一种KT65-噬菌体的免疫筛选方法

一种kt65-噬菌体的免疫筛选方法
技术领域
1.本发明涉及一种kt65-噬菌体的免疫筛选方法，属于免疫筛选技术领域。


背景技术：

2.噬菌体是病毒的一种，其特别之处是专以细菌为宿主，较为人知的噬菌体是以大肠杆菌为寄主的t2噬菌体。跟别的病毒一样，噬菌体只是一团由蛋白质外壳包裹的遗传物质，大部分噬菌体还长有“尾巴”，用来将遗传物质注入宿主体内。噬菌体是一种普遍存在的生物体，而且经常都伴随着细菌。
3.噬菌体的体积小，其形态有蝌蚪形、微球形和细杆形，以蝌蚪形多见。噬菌体是由核酸和蛋白质构成。蛋白质起着保护核酸的作用，并决定噬菌体的外形和表面特征。其核酸只有一种类型，即dna或rna，双链或单链，环状或线状。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种kt65-噬菌体的免疫筛选方法。
5.为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种kt65-噬菌体的免疫筛选方法，包括如下步骤：
6.s1：第一轮筛选噬菌体洗脱液；
7.s2：第一轮噬菌体洗脱液效价检测；
8.s3：第一轮噬菌体洗脱液的扩增；
9.s4：第一轮噬菌体纯化；
10.s5：第二、三轮筛选噬菌体洗脱液：
11.同步骤s1，输入噬菌体为第一轮筛选得到噬菌体子文库1ml，作为第二轮筛选输入噬菌体文库，得到第二轮筛选噬菌体洗脱液；
12.s6：第二、三轮噬菌体洗脱液效价检测：
13.同步骤s2；
14.s7：第二、三轮噬菌体洗脱液的扩增、纯化：
15.同步骤s3-s4，得到第二轮筛选噬菌体子文库；
16.s8：第二、三轮筛选噬菌体子文库效价检测：
17.同步骤s2；
18.s9：单克隆elisa检测；
19.s10：阳性克隆elisa二次验证：
20.同步骤s9；
21.s11：阳性克隆测序；
22.s12：序列分析：
23.经测序的序列使用gentle软件进行序列比对分析，并使用gentle软件将抗体序列
翻译成氨基酸。
24.优选的，步骤s1具体为：
25.s1.1：从-80℃冰箱中取出筛选抗原，冰上放置解冻；
26.s1.2：将筛选抗原包被免疫管(50μg/管，包被液为pbs，2ml/管)，4℃缓慢旋转过夜，同时平行包被50μg bsa作对照；
27.s1.3：将过夜包被的免疫管中的液体弃掉，加入2ml pbs缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5min；
28.s1.4：加入2ml封闭液(3％bsa)溶液，室温旋转封闭1h；
29.s1.5：将封闭后的免疫管中液体丢弃，并加入2ml pbst缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5min；
30.s1.6：弃掉免疫管中的清洗液，加入2ml 3％脱脂奶粉，按照下列公式计算并加入制备的噬菌体文库作为第一轮筛选输入噬菌体文库，室温旋转孵育2h：
[0031][0032]
其中，v为加入的噬菌体体积(单位μl)，t
library
为噬菌体效价；
[0033]
s1.7：将免疫管内液体弃掉，加入2ml pbst(1
×
pbs加0.1％ tween20，下同)缓冲液室温清洗免疫管20次，每次旋转5min；
[0034]
s1.8：将免疫管内液体弃掉，尽量去除残余液体，加入1ml 0.25mg/ml trypsin溶液，室温旋转洗脱30min；
[0035]
s1.9：加入10μl 10％aebsf终止洗脱，将免疫管中的溶液转移至新的1.5ml离心管中，即为第一轮筛选噬菌体洗脱液。
[0036]
优选的，步骤s1.6中所述的噬菌体文库的制备方法具体为：
[0037]
s1.6.1：rna提取和反转录；
[0038]
s1.6.2：pcr扩增，包括第一轮pcr扩增和第二轮pcr扩增；
[0039]
s1.6.3：载体与pcr产物酶切和连接；
[0040]
s1.6.4：细菌文库和噬菌体文库构建，包括验证连接产物转化率、细菌文库构建、噬箘体文库制备。
[0041]
优选的，步骤s1.6.1中所述的rna提取具体为：
[0042]
(1)将用trizol保存的外周血淋巴细胞转移至1.5ml的离心管，加入1/5体积的氯仿混匀；
[0043]
(2)室温静置5分钟后4℃12000g离心15分钟；
[0044]
(3)将离心后的上清液转移到新的离心管；
[0045]
(4)往新离心管中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀；
[0046]
(5)室温静置10分钟后4℃12000g离心10分钟；
[0047]
(6)使用1ml 75％乙醇清洗沉淀，4℃7500g离心5分钟后弃去上清，沉淀置于室温10分钟，微量乙醇挥发后，沉淀溶解于适量的无rna酶的水中，合并所有样品，即为提取得到的总rna，电泳对总rna质量进行分析，并测总rna浓度。
[0048]
优选的，步骤s1.6.1中所述的反转录具体为：使用takara反转录试剂盒对得到的总rna进行反转录。将上述总rna样品分为两份，一份使用试剂盒内的oligo dt primer作为
引物，另一份用试剂盒内的random 6-mers作为引物，按照反转录试剂盒说明书将上一步得到的总rna反转录成cdna，分别保存到2个离心管中。
[0049]
优选的，步骤s1.6.2中所述的第一轮pcr扩增具体为：
[0050]
(1)以cdna为模板进行第一轮pcr反应，使用taq dna polymerase hot start酶进行pcr扩增，为了确定最佳模板使用量，分别使用1μl，2μl，3μl，4μl，5μl的oligo dt primer和random 6-mer的cdna作为模板，按照下表配置pcr反应体系：
[0051]
试剂使用量cdna1-5μlcall001/call 0022μl/2μldntp mix4μl10
×
extaq buffer5μlhs ex taq0.25μlddh2oup to 50μl
[0052]
按照下表配置并进行pcr反应：
[0053]
循环温度时间步骤(1)98℃3min步骤(2)94℃50s 55℃30s 72℃40s/cycle 转到步骤(2)23cycles步骤(3)72℃5min步骤(4)4℃forever
[0054]
(2)反应结束后，取20μl pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，最终选取电泳结果中目的条带明显且片段大小为600bp的模板量为最佳模板量，将所有cdna按照此模板量在相同条件下进行pcr反应；
[0055]
(3)将所有pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的片段大小在600bp左右的目的条带；
[0056]
(4)将所有获得的cdna作为底物pcr后的纯化回收产物收集至一个离心管中，即为第一轮pcr扩增产物，-20℃保存。
[0057]
优选的，步骤s1.6.2中所述的第二轮pcr扩增具体为：
[0058]
(1)将第一轮pcr扩增产物作为模板进行第二轮pcr反应，为了确定最佳模板使用量，分别使用0.25μl，0.5μl，1μl，1.5μl，2μl，3μl作为模板，按照下表配置pcr反应体系：
[0059]
试剂使用量第一轮pcr回收产物0.25-3μlrvhh for/rvhh back2μl/2μldntp mix4μl10
×
extaq buffer5μlhs ex taq0.25μl
ddh2oup to 50μl
[0060]
按照下表配置并进行pcr反应：
[0061][0062][0063]
(2)反应结束后，取10μl pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，最终选取电泳结果中目的条带单一且片段大小为400bp的模板量为最佳模板量，将已获得的第一轮pcr扩增产物的1/10体积共200个反应按照此模板量并使用相同条件进行pcr反应后使用通用型dna纯化回收试剂盒对pcr反应液进行dna纯化；
[0064]
(3)将回收产物测定浓度后收集至一个离心管中，即为第二轮pcr扩增产物，同时取2μl用核酸浓度测量仪检测回收产物的浓度并记录，其余产物-20℃保存。
[0065]
优选的，步骤s1.6.3中的载体与pcr产物酶切具体为：
[0066]
(1)使用pcomb3xss作为噬菌体质粒载体，用spei和saci双酶切分别酶切14μg pcomb3xss载体和5μg第二轮pcr扩增纯化产物，37℃孵育4h；
[0067]
(2)使用dna回收纯化试剂盒对pcomb3xss载体和第二轮pcr扩增产物进行纯化，4℃保存。
[0068]
优选的，步骤s1.6.3中的连接具体为：
[0069]
(1)载体和片段进行连接，按照下表配制连接反应体系：
[0070]
试剂用量pcr产物1.6μg载体(pcomb3xss)4μgt4连接酶10μl10
×
t4 reaction buffer40μlddh2oup to 400μl
[0071]
(2)将连接反应4℃过夜(约16h)孵育；
[0072]
(3)使用通用型dna纯化回收试剂盒纯化连接反应液，检测回收产物的浓度，4℃保存。
[0073]
优选的，步骤s1.6.4中的验证连接产物转化率具体为：
[0074]
(1)取一支50μl的tg1感受态细菌在冰上放置5-10min，融化；
[0075]
(2)加入100ng连接产物，转移到已经预冷好的间距1mm的电转杯中，在电转仪中设定参数：1800v，1mm后，点击按钮电击转化；
[0076]
(3)等待电转完成后立即加入37℃预热好的soc培养液1ml，混匀后37℃，200rpm摇菌复苏1h；
[0077]
(4)从1ml复苏后的菌液中取100μl进行10倍梯度稀释并涂板，根据稀释倍数和单菌落数计算每个反应能获得的转化菌落数目，即为连接产物的转化效率；
[0078]
(5)同时随机挑选48个单克隆菌进行菌落pcr，pcr产物有在500bp左右的条带认为是阳性克隆，由此估算单克隆阳性率。
[0079]
优选的，步骤s1.6.4中的细菌文库构建具体为：
[0080]
(1)取20个100ng连接体系按上述方法使用20管感受态进行电转反应；
[0081]
(2)37℃复苏1h后从中取100μl进行10倍梯度稀释后涂板，37℃过夜培养；
[0082]
(3)收集剩下所有菌液并均匀涂布到5个245mm方形培养板(2
×
yt含有100μg/ml amp，2％glucose)中,37℃培养过夜；
[0083]
(4)根据稀释倍数和单菌落数计算所有反应能获得的转化菌落数目，即为细菌文库的库容量；
[0084]
(5)同时从梯度稀释板中随机挑选48个单克隆进行菌落pcr，验证细菌文库的克隆阳性率；
[0085]
(6)将过夜培养的245mm方形培养板菌落使用2
×
yt液体培养基洗下，置于50ml离心管，测量其od600值，添加终浓度20％甘油-80℃保存。
[0086]
优选的，步骤s1.6.4中的噬箘体文库制备具体为：
[0087]
(1)根据细菌文库的od600计算在100ml 2
×
yt液体培养基需要加入的细菌文库体积，根据计算结果接种细菌文库到100ml 2
×
yt液体培养基(含有100μg/ml amp)中，37℃，250rpm培养直至od600为0.5-0.55；
[0088]
(2)根据辅助噬菌体效价，按照1：20(细菌个数：辅助噬箘体数)的比例加入辅助噬菌体，37℃，250rpm孵育30-60min；
[0089]
(3)加入终浓度为50μg/ml的kana，30℃，250rpm过夜培养；
[0090]
(4)将过夜培养的菌液4℃，4000rpm离心20min，然后将离心后的上清液转移到新的50ml离心管中；
[0091]
(5)加入1/4的预冷peg/nacl混合均匀，进行沉淀，冰上静置孵育30min；
[0092]
(6)4℃，4000rpm离心20min后，弃上清，倒置控干2min；
[0093]
(7)加入1ml pbs重悬至新的离心管，4℃，12000rpm离心5min；
[0094]
(8)离心后转移上清至新的离心管中，再次加入1/4体积的预冷peg/nacl混合均匀，冰上孵育10min；
[0095]
(9)4℃，12000rpm，10min离心，弃上清，用1ml pbs重悬后，12000rpm离心2min，转移上清至新的离心管，测效价，-80℃保存，即为纯化后的噬菌体文库。
[0096]
优选的，步骤s2具体为：
[0097]
s2.1：将-80℃冰箱保存的tg1菌株在2
×
yt固体培养基(无抗性)进行单菌落划线，37℃过夜培养(4℃保存一周)，从单菌落板上挑取一个单菌落到5ml的2
×
yt培养基，37℃过夜培养；
[0098]
s2.2：取过夜培养菌液500μl转接到含5ml的2
×
yt液体培养基中，37℃，250rpm培养至od600为0.5-0.55；
[0099]
s2.3：取第一轮噬菌体洗脱液10μl，在1.5ml离心管中10倍梯度稀释，共稀释12个梯度，即将第一轮噬菌体洗脱液取10μl稀释至100μl，再从中取10μl稀释至100μl，依次类推，共稀释12个梯度至10-12
，振荡混匀；
[0100]
s2.3：在每个稀释离心管中加入90μl的ss320菌液，混匀后37℃孵育30min；
[0101]
s2.4：从每个稀释离心管中取5μl滴加到2
×
yt固体培养基(amp)中，37℃倒置过夜培养；
[0102]
s2.5：统计板上可以明显区分单菌落的稀释度的单菌落数量，并按照下面公式计算每毫升噬菌体溶液中噬菌粒的数量，即噬菌体文库效价：
[0103]
t(pfu/ml)＝n
×d×
400
[0104]
其中，t为噬菌体效价(单位pfu/ml)，d为稀释倍数，n为相应稀释倍数上单菌落个数。
[0105]
优选的，步骤s3具体为：
[0106]
s3.1：预先将-80℃冰箱保存的tg1菌株在2
×
yt固体培养基(无抗性)进行单菌落划线，37℃过夜培养(4℃保存一周)，从单菌落板上挑取一个单菌落到5ml的2
×
yt培养基，37℃过夜培养；
[0107]
s3.2：取过夜培养菌液500μl转接到含5ml含的2
×
yt液体培养基中，37℃，250rpm培养至od600值为0.5-0.55；
[0108]
s3.3：加入500μl第一轮筛选后得到的噬菌体洗脱液至od600为0.5-0.55的菌液中(剩余的洗脱液4℃保存)；
[0109]
s3.4：37℃，250rpm继续培养30min；
[0110]
s3.5：将全部菌液均匀涂布到含有100μg/ml amp和2％葡萄糖的2％琼脂糖的245mm方形培养基平板中，37℃过夜培养；
[0111]
s3.6：取过夜培养的方形板，在培养板表面加入6ml 2
×
yt液体培养基，用涂布棒轻轻将方形板菌落刮下并将菌液收集至15ml离心管中，即为扩增后的细菌子文库，同时使用分光光度计测量菌液od600值，即为洗脱液细菌文库od600值，加入终浓度为20％的甘油，即为第一轮细菌文库。
[0112]
s3.7：将洗脱液细菌文库根据下面公式计算出相应菌液量，转接至100ml2
×
yt液体培养基中(含100μg/ml amp)，以使初始od600为0.1：
[0113][0114]
其中，v为转接菌液的体积(单位μl)，od600为构建的洗脱液细菌文库的od600；
[0115]
s3.8：37℃，250rpm培养直至菌液od600达到0.5-0.55；
[0116]
s3.9：按照下面公式计算并加入辅助噬菌体m13k07以使细菌个数：噬菌体数＝1：20：
[0117][0118]
其中，v为加入辅助噬菌体的体积(单位ml)，t
helper-phage
为使用的辅助噬菌体效价，od600为菌液的od600值；
[0119]
s3.10：37℃，250rpm继续培养30min；
[0120]
s3.11：加入终浓度为50μg/ml kana，30℃，250rpm过夜培养。
[0121]
优选的，步骤s4具体为：
[0122]
s4.1：将过夜培养的菌液转移至新的50ml离心管中4000rpm，4℃离心10min；
[0123]
s4.2：将离心后的上清液转移至新的50ml离心管中，加入1/4体积的4℃预冷的
20％peg/2.5mnacl，充分混匀后冰上放置30min；
[0124]
s4.3：4000rpm，4℃离心20min，弃上清，并在纸上倒置2min；
[0125]
s4.4：加入1ml pbs重悬沉淀，将重悬液移至新的1.5ml离心管，13000rpm，4℃离心20min；
[0126]
s4.5：将离心后的上清转移至新的1.5ml离心管，加入1/4体积预冷的20％peg/2.5m nacl溶液，混匀后冰上放置10min；
[0127]
s4.6：13000rpm，4℃离心10min，弃上清，加入1ml pbs重悬沉淀；
[0128]
s4.7：13000rpm，4℃离心2min，将上清转移到新的1.5ml离心管中，即为第一轮筛选噬菌体子文库，100μl/管分装，长期-80℃保存，短期(1-2周)可于-20℃放置保存
[0129]
s4.8：第一轮筛选噬菌体子文库效价检测，同步骤s2。
[0130]
优选的，步骤s9具体为：
[0131]
s9.1：预先将-80℃冰箱保存的tg1菌株在2
×
yt固体培养基(无抗性)进行单菌落划线，37℃过夜培养(4℃保存一周)，从单菌落板上挑取一个单菌落到5ml的2
×
yt培养基，37℃过夜培养；
[0132]
s9.2：取过夜培养菌液500μl转接到含5ml的2
×
yt液体培养基中，37℃，250rpm培养至od600值为0.5-0.55；
[0133]
s9.3：取第二轮筛选后噬菌体洗脱液10μl，在1.5ml离心管中10倍梯度稀释，共稀释12个梯度，即将噬菌体文库取10μl稀释至100μl，再从中取10μl稀释至100μl，依次类推，共稀释12个梯度，振荡混匀；
[0134]
s9.4：每个稀释离心管中加入90μl od600值为0.5-0.55的菌液，混合均匀；
[0135]
s9.5：37℃，250rpm继续培养30min；
[0136]
s9.6：将菌液均匀涂布到含有100μg/ml amp的固体培养基平板，37℃过夜培养；
[0137]
s9.7：从过夜培养后的培养基平板中随机挑取单克隆菌落于无菌96孔细胞培养板(p1-p2)中，每孔加入200μl 2
×
yt培养基(含有100μg/ml amp)，37℃过夜静置培养；
[0138]
s9.8：取过夜培养的菌液2μl转接至每孔200μl 2
×
yt液体培养基(含有100μg/ml amp)的新96孔细胞培养板中，37℃静置培养3h，将转接前过夜培养的菌液4℃保存；
[0139]
s9.9：按照下面公式计算并每孔加入辅助噬菌体m13k07以使细菌个数：噬菌体数＝1：20：
[0140][0141]
其中，v为加入辅助噬菌体的体积(单位ml)，t
helper-phage
为使用的辅助噬菌体效价；
[0142]
s9.10：37℃孵育30min，加入终浓度为50μg/ml的kana，30℃静置过夜培养；
[0143]
s9.11：将过夜培养后的96孔培养板4℃，4000rpm离心10min，4℃保存备用；
[0144]
s9.12：将筛选抗原包被酶标板(1ng/μl，包被液为ph9.4的cbs，100μl/孔)，同时平行包被bsa作对照，4℃包被过夜；
[0145]
s9.13：将过夜包被的酶标板内液体弃掉，每孔加入200μl pbs缓冲液，室温清洗酶标板3次，每次10min；
[0146]
s9.14：每孔加入200μl封闭液(3％ bsa)封闭酶标板，室温封闭1h；
[0147]
s9.15：弃封闭液，每孔加入200μl pbst(1
×
pbs加0.1％ tween20，下同)缓冲液，
室温清洗酶标板3次，每次10min；
[0148]
s9.16：每孔加入120μl 3％ bsa后再加入80μl步骤s9.11中离心后的上清液，室温孵育2h；
[0149]
s9.17：弃掉酶标板内液体，每孔加入200μlpbst缓冲液洗涤3次，每次10min；
[0150]
s9.18：每孔加入m13bacteriophage antibody(hrp)，mouse mab，稀释于封闭液中，100μl/孔，室温孵育1h；
[0151]
s9.19：弃掉elisa板内液体，每孔加入200μlpbst缓冲液洗涤3次，每次10min；
[0152]
s9.20：每孔加入100μl tmb单组份显色液，避光显色2-3min，每孔加入100μl 1m hcl终止，用酶标仪读取od450值，记录并保存。
[0153]
优选的，步骤s11具体为：
[0154]
根据elisa检测数据和二次验证数据选定阳性单克隆
[0155]
从单克隆elisa检测(2.9.7)板中取阳性克隆菌液5μl接种至1ml 2
×
yt培养基(含有100μg/ml amp)，37℃，250rpm培养直至od600至0.8-1.0(约6-8h)，取0.5ml菌液测序，其余菌液4℃保存。
[0156]
本发明的有益效果：本发明筛选抗原经过3轮免疫管筛选后，富集程度达到10-3
，筛选轮数合适和筛选效果良好；免疫管筛选后，挑选384个单克隆进行elisa检验和阳性克隆二次验证，阳性克隆率良好；将验证后37个阳性克隆基因测序，共得到28条不同抗体序列，各序列多样性良好且抗体序列数目合适。
附图说明
[0157]
图1为羊驼pbmc总rna琼脂糖凝胶电泳结果(第一次提取)；
[0158]
图2为羊驼pbmc总rna琼脂糖凝胶电泳结果(第二次提取)；
[0159]
图3使用不同cdna模板量的琼脂糖凝胶电泳(第一次)；
[0160]
图4使用不同cdna模板量的琼脂糖凝胶电泳(第二次)；
[0161]
图5使用不同体积的第一轮pcr产物作为模板进行pcr的琼脂糖凝胶电泳；
[0162]
图6菌落pcr琼脂糖凝胶电泳结果。
具体实施方式
[0163]
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
[0164]
实施例1噬菌体文库的制备
[0165]
1、总rna提取和反转录
[0166]
(1)总rna体积和检测结果：
[0167]
检测项目名称一轮检测值二轮检测值rna浓度696.5ng/μl1029.1ng/μla260/a2801.952.02a260/a2300.921.53总rna体积120μl120μl
[0168]
总rna琼脂凝胶电泳结果具体见图1和图2。
[0169]
(2)反转录cdna结果：
[0170][0171]
2、pcr扩增
[0172]
(1)第一轮pcr扩增
[0173]
a、确定最佳扩增模板量
[0174]
参考图3和图4的琼脂糖凝胶电泳结果显示，oligo dt primer转录后进行第一轮扩增使用2μl/2μl作为模板扩增条带强而清晰，选择2μl/2μl为最佳扩增模板量；random 6-mers转录后进行第一轮扩增使用4μl/3μl作为模板扩增条带清晰，选择4μl/3μl为最佳扩增模板量。
[0175]
b、第一轮pcr扩增和回收
[0176][0177]
(2)第二轮pcr扩增
[0178]
a、确定最佳扩增模板量
[0179]
琼脂糖凝胶电泳结果如图5显示，第二轮扩增选择0.25μl为扩增模板量。
[0180]
b、第二轮pcr扩增和回收
[0181][0182]
3、载体和pcr产物酶切、连接
[0183]
(1)酶切、连接检测结果
[0184][0185]
4、细菌文库构建
[0186]
(1)细菌文库检测
[0187]
项目值连接效率1.3
×
107cfu/100ng库容量2.99
×
108pfu阳性克隆率100％细菌库体积～40ml细菌库od600102
[0188]
(2)阳性克隆率菌落pcr
[0189]
参考图6菌落pcr琼脂糖凝胶电泳结果显示，挑选的51个单克隆有51个为阳性克隆，阳性率为100％，细菌文库阳性克隆率符合要求。
[0190]
(3)序列多样性
[0191]
随机挑选48个单克隆测序后使用gentle软件转录翻译成蛋白质序列，序列多样性比对显示48个序列均为独立序列，多样性100％，细菌文库多样性符合要求要求。
[0192]
5、噬箘体文库制备
[0193]
(1)噬菌体文库检测
[0194]
项目值体积1.0ml效价6.4
×
10
13
pfu/ml
[0195]
实施例2
[0196]
1、二轮筛选结果
[0197]
筛选轮数输入效价筛选效价对照效价富集程度
*1
相差倍数*2第1轮6.4
×
10
12
pfu/ml8.8
×
108pfu/ml6.0
×
108pfu/ml1.4
×
10-4
1.47第2轮3.4
×
10
13
pfu/ml3.2
×
109pfu/ml2.4
×
109pfu/ml9.41
×
10-5
1.33第3轮3.0
×
10
12
pfu/ml4.0
×
109pfu/ml2.4
×
109pfu/ml1.33
×
10-3
1.67
[0198]
*1
富集程度为筛选效价除以输入效价除以，数值越低表明抗体在输入库中富集程度越高；
[0199]
*2相差倍数为筛选效价除以对照效价，数值越高表明阳性抗体在筛选库中含量越高。
[0200]
结果显示，经过3轮筛选后，富集程度达到10-3
，可以进行elisa单克隆验证。
[0201]
2、单克隆elisa检测结果
[0202]
免疫管筛选后，随机挑选p1(a1-h12)、p2(a1-h12)、p3(a1-h12)和p4(a1-h12)共384个单克隆进行elisa检测，其中下划线克隆为目的抗原的od450值大于bsa对照od450值3倍且读值大于0.5，结果如下表：
[0203][0204]
[0205][0206]
[0207][0208][0209]
[0210]
(3)阳性克隆elisa二次验证结果
[0211]
下划线克隆为目的抗原的od450值大于bsa对照od450值3倍且读值大于1.0，判定为阳性克隆，结果如下表：
[0212][0213]
[0214]
(4)序列多样性结果
[0215]
本项目筛选后共得到37个阳性克隆，进行测序，测序结果1条双峰，36条正常。根据纳米抗体前后序列可以从测序结果中获得纳米抗体序列，将36条序列翻译成氨基酸后排序并进行多序列比对，共得到28条不同的纳米抗体序列，比对结果如下：
[0216]
序号代表序列与代表序列相同的序列合计(个)1p1-a9 12p1-d3 13p1-h6 14p2-b1 15p2-b2 16p2-b4 17p2-f4 18p2-f8 19p2-h1 110p3-a2p2-e10、p1-f8、p1-d10、p4-e9511p3-a7 112p3-a8p4-e5213p3-b3 114p3-b6 115p3-d2 116p3-e2 117p3-e7 118p3-f7 119p3-h1 120p3-h5 121p4-a11 122p4-b12 123p4-b7p3-e11、p3-c11324p4-c3 125p4-d8p3-b11226p4-e11 127p4-f11 128p4-f3 1总计28 36
[0217]
(5)氨基酸序列
[0218]
将28条不同抗体序列使用gentle软件翻译成氨基酸后，得到以下抗体序列：
[0219]
[0220]
[0221][0222]
本发明筛选抗原经过3轮免疫管筛选后，富集程度达到10-3
，筛选轮数合适和筛选效果良好；
[0223]
免疫管筛选后，挑选384个单克隆进行elisa检验和阳性克隆二次验证，阳性克隆率良好；
[0224]
将验证后37个阳性克隆基因测序，共得到28条不同抗体序列，各序列多样性良好且抗体序列数目合适。
[0225]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0226]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.一种kt65-噬菌体的免疫筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：s1：第一轮筛选噬菌体洗脱液；s2：第一轮噬菌体洗脱液效价检测；s3：第一轮噬菌体洗脱液的扩增；s4：第一轮噬菌体纯化；s5：第二、三轮筛选噬菌体洗脱液：同步骤s1，输入噬菌体为第一轮筛选得到噬菌体子文库1ml，作为第二轮筛选输入噬菌体文库，得到第二轮筛选噬菌体洗脱液；s6：第二、三轮噬菌体洗脱液效价检测：同步骤s2；s7：第二、三轮噬菌体洗脱液的扩增、纯化：同步骤s3-s4，得到第二轮筛选噬菌体子文库；s8：第二、三轮筛选噬菌体子文库效价检测：同步骤s2；s9：单克隆elisa检测；s10：阳性克隆elisa二次验证：同步骤s9；s11：阳性克隆测序；s12：序列分析。2.如权利要求1所述的一种kt65-噬菌体的免疫筛选方法，其特征在于，步骤s1具体为：s1.1：取出筛选抗原，解冻；s1.2：将筛选抗原包被免疫管，旋转过夜，同时平行包被bsa作对照；s1.3：将过夜包被的免疫管中的液体弃掉，加入pbs缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5min；s1.4：加入2ml封闭液溶液，室温旋转封闭1h；s1.5：将封闭后的免疫管中液体丢弃，并加入pbst缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5min；s1.6：弃掉免疫管中的清洗液，加入脱脂奶粉，按照下列公式计算并加入制备的噬菌体文库作为第一轮筛选输入噬菌体文库，室温旋转孵育2h：其中，v为加入的噬菌体体积/μl，t
library
为噬菌体效价；s1.7：将免疫管内液体弃掉，加入pbst缓冲液室温清洗免疫管20次，每次旋转5min；s1.8：将免疫管内液体弃掉，去除残余液体，加入trypsin溶液，室温旋转洗脱30min；s1.9：加入aebsf终止洗脱，将免疫管中的溶液转移至离心管中，即为第一轮筛选噬菌体洗脱液。3.如权利要求1所述的一种kt65-噬菌体的免疫筛选方法，其特征在于，步骤s2具体为：s2.1：将tg1菌株在固体培养基进行单菌落划线，37℃过夜培养，从单菌落板上挑取一个单菌落到2
×
yt培养基，37℃过夜培养；
s2.2：取过夜培养菌液转接到含5ml的2
×
yt液体培养基中，37℃，250rpm培养至od600为0.5-0.55；s2.3：取第一轮噬菌体洗脱液10μl，在1.5ml离心管中10倍梯度稀释，共稀释12个梯度，振荡混匀；s2.4：在每个稀释离心管中加入ss320菌液，混匀后孵育；s2.5：从每个稀释离心管中取5μl滴加到2
×
yt固体培养基中，过夜培养；s2.6：按照下面公式计算每毫升噬菌体溶液中噬菌粒的数量，即噬菌体文库效价：t(pfu/ml)＝n
×
d
×
400其中，t为噬菌体效价/pfu/ml，d为稀释倍数，n为相应稀释倍数上单菌落个数。4.如权利要求1所述的一种kt65-噬菌体的免疫筛选方法，其特征在于，步骤s3具体为：s3.1：将tg1菌株在2
×
yt固体培养基进行单菌落划线，过夜培养，从单菌落板上挑取一个单菌落到5ml的2
×
yt培养基，过夜培养；s3.2：取过夜培养菌液500μl转接到含5ml含的2
×
yt液体培养基中，37℃，250rpm培养至od600值为0.5-0.55；s3.3：加入500μl第一轮筛选后得到的噬菌体洗脱液至od600为0.5-0.55的菌液中；s3.4：37℃，250rpm继续培养30min；s3.5：将全部菌液均匀涂布到培养基平板中，37℃过夜培养；s3.6：取过夜培养的平板，在培养板表面加入6ml 2
×
yt液体培养基，将菌落刮下并将菌液收集至15ml离心管中，即为扩增后的细菌子文库，同时使用分光光度计测量菌液od600值，即为洗脱液细菌文库od600值，加入甘油，即为第一轮细菌文库；s3.7：将洗脱液细菌文库根据下面公式计算出相应菌液量，转接至2
×
yt液体培养基中，以使初始od600为0.1：其中，v为转接菌液的体积/μl，od600为构建的洗脱液细菌文库的od600；s3.8：37℃，250rpm培养直至菌液od600达到0.5-0.55；s3.9：按照下面公式计算并加入辅助噬菌体m13k07以使细菌个数：噬菌体数＝1：20：其中，v为加入辅助噬菌体的体积/ml，t
helper-phage
为使用的辅助噬菌体效价，od600为菌液的od600值；s3.10：37℃，250rpm继续培养30min；s3.11：加入终浓度为50μg/ml kana，30℃，250rpm过夜培养。5.如权利要求1所述的一种kt65-噬菌体的免疫筛选方法，其特征在于，步骤s4具体为：s4.1：将过夜培养的菌液转移至离心管中离心；s4.2：将离心后的上清液转移至离心管中，加入nacl，充分混匀后冰上放置；s4.3：离心，弃上清，并倒置2min；s4.4：加入pbs重悬沉淀，将重悬液移至离心管，离心；s4.5：将离心后的上清转移至离心管，加入溶液，混匀后冰上放置；
s4.6：离心，弃上清，加入pbs重悬沉淀；s4.7：离心，将上清转移到离心管中，即为第一轮筛选噬菌体子文库；s4.8：第一轮筛选噬菌体子文库效价检测，同步骤s2。6.如权利要求1所述的一种kt65-噬菌体的免疫筛选方法，其特征在于，步骤s9具体为：s9.1：tg1菌株在2
×
yt固体培养基进行单菌落划线，过夜培养，从单菌落板上挑取一个单菌落到5ml的2
×
yt培养基，过夜培养；s9.2：取过夜培养菌液500μl转接到含5ml的2
×
yt液体培养基中，37℃，250rpm培养至od600值为0.5-0.55；s9.3：取第二轮筛选后噬菌体洗脱液10μl，在1.5ml离心管中10倍梯度稀释，共稀释12个梯度，振荡混匀；s9.4：每个稀释离心管中加入90μl的菌液，混合均匀；s9.5：37℃，250rpm继续培养；s9.6：将菌液均匀涂布到含有100μg/ml amp的固体培养基平板，过夜培养；s9.7：从过夜培养后的培养基平板中随机挑取单克隆菌落于无菌96孔细胞培养板(p1-p2)中，每孔加入200μl 2
×
yt培养基，过夜静置培养；s9.8：取过夜培养的菌液2μl转接至每孔200μl 2
×
yt液体培养基的96孔细胞培养板中，静置培养，将转接前过夜培养的菌液4℃保存；s9.9：按照下面公式计算并每孔加入辅助噬菌体m13k07以使细菌个数：噬菌体数＝1：20：其中，v为加入辅助噬菌体的体积/ml，t
helper-pjahe
为使用的辅助噬菌体效价；s9.10：37℃孵育30min，加入kana，静置过夜培养；s9.11：将过夜培养后的96孔培养板4℃，4000rpm离心10min，4℃保存备用；s9.12：将筛选抗原包被酶标板，同时平行包被bsa作对照，4℃包被过夜；s9.13：将过夜包被的酶标板内液体弃掉，每孔加入pbs缓冲液，室温清洗酶标板3次，每次10min；s9.14：每孔加入200μl封闭液封闭酶标板，室温封闭1h；s9.15：弃封闭液，每孔加入200μl pbst缓冲液，室温清洗酶标板3次，每次10min；s9.16：每孔加入120μl 3％bsa后再加入80μl步骤s9.11中离心后的上清液，室温孵育2h；s9.17：弃掉酶标板内液体，每孔加入200μlpbst缓冲液洗涤3次，每次10min；s9.18：每孔加入m13bacteriophage antibody(hrp)，mouse mab，稀释于封闭液中，100μl/孔，室温孵育1h；s9.19：弃掉elisa板内液体，每孔加入200μlpbst缓冲液洗涤3次，每次10min；s9.20：每孔加入100μl tmb单组份显色液，避光显色2-3min，每孔加入100μl 1m hcl终止，用酶标仪读取od450值，记录并保存。7.如权利要求1所述的一种kt65-噬菌体的免疫筛选方法，其特征在于，步骤s11具体为：从单克隆elisa检测步骤s9.7板中取阳性克隆菌液5μl接种至1ml 2
×
yt培养基，37℃，
250rpm培养直至od600至0.8-1.0，取0.5ml菌液测序，其余菌液4℃保存。

技术总结
本发明公开了一种KT65-噬菌体的免疫筛选方法，包括如下步骤：S1：第一轮筛选噬菌体洗脱液；S2：第一轮噬菌体洗脱液效价检测；S3：第一轮噬菌体洗脱液的扩增；S4：第一轮噬菌体纯化；S5：第二、三轮筛选噬菌体洗脱液；S6：第二、三轮噬菌体洗脱液效价检测；S7：第二、三轮噬菌体洗脱液的扩增、纯化；S8：第二、三轮筛选噬菌体子文库效价检测；S9：单克隆ELISA检测；S10：阳性克隆ELISA二次验证；S11：阳性克隆测序；S12：序列分析。列分析。列分析。


技术研发人员：梁婷 陈静飞 蒋华宁 王怀璋 阎瑞 董强 李江存
受保护的技术使用者：中国人民解放军陆军防化学院
技术研发日：2023.07.21
技术公布日：2023/10/15