为ykyy017溶解不完全，溶液不澄清，絮状物析出。
[0209]
实验例2：空气动力学粒径分布(aerodynamic particle size distribution，apsd也称雾滴分布)
[0210]
药物气溶胶颗粒被吸入后，由于性质(大小、密度)不同，在各部位沉积、溶解、扩散等行为也会不同。较大的药物气溶胶颗粒大部分沉积在上呼吸道黏膜，药物气溶胶颗粒太小时则可能在进入肺泡后再经呼气排出，两者均不会形成肺沉积。其中粒径小于5μm的气溶胶颗粒可到达肺部，起效迅速，全身不良反应少。
[0211]
空气动力学粒径分布(aerodynamic particle size distribution，apsd也称雾滴分布)此项检测一般认为可反映已形成的药物雾滴在人体肺部环境中的粒径分布情况，有利于评估吸入药物在临床应用中安全性及有效性。理论上，利用该参数可以确定雾滴进入口腔并进入肺部的粒子比例，还可以预测雾滴在肺部可能发生沉积的位置。同时也是用来控制及评估产品质量的重要参数。
[0212]
参照《中国药典》2020年版四部通则0951吸入制剂微细粒子空气动力学特性测定法。将ngi撞击器与人工喉组装并置于5℃冷却装置中预冷90min，并在微孔收集器(micro-orifice collector，moc)放置滤膜，将ngi撞击器与真空泵连接。将人工喉与流量计连接，开启真空泵，调节流速为每分钟15l
·
min-1，取下流量计。依次连接压缩机、雾化器、口含器和适配器，再将适配器与人工喉连接。精密量取吸入用实施例溶液2ml，置雾化器中，开启压缩机并计时，60s后关闭压缩机，取下雾化器，关闭真空泵。在1～7级收集盘中收集并检测供试品溶液。
[0213]
对比微细粒子剂量检查数据计算空气动力学粒径分布(apsd)(吸入制剂评测数据分析软件)。将多级撞击器每一部分的药物沉积和空气动力学粒径(mmad)，几何标准偏差(gsd)、微细粒子分数(fpf)一并提交作为支持apsd一致性的证据。
[0214]
微细粒子剂量(fpd)：指随驱动从装置发射的、以小于规定极限的空气动力学粒径存在的活性剂的总质量。如果没有明确说明设定为其他的极限，通常将该极限设定为5μm。fpd是使用冲击器或碰撞器，例如两级碰撞器(tsi)、多级碰撞器(msi)、andersen级联碰撞计或下一代冲击器(ngi)来测量的。
[0215]
fpf：微细粒子分数；定义为微细粒子剂量在释放剂量中占的比例，即雾化产生的粒径小于5μm的药液占雾化出来药液的比例。
[0216]
mmad：质量中值空气动力学粒径；是指大于和小于该空气动力学直径的粒子质量各占总质量的一半，是衡量“平均”粒径的有效工具。
[0217]
gsd：几何标准偏差；是一个无量纲参数，为累积分布低于84.1％和15.9％粒子的空气动力学直径(μm)比值。
[0218]
使用英国科普利copley cientific公司的ngi设备检测各实施例在空气动力学粒径分布(aerodynamic particle zize distribution，apsd也称雾滴分布)结果如下：
[0219]
表4：空气动力学粒径分布(apsd)
[0220]
样品fpdfpf(％)mmad(μm)gsd实施例11.03mg63.7453.8541.704实施例20.88mg59.5464.0391.992实施例60.70mg45.3536.7971.699实施例7方法10.85mg58.5353.8661.704
实施例7方法20.88mg50.5464.8391.992实施例7方法30.80mg56.3532.7971.699实施例7方法40.65mg38.5356.8661.704实施例1068.05μg22.383.2322.401
[0221]
结论：实施例1、实施例2和实施例7方法1～3的雾化吸入给药后大部分的空气动力学粒径mmad均小于5μm，有利于药物进入肺部沉积。微细粒子剂量(fpd)大于0.8mg；微细离子分数(fpf)大于50％。
[0222]
不加赋形剂的实施例6和使用了乳糖的实施例7方法4的雾化吸入剂的空气动力学粒径mmad均大于5μm，微细粒子剂量(fpd)小于0.8mg；微细离子分数(fpf)小于50％，与其他实施例有显著性区别。
[0223]
实施例10气雾剂的空气动力学粒径mmad均小于5μm，有利于药物进入肺部沉积。
[0224]
实验例3：递送速率与递送总量评价
[0225]
递送总量是指装有规定体积药液的雾化杯通过雾化系统释出的药物质量或体积，将其转化为雾化药液总量的百分比，可为患者的预期剂量提供指导。递送速率是指装有规定体积药液的雾化杯单位时间内通过雾化系统释出的药物质量或体积，将其转化为雾化药液总量的百分比可以确定患者预期的治疗时间。递送速率与递送总量可以反映药物起效的速度及患者可能吸入的药物总量，同时也是用来控制及评估产品质量的重要参数。检测方法和装置为将雾化器和雾化液作为一个整体考虑，除另有规定外，只考察成人呼吸模式吸的药物递送速率与递送总量，但药品用于新生儿、婴儿或儿童时，必须选择相应的呼吸模式进行检测。
[0226]
表5：呼吸模拟器不同呼吸特性
[0227][0228]
递送剂量是指每剂量可供使用者(装置)使用的药物物质的量。加拿大卫生部建议申请人证明所交付剂量的差异以及对药品安全性和有效性的潜在影响。应讨论测试产品的潜在剂量不足和过量。鼓励在统计方法中分析测试数据，尽管在其指南中没有引用特定的统计方法。ema建议测试和参比制剂之间的目标递送剂量相似，特别是在
±
15％的差异范围内。美国fda在沙丁胺醇mdi和fp-sxdpi货架期的开始(b)中间(m)和结束(e)阶段接受单次致动内容(sac)测试。每个sac确定基于产品的一次致动。建议sac根据mdi的rld标签和dpi的三个流量率以一个流量进行测试。在dpi中，dpi设备的标记流量率将被选择为流量率之一，而另外两个等于标记流量率的
±
50％。建议将群体生物等效性(pbe)统计方法作为数据分析的工具来确定等效性。pbe分析的详细程序发表在fda针对雾化布地奈德吸入悬浮液的药物特异性生物等效性建议中。
[0229]
选择成人、儿童、婴儿呼吸模式的药物递送速率与递送总量，结果如下：
[0230]
表6：药物递送效果-成人模式
[0231][0232]
表7：药物递送效果-儿童模式
[0233][0234]
表8：药物递送效果-婴儿模式
[0235][0236][0237]
结论：雾化递送速率和递送总量结果可知，实施例1、与实施例7的方法1～3在不同模式下的递送速率和递送总量显著高于不加赋形剂的实施例6。同时加入乳糖作为赋形剂的实施例7的方法4相对实施例1的递送速率和递送总量均显著降低，因此乳糖不适合作为本发明雾化吸入制剂的赋形剂。
[0238]
实验例4：冻干质量评价
[0239]
为了探究不同赋形剂对冻干制剂质量的影响，对本发明实施例制备的冻干制剂的复溶时间、外观性状和溶液的澄清度等进行对比。结果如下：
[0240]
表9：冻干制剂的质量评价
[0241][0242]
结论：从上述结果可知，未加入冻干保护剂的实施例6与加入冻干保护剂的实施例1与实施例7的方法1～4、及实施例8方法1和2相比，冻干后样品略萎缩，复溶时间较长(接近2min)。
[0243]
本发明的吸入制剂成分简单、极易成型、复溶最快、递送效率高且递送剂量高、粒度较小肺部沉积比例高，能快速通过口鼻吸收直接作用在上下呼吸道，在呼吸道形成预防新冠病毒或其他冠状病毒入侵的第一线免疫屏障，可用于预防与治疗冠状病毒所致疾病。
[0244]
实验例5：体外药效
[0245]
体外评估本发明雾化吸入剂在g蛋白偶联受体、离子通道、转运体、激酶、酶和核激素受体等6类药理靶点上的潜在脱靶作用。单浓度点测试结果显示本发明雾化吸入剂对本次筛选选择的45个靶点(除herg和ar)没有明显的脱靶反应，进一步的ic50测试结果显示本发明雾化吸入剂对herg(ic50＝6.88μm)和ar(ic50＝3.03μm)的潜在脱靶风险较小。
[0246]
另外一个试验采用vero e6细胞，评价ykyy017细胞毒性，并计算cc50值。同时，细胞水平测定ykyy017对sars-cov-2(omicron ba.2变异株)的ic50值，计算治疗指数(ti＝cc50/ic50)。体外药效学研究表明，ykyy017对vero e6细胞有一定的毒性，但毒性较小，cc50为41.83μm。ykyy017对sars-cov-2(omicron ba.2变异株)有很好的抑制作用，ic50为0.41nm，ti指数为102024。详细结果见图1。
[0247]
实验例6：体内药效
[0248]
1)本试验考察了抗新冠病毒多肽ykyy017雾化吸入剂对叙利亚仓鼠感染sars-cov-2(omicron ba.2变异株)的预防作用。试验建立了sars-cov-2(omicron ba.2变异株)仓鼠感染模型，攻毒剂量为1
×
104tcid50/只。为探索多肽ykyy017雾化吸入剂对体内感染sars-cov2奥密克戎ba.2变异株的预防作用，随机分为6个组，分别为溶媒对照组，于攻毒前0.5h单次雾化吸入给予注射用水30min；预防组1、预防组2、预防组3和预防组4，分别于攻毒前0.5h、4h、8h和12h单次雾化吸入给予5mg/ml的ykyy017雾化吸入剂(实施例9方法2)30min；预防组5，于攻毒前8h单次雾化吸入给予10mg/ml的ykyy017雾化吸入剂(实施例1)30min，此后均不再给药。攻毒前第0天及攻毒后每天至实验终点检测动物的体重及体温，攻毒后第2天检测仓鼠肺组织病毒载量。试验结果表明，与溶媒对照组相比，2dpi时，预防雾化吸入ykyy017雾化吸入剂的各组均可显著降低仓鼠肺组织的病毒载量。
[0249]
综上所述，在本实验条件下，预防雾化吸入ykyy017雾化吸入剂可显著抑制sars-cov-2(omicron ba.2变异株)在仓鼠肺组织内的复制，对sars-cov2(omicron ba.2变异株)感染具有较好的预防作用。详细结果见图2。
[0250]
实施例3、实施例5方法2～5、实施例7方法1～3、实施例8、实施例9及实施例10均对sars-cov2(omicron ba.2变异株)感染具有较好的预防作用，结果未显示。
[0251]
2)试验采用了仓鼠进行ykyy017雾化吸入剂对肺炎的治疗作用。试验建立sars-cov-2(omicron ba.2变异株)仓鼠感染模型，攻毒剂量为1
×
104tcid50/只。为探索该药物的有效剂量随机分为3个组，具体为对照组(注射用水)；低剂量给药组(2mg/ml实施例9方法1)；高剂量给药组(5mg/ml实施例9方法2)。在攻毒后0.5h，分别雾化吸入注射用水、2mg/mlykyy017(实施例9方法1)与5mg/ml ykyy017(实施例9方法2)。雾化吸入时间每组均为30min，每日1次，分别进行连续给药3天以及5天研究。攻读后每天观察动物状态，直至给药结束。攻毒前第0天及攻毒后每天至实验终点检测动物体重，攻毒后第3天和第5天检测仓鼠肺组织的病毒载量以及病毒滴度，以及攻毒后第3天和第5天仓鼠解剖后进行肺组织病理学(he染色)检查。体内药效学研究表明，在攻毒后0.5h给予雾化吸入2mg/ml-5mg/ml的多肽ykyy017雾化吸入剂，可以显著地抑制sars-cov-2(omicron ba.2变异株)在叙利亚仓鼠体内的复制，并可以有效缓解sars-cov-2(omicron ba.2变异株)感染后引起的肺部病理损伤。详细结果见图3～图8。
[0252]
实施例3、实施例5方法2～5、实施例7方法1～3、实施例8、实施例9及实施例10均显著地抑制sars-cov-2(omicron ba.2变异株)在叙利亚仓鼠体内的复制，并可以有效缓解sars-cov-2(omicron ba.2变异株)感染后引起的肺部病理损伤，结果未显示。
[0253]
结论分析1：
[0254]
实施例1～3为考察ph缓冲对的影响，实施例2不加缓冲盐，实施例1和实施例3考察了不同ph缓冲对的影响，其稳定性如下:
[0255]
1-1、制剂ph缓冲对的种类区别
[0256]
表10：制剂ph缓冲对的种类区别
[0257][0258][0259]
1-2、稳定性结果对比
[0260]
表11：稳定性结果对比
[0261][0262]
结论：
[0263]
实施例2不添加ph缓冲对制备的样品0天的有关物质总杂为2.44％；加速6月之后的总杂为5.12％，超过5.0％的总杂质量标准要求，无法制备得到杂质含量符合要求的制剂产品；加速放置6个月后，杂质含量呈现显著增长的趋势，增长量为2.68％，稳定性差。导致上述结果的原因是没有添加缓冲对，仅采用盐酸或氢氧化钠调节注射液的ph不稳定，在稳定性放样期间，ph值不断增加，导致有关物质量增加。
[0264]
实施例1采用柠檬酸-柠檬酸钠作为ph缓冲对进行添加，制备的样品0天的有关物质总杂为1.28％，加速6月之后的总杂为1.63％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)；加速放置后，杂质含量无明显变化，增长量仅为0.35％，稳定性良好且显著。
[0265]
实施例3的方法1～4分别采用醋酸-醋酸钠、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠、酒石酸-酒石酸钠、碳酸氢钠-碳酸钠作为ph缓冲对，0天的有关物质总杂分别为1.29％、1.22％、1.34％、1.33％，与实施例1无显著差异；放置加速6月后，总杂含量分别为1.86％、1.83％、1.89％、1.78％，杂质含量增长量均控制在0.45～0.61％范围内，均低于5.0％总杂质量标准要求，稳定性优异。
[0266]
小结：
[0267]
1、相较于不加ph缓冲对(例如，实施例2)，加入ph缓冲对(例如，实施例1和实施例3方法1～4)制备的吸入制剂的稳定性大大增加，具体表现在：
[0268]
加速后的总杂低至1.63～1.89％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)；且加速放置后杂质增长量控制在0.35～0.61％，稳定性良好且显著；相较于未添加ph缓冲对，加速后杂质增长量降低了2.07～2.33％；
[0269]
2、采用本发明的ph缓冲对(例如，实施例1柠檬酸-柠檬酸钠和实施例3方法1～4醋酸-醋酸钠、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠、酒石酸-酒石酸钠、碳酸氢钠-碳酸钠)制备的吸入制剂的稳定性良好，具体表现在：
[0270]
加速后的总杂为1.63～1.89％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)；且加速放置后杂质增长量控制在0.35～0.61％，稳定性良好且显著；
[0271]
3、采用柠檬酸-柠檬酸钠作为ph缓冲对(例如，实施例1)制备的吸入制剂的稳定性最优，具体表现在：
[0272]
加速后的总杂为1.63％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)，且加速放置后杂质增长量仅为0.35％，稳定性最好。
[0273]
结论分析2：
[0274]
实施例4为考察ph缓冲对的加入顺序的影响，考察其稳定性如下：
[0275]
2-1、制剂ph缓冲对的加入顺序区别
[0276]
表12：制剂ph缓冲对的加入顺序区别
[0277]
实施例ph缓冲对种类实施例1柠檬酸-api-柠檬酸钠实施例4方法1柠檬酸钠-api-柠檬酸实施例4方法2柠檬酸-柠檬酸钠-api实施例4方法3醋酸钠+api+醋酸实施例4方法4磷酸氢二钠+api+磷酸二氢钠
[0278]
2-2、稳定性结果对比
[0279]
表13：稳定性结果对比
[0280][0281][0282]
结论：
[0283]
实施例1中ph缓冲对的加入顺序为：先加入ph缓冲对中酸性物质，再加入api(ykyy017)，再加ph缓冲对中碱性物质，ykyy017溶解完全，溶液澄清，无絮状物析出。并且加速后的总杂为1.63％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)；且加速放置后杂质增长量仅为0.35％，稳定性良好。
[0284]
实施例4方法1～4中ph缓冲盐加入顺序为：先加入ph缓冲对中碱性物质，再加入ykyy017，再加ph缓冲对中酸性物质(实施例4方法1、3和4)；或者采用先加入ph缓冲对最后加入ykyy017(实施例4方法2)；上述加入顺序的工艺中，ykyy017均不能完全溶解，溶液不澄清，絮状物析出，无法进行后续的冻干制备过程。
[0285]
小结：
[0286]
1、采用本发明的ph缓冲对加入顺序，即ph缓冲对中酸性物质-药物活性成分-ph缓冲对中碱性物质(例如，实施例1)，制备的吸入制剂的稳定性最优，具体表现在：
[0287]
药物活性成分溶解完全，溶液澄清，无絮状物析出；并且加速后的总杂为1.63％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)；且加速放置后杂质增长量仅为0.35％，稳定性良好；
[0288]
2、采用其他ph缓冲对的加入顺序(例如实施例4方法1～4)，药物活性成分均不能完全溶解，溶液不澄清，絮状物析出，无法进行后续的冻干制备过程。
[0289]
结论分析3：
[0290]
实施例5为考察采用ph调节剂调节药液至不同ph的影响，考察其稳定性如下：
[0291]
3-1、ph的区别
[0292]
表14：ph的区别
[0293]
实施例ph实施例13.7实施例5方法12.0实施例5方法23.0实施例5方法34.0实施例5方法45.0实施例5方法56.0实施例5方法67.0实施例5方法78.0
[0294]
3-2、稳定性结果对比
[0295]
表15：稳定性结果对比
[0296][0297]
总结：
[0298]
实施例1的ph调节为3.7，制备的样品0天的有关物质总杂为1.28％，加速6月之后的总杂为1.63％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)；加速放置后，杂质含量无明显变化，增长量仅为0.35％，稳定性良好且显著。
[0299]
实施例5的方法2～5采用ph调节剂调节ph分别为3.0、4.0、5.0、6.0，样品0天有关物质总杂为1.31～1.38％，与实施例1无显著性差异；放置加速6月之后，总杂含量为1.86～2.45％，均未超过5.0％的质量标准要求；有关物质总杂略有增长，杂质增长量控制在0.55～1.1％，增长程度不明显，稳定性良好。
[0300]
实施例5的方法1采用ph调节剂调节ph为2.0，样品0天有关物质总杂为1.88％，与实施例1有显著性差异，较实施例1相比有关物质总杂显著增长；放置加速6月之后，有关物质总杂为4.44％，接近5.0％的质量标准要求，增长了2.56％，增长速度较快，稳定性差，无法制备合格的吸入制剂。
[0301]
实施例5的方法6和7采用ph调节剂调节ph为7.0和8.0，样品0天有关物质总杂为2.54％、2.76％，与实施例1有显著性差异，有关物质总杂显著增长，放置加速6月之后，有关物质总杂为6.68％和7.17％，显著高于5.0％的质量标准要求，杂质增长量分别为4.14％和4.41％，杂质增长量显著升高，稳定性差，无法制备合格的吸入制剂。
[0302]
小结：
[0303]
1、采用ph调节剂调节ph为3.0～6.0(例如，实施例1、实施例5方法2～5)，制备的吸入制剂的稳定性良好，具体表现在：
[0304]
新鲜制备的样品有关物质总杂为1.28～1.38％，；加速后的总杂为1.63～2.45％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)；且加速放置后杂质增长量控制在0.35～1.1％，稳定性良好；
[0305]
2、调节ph为3.7时(例如，实施例1)制备的吸入制剂的稳定性最佳，具体表现在：
[0306]
加速后的总杂为1.63％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)；且加速放置后杂质增长量仅为0.35％，稳定性最好。
[0307]
3、采用本发明范围外的ph(例如，实施例5方法1ph2.0、方法6～7ph7.0或8.0)，无法制备稳定性合格的吸入制剂产品；具体表现在：
[0308]
新鲜制备样品的有关物质总杂、加速6月之后的有关物质总杂及增长量，均显著增加，并且远高于总杂含量限定标准(≤5.0％)。
[0309]
结论分析4：
[0310]
实施例1和7考察不同赋形剂的影响，实施例6不加赋形剂。考察其稳定性及空气动力学粒径分布、递送速率与递送总量评价如下：
[0311]
4-1、制剂赋形剂的种类区别
[0312]
表16：制剂赋形剂的种类区别
[0313]
实施例赋形剂种类实施例1甘露醇实施例6未加赋形剂实施例7-方法1海藻糖实施例7-方法2葡萄糖实施例7-方法3右旋糖酐实施例7-方法4乳糖
[0314]
4-2、稳定性结果对比
[0315]
表17：稳定性结果对比
[0316][0317]
4-3、冻干制剂的质量评价
[0318]
表18：冻干制剂的质量评价
[0319][0320]
4-4、空气动力学粒径分布结果对比
[0321]
表19：空气动力学粒径分布结果对比
[0322]
样品fpdfpf(％)mmad(μm)gsd实施例11.03mg63.7453.8541.704实施例60.70mg45.3536.7971.699实施例7方法10.85mg58.5353.8661.704实施例7方法20.88mg50.5464.8391.992实施例7方法30.80mg56.3532.7971.699实施例7方法40.65mg38.5356.8661.704
[0323]
4-5、药物递送速率与递送总量-成人模式
[0324]
表20：药物递送速率与递送总量-成人模式
[0325][0326]
4-6、药物递送速率与递送总量-儿童模式
[0327]
表21：药物递送速率与递送总量-儿童模式
[0328][0329]
4-7、药物递送速率与递送总量-婴儿模式
[0330]
表22：药物递送速率与递送总量-婴儿模式
[0331][0332]
总结：
[0333]
1、稳定性
[0334]
实施例1中添加甘露醇作为赋形剂时，制备的样品0天的有关物质总杂为1.28％，加速6月之后的总杂为1.63％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)；加速放置后，杂质含量无明显变化，增长量仅为0.35％，稳定性良好且显著。
[0335]
实施例6不加赋形剂条件下，0天的有关物质总杂为1.62％，有关物质总杂显著大于实施例1，加速6月之后为5.19％，超过质量标准5.0％的要求，有关物质总杂增长量为
3.57％，杂质含量增加显著，稳定性差。
[0336]
实施例7方法1～3中分别采用海藻糖、葡萄糖、右旋糖酐作为赋形剂，0天有关物质总杂为1.27～1.32％，与实施例1无显著性差异；放置加速6月之后，有关物质总杂为1.83～1.88％，远小于质量标准5.0％的要求，杂质增长量低，控制在0.55～0.58％范围内，稳定性较好。
[0337]
实施例7方法4的赋形剂为乳糖，0天有关物质总杂为1.48％，高于实施例1的杂质含量；并且，放置加速6月之后，有关物质总杂增长为5.83％，超过质量标准5.0％的要求，无法制备合格的制剂产品；总杂含量呈现显著增加，增长量高达为4.35％。
[0338]
通过加入特定的赋形剂之后不仅冻干成型好，稳定性也大大提高，因为糖类物质赋形剂的氢键可与多肽大分子氨基或羧基结合，有助于多肽稳定性的提高。
[0339]
小结：不加赋形剂的本实施例其稳定性要远远差于加入赋形剂的本发明实施例，但赋形剂为乳糖的实施例7方法4的样品稳定性未见明显改善，与未加赋形剂的实施例6未有显著性差异。
[0340]
2、冻干制剂质量评价
[0341]
实施例1赋形剂为甘露醇，其样品性状为类白色蛋糕状、疏松细腻块状物，复溶时间为28s，复溶时间快，复溶后溶液澄清，复溶效果良好且显著。
[0342]
实施例6未加入赋形剂的样品冻干后性状为类白色块状物、萎缩，复溶时间为121s，超过2min，复溶效果差。
[0343]
实施例7方法1～3分别采用海藻糖、葡萄糖、右旋糖酐作为赋形剂，其样品性状为类白色蛋糕状、疏松细腻块状物，复溶时间为28～35s，复溶时间较快，复溶后溶液澄清，复溶效果良好。
[0344]
实施例7方法4赋形剂为乳糖，其样品性状为类白色蛋糕状、疏松细腻块状物，复溶时间为55s，复溶时间较长，复溶效果差。
[0345]
3、空气动力学粒径分布：
[0346]
实施例1(赋形剂为甘露醇)、和实施例7方法1～3(赋形剂分别为海藻糖、葡萄糖、右旋糖酐)的雾化吸入给药后大部分的空气动力学粒径mmad分别为3.854μm、3.866μm、4.839μm、2.797μm均小于5μm，有利于药物进入肺部沉积。微细粒子剂量(fpd)分别为1.03mg、0.85mg、0.88mg、0.80mg，药物微细粒子剂量大，均大于0.8mg；微细离子分数(fpf)为63.754％、58.535％、50.546％、56.353％大于50％；表明进入肺部的药物粒子较多。
[0347]
实施例6不加赋形剂和实施例7方法4使用乳糖作为赋形剂的雾化吸入剂的空气动力学粒径mmad分别为6.797μm、6.866μm均大于5μm；粒径显著增加，无法进入肺部有效沉积。微细粒子剂量(fpd)分别为0.70mg、0.65mg，药物微细粒子剂量小，均小于0.8mg；微细离子分数(fpf)分别为45.353％、38.535％小于50％，较实施例1显著降低，表明进入肺部的药物粒子少。
[0348]
4、雾化递送效果
[0349]
实施例1(赋形剂为甘露醇)、和实施例7方法1～3(赋形剂分别为海藻糖、葡萄糖、右旋糖酐)在成人模式、儿童模式和婴儿模式等不同模式下的递送速率和递送总量以及雾化总量在可雾化总量中所占的比例显著高于实施例6(不加赋形剂)。
[0350]
成人模式下，实施例1(赋形剂为甘露醇)的递送速率为964.5μg/min，递送总量为
8410.54μg，雾化总量占可雾化总量的比例为42.05％。实施例6(不加赋形剂)的递送速率为701.8μg/min，递送总量为6054.78μg，雾化总量占可雾化总量的比例为30.27％。
[0351]
二者相比，实施例6(不加赋形剂)条件下，比实施例1(赋形剂为甘露醇)递送速率降低了262.7μg/min，递送总量降低了2355.76μg，占可雾化总量的比例下降了11.78％，递送效果呈现大幅度降低。
[0352]
实施例7方法1～3(赋形剂分别为海藻糖、葡萄糖、右旋糖酐)递送速率高达814～862μg/min，递送总量约为7023～7204μg，雾化总量占可雾化总量的比例约为35～36％。采用甘露醇、海藻糖、葡萄糖和右旋糖酐作为赋形剂，制备得到的制剂递送效果和雾化效果优异。
[0353]
实施例7方法4(以乳糖作为赋形剂)相对实施例1(以甘露醇作为赋形剂)的递送速率(下降达400μg/min以上)和递送总量(下降达4000μg以上)以及雾化总量在可雾化总量中所占的比例(下降达20％以上)均显著降低，递送效果和雾化效果变差。因此，乳糖不适合作为本发明雾化吸入制剂的赋形剂。
[0354]
同理，包括儿童模式和婴儿模式在内的其他模式，均展现出以上差异规律。
[0355]
小结
[0356]
1、采用甘露醇、海藻糖、葡萄糖和右旋糖酐作为赋形剂(例如，实施例1、实施例7方法1～3)，制备的吸入制剂稳定性、复溶效果、吸入特性良好，并且在不同模式均显现出优异的递送效果；具体表现在：
[0357]
1-1)0天有关物质总杂为1.27～1.32％，放置加速后，有关物质总杂为1.63～1.88％，远小于质量标准5.0％的要求，杂质增长量低，控制在0.35～0.58％范围内，稳定性良好。
[0358]
1-2)样品性状为类白色蛋糕状、疏松细腻块状物，复溶时间为28～35s，复溶时间较快，复溶后溶液澄清，复溶效果良好。
[0359]
1-3)空气动力学粒径均小于5μm，有利于药物进入肺部沉积；微细粒子剂量均大于0.8mg；微细离子分数大于50％；表明进入肺部的药物粒子较多。
[0360]
1-4)在不同模式下的递送速率和递送总量以及雾化总量在可雾化总量中所占的比例均呈现较高趋势，递送效果表现良好。
[0361]
2、采用甘露醇作为赋形剂(例如，实施例1)，制备的吸入制剂稳定性、复溶效果、吸入特性最好，并且在不同模式的递送效果和雾化效果最优；具体表现在：
[0362]
2-1)加速后的总杂为1.63％，显著低于杂质含量限度标准(≤5.0％)；且加速放置后杂质增长量仅为0.35％，稳定性最好。
[0363]
2-2)样品性状为类白色蛋糕状、疏松细腻块状物，复溶时间最快达28s，复溶后溶液澄清，复溶效果良好且显著。
[0364]
2-3)空气动力学粒径低至3.854μm远小于5μm，有利于药物进入肺部沉积；微细粒子剂量为1.03mg，大于0.8mg；微细离子分数为63.754％、大于50％；表明进入肺部的药物粒子较多。
[0365]
2-4)在不同模式下的递送速率和递送总量以及雾化总量在可雾化总量中所占的比例均显著高于其他水平，递送效果最优。
[0366]
3、不添加赋形剂或者采用本发明范围外的赋形剂(例如，实施例6不添加赋形剂、
实施例7方法4乳糖作为赋形剂)，制备的吸入制剂的无法制备稳定性和复溶效果合格的制剂产品；并且吸入特性差，递送效果和雾化效果差；具体表现在：
[0367]
3-1)不添加赋形剂或者采用本发明范围外的赋形剂，0天的有关物质总杂高达1.62％，加速后有关物质总杂增长量为5.19～5.83％，明显超过质量标准5.0％的要求，杂质含量增加显著，稳定性差；无法制备合格的制剂产品；
[0368]
3-2)未加入赋形剂的样品冻干后性状为类白色块状物、萎缩，复溶时间延长至121s，超过2min，复溶效果差。
[0369]
3-3)雾化吸入剂的空气动力学粒径增加至约6.7～6.8μm，均大于5μm；药物微细粒子均小于0.8mg；微细离子分数(fpf)小于50％，粒径显著增加，进入肺部的药物粒子少或无法进入肺部有效沉积。
[0370]
3-4)递送速率和递送总量以及雾化总量在可雾化总量中所占的比例均显著降低，递送效果和雾化效果变差。
[0371]
结论分析5：
[0372]
基于实施例1和实施例8方法1和方法2不同赋形剂用量，考察其复溶效果和外观形状：
[0373]
5-1、药物活性成分含量
[0374]
表23：药物活性成分含量
[0375]
实施例赋形剂用量mg/支实施例160实施例8方法120实施例8方法2140
[0376]
5-2、冻干制剂的质量评价
[0377]
表24：冻干制剂的质量评价
[0378][0379]
1、冻干制剂质量评价
[0380]
实施例1赋形剂甘露醇的用量分别为60mg/支，其样品性状为类白色蛋糕状、疏松细腻块状物，复溶时间为28s，复溶时间快，复溶后溶液澄清，复溶效果良好且显著。
[0381]
实施例8方法1和2的赋形剂甘露醇的用量分别为20mg/支、140mg/支，其样品性状均为类白色蛋糕状、疏松细腻块状物，复溶时间分别为78s、35s，复溶时间虽然略有增加，但仍符合复溶要求，并且复溶后溶液仍保持澄清。
[0382]
因此，赋形剂用量在20～140mg/支(即，10～70mg/ml)范围内的制剂，均能制备出复溶效果显著的产品。
[0383]
结论分析6：
[0384]
比较本技术(以实施例1和实施例3、5和7为代表)与对比例1(参照专利cn114533706b的一种用于防治呼吸道疾病的雾化吸入制剂及其应用中的专利处方，将抗病毒活性因子替换为ykyy017)制备的吸入制剂的稳定性差异。
[0385]
表25：吸入制剂的稳定性
[0386][0387][0388]
结果分析：
[0389]
实施例1制备的样品0天的有关物质总杂为1.28％，加速6月之后的总杂为1.63％，显著低于杂质含量限度标准(5.0％)；加速放置后，杂质含量无明显变化，增长量仅为0.35％，稳定性良好且显著。
[0390]
实施例3方法1、实施例5方法2和实施例7方法1中0天的有关物质总杂为1.27～1.38％，有关物质与实施例1相差较小；加速6月之后增加至1.85～2.03％，仍低于质量标准5.0％的要求，有关物质总杂增长量控制在0.5～0.6％左右，稳定性良好。
[0391]
对比例1发现配制过程中ykyy017溶解现象为ykyy017溶解不完全，溶液不澄清，絮状物析出，无法进行后续的吸入制剂的制备。
[0392]
因此，对比例1的处方和制备方法均不适用于本技术的吸入制剂的制备。

技术特征：
1.一种吸入制剂，其中，药物活性成分包括多肽。2.根据权利要求1所述的吸入制剂，其中，所述多肽包括20～60个氨基酸。3.根据权利要求1或2所述的吸入制剂，其中，所述多肽用于治疗冠状病毒导致的感染。4.根据权利要求1～3任一项所述的吸入制剂，其中，还包括ph缓冲对和溶剂。5.根据权利要求4所述的吸入制剂，其中，所述吸入制剂的ph＝3.0～6.0；优选地ph＝3.0～4.0；更优选地ph＝3.7。6.根据权利要求4或5所述的吸入制剂，其中，还包括赋形剂。7.根据权利要求6所述的吸入制剂，其中，包括药物活性成分、ph缓冲对、赋形剂和冻干溶剂，吸入制剂的ph＝3.0～6.0。8.根据权利要求4～7任一项所述的吸入制剂，其中，所述ph缓冲对选自酸性物质和碱性物质的组合；所述酸性物质选自以下中的一种或多种：柠檬酸、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、醋酸、酒石酸、乳酸、谷氨酸、马来酸、琥珀酸、tris缓冲盐、盐酸、硫酸；所述碱性物质选自以下中的一种或多种：柠檬酸钠、碳酸钠、磷酸氢二钠、醋酸钠、酒石酸钠、乳酸钠、甘氨酸、tris缓冲盐、氢氧化钠、氢氧化钾。9.根据权利要求8所述的吸入制剂，其中，所述ph缓冲对选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲对。10.根据权利要求8或9所述的吸入制剂，其中，所述ph缓冲对的加入顺序为：酸性物质在碱性物质之前。11.根据权利要求10所述的吸入制剂，其中，所述加入顺序依次为：酸性物质、药物活性成分、碱性物质。12.根据权利要求6～11任一项所述的吸入制剂，其中，所述赋形剂选自：葡萄糖、海藻糖、蔗糖、右旋糖酐、山梨醇、甘露醇、木糖醇、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙中的任意一种或多种，优选为甘露醇。13.根据权利要求7～12任一项所述的吸入制剂，其中，所述冻干溶剂选自注射用水、氯化钠溶液或葡萄糖溶液。14.根据权利要求1～13任一项所述的吸入制剂，其中，药物活性成分占吸入制剂的重量比为0.1％～10％，优选0.2％～2％。15.根据权利要求6～14任一项所述的吸入制剂，其中，所述赋形剂占吸入制剂的重量比为1％～30％，优选2％～10％。16.根据权利要求3～15任一项所述的吸入制剂，其中，所述多肽为式(i)所示的化合物或其药用盐或其衍生物；x1为氨基端保护基团或不存在；优选地，氨基端保护基团为酰基；更优选地，酰基为乙酰基(ac-)；x2为多肽，氨基酸序列为(eaaak)n或a[(eaaak)n]a；n为5以下的自然数，表示eaaak序列的重复次数；优选地，x2为eaaak；
x3为赖氨酸或半胱氨酸或2,3-二氨基丙酸或鸟氨酸或2,4-二氨基丁酸或2,7-二氨基庚酸；优选地，x3为赖氨酸；x4为修饰于x3的亲脂性化合物基团；优选地，亲脂性化合物为胆固醇琥珀酸单酯(chol)或硬脂酰氯；更优选地，亲脂性化合物为胆固醇琥珀酸单酯(chol)；x5为羧基端保护基团或不存在；优选地，羧基端保护基团为氨基(-nh2)。17.根据权利要求16所述的吸入制剂，其中，所述多肽包括ykyy017，其肽序列为：ac-svvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikeaaakk(chol)-nh2。18.根据权利要求1～17任一项所述的吸入制剂，其中，所述多肽的合成方法如下：a)选用树脂从碳端到氮端依次按照顺序偶联所有氨基酸，固相合成全保护多肽；优选采用rink amide-mbha resin；b)选择性脱除lys的侧链保护基；优选采用肼作为催化剂，选择性脱除所述侧链保护基；c)在偶联剂存在条件下偶联侧链胆固醇琥珀酸单酯；d)在裂解剂存在条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护得到所述多肽。19.一种权利要求1～18中任一项所述的吸入制剂的制备方法，其包括如下步骤：1)配液：将ph缓冲对中酸性物质、药物活性成分、ph缓冲对中碱性物质依次溶于冻干溶剂中，然后调节ph＝3.0～6.0，加入冻干溶剂至全量；2)冻干；3)吸入制剂的制备：将步骤2)得到的冻干产品溶于复溶溶剂中，得到吸入制剂；优选地，在步骤1)配液之后、步骤2)冻干之前，还包括步骤i)过滤和/或ii)灌装；优选地，在步骤2)冻干之后、步骤3)吸入制剂的制备之前，还包括步骤a)轧盖和/或b)复溶溶剂的制备。20.根据权利要求19所述的制备方法，其中，在所述步骤1)调节ph后，加入复溶溶剂之前，添加赋形剂。21.根据权利要求19或20所述的制备方法，其中，所述复溶溶剂选自注射用水、氯化钠溶液或葡萄糖溶液。22.根据权利要求19～21任一项所述的制备方法，其中，所述吸入制剂的剂型包括雾化吸入溶液、吸入气雾剂。23.一种权利要求1～18中任一项所述的吸入制剂在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染药物中的用途。

技术总结
本发明涉及一种高效广谱的抗冠状病毒多肽的吸入制剂及其制备方法。制备的吸入制剂稳定性、复溶效果、吸入特性良好，并且在不同模式的递送效果和雾化效果最优；具有生物利用度高、便于携带、给药方便、无污染的特点；并且制备方法简单，宜于工业化生产，有良好的应用价值。值。


技术研发人员：宋更申 欧阳旭 刘超
受保护的技术使用者：北京悦康科创医药科技股份有限公司
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/9/23