一种鱼类肠道菌群活体采样方法

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种鱼类肠道菌群活体采样方法。


背景技术：

2.脊椎动物在出生时即被复杂和动态的特定微生物群落所移植，在皮肤、黏膜、内脏器官等部位均有大量分布。这些微生物尤其是肠道菌群非但无害而且与宿主健康有密切关系。生物体肠道菌群具有丰度和多样性等特征，赋予宿主营养吸收、药物代谢、维持肠道粘膜屏障的结构完整性、天然免疫和对抗病原体的特定功能。肠道菌群的功能研究对人类及环境健康意义重大。目前肠道微生物或环境菌群能够影响宿主代谢和免疫系统，但内在调控机制仍不完全清楚。利用无菌模型来研究单一或复合细菌功能的前提是：肠道及环境细菌的分离、纯化及菌种鉴定。尽管报道显示可分离培养的斑马鱼肠道微生物从形态学差异上主要有13菌种，这个可培养的微生物图谱为后续研究提供了思路，但是仅分离出数个主要菌属。肠道及环境细菌的功能研究和安全性评价在生物和医药、环境健康等研究领域需求强烈，但是，目前还没有研究报道鱼类肠道菌群的快速高效分离、鉴定的实验方法。
3.尤其是，目前传统常规的动物肠道菌群采样主要分两种，第一种是采集动物粪便，第二种是杀死动物解剖肠道组织采集肠道内容物，但是这两种方法均有缺陷。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种鱼类肠道菌群活体采样方法，可高准确性、广筛选范围、低成本、快速获得目标成鱼肠道菌群，且目标成鱼可以重复利用，为实验动物模型、肠道菌群功能、水产养殖和环境保护等方面研究提供更好的实验基础和技术参考。
5.本发明的技术方案是：一种鱼类肠道菌群活体采样方法，包括以下步骤：
6.1)根据目标成鱼的体长、体高和体宽，在凝胶平板上设置凹槽；
7.2)取目标成鱼，经消毒、麻醉和/或包裹于纱布中，在洁净环境中侧躺搁置在步骤1)凝胶平板的凹槽中形成定位，保持目标成鱼鱼体湿润；
8.3)使用第一注射器吸取培养基或生理盐水，且将针头折弯，经目标成鱼的口部进入肠道胃球和前肠部位冲洗，吸取肠道内容物混合液，得到第一原液，用于扩大培养、分离和鉴定；
9.4)使用第二注射器吸取培养基或生理盐水，且将针头折弯，经目标成鱼的泄殖孔进入中后肠部位冲洗，吸取肠道内容物混合液，得到第二原液，用于扩大培养、分离和鉴定。
10.进一步的，步骤1)所述目标成鱼为淡水鱼或咸水鱼，所述凝胶平板为琼脂糖凝胶平板，且位于无菌环境中，当目标成鱼为咸水鱼时，琼脂糖凝胶平板中加入盐，且盐浓度与咸水鱼养殖用水盐浓度相适应。
11.优选的，步骤2)所述目标成鱼正常饲养，取样前使用无菌超滤水清洗，所述麻醉，为使用80-200mg/l ms-222麻醉目标成鱼至侧躺不游动，麻醉时间为3-5min，所述纱布为无
菌双层纱布，麻醉后用75％医用酒精消毒10-20s。
12.优选的，步骤3)使用的第一注射器的量程≤1ml，然后更换为平头针，吸取培养基或生理盐水50-200μl，且在针头1.0-1.5cm处弯折10-35
°
，所述冲洗的次数为2-3次，吸取混合液30-80μl。
13.优选的，步骤4)使用的第二注射器的量程≤1ml，然后更换为平头针，吸取培养基或生理盐水50-100μl，且在针头0.4-0.8cm处弯折5-25
°
，所述冲洗的次数为1-2次，吸取混合液20-50μl。
14.进一步的，步骤3)、步骤4)所述培养基为bhi培养基或tsb培养基，当目标成鱼为咸水鱼，bhi培养基或tsb培养基中加入盐，且盐浓度与咸水鱼养殖用水盐浓度相适应。
15.优选的，步骤3)第一注射器针头在目标成鱼体内的时间≤30s，步骤4)第二注射器针头在目标成鱼体内的时间≤10s。
16.进一步的，步骤4)得到第二原液后，将目标成鱼放入28
±
2℃无菌纯水中清洗至自由游动，正常喂食3-7d后，作为步骤2)的目标成鱼。
17.进一步的，步骤3)、步骤4)所述扩大培养、分离和鉴定包括以下步骤：
18.1)取吸取有第一原液的第一注射器、吸取有第二原液的第二注射器，向含有培养基的厌氧管、好氧管中注入第一原液、第二原液；
19.2)好氧管在28-30℃条件下振荡摇菌扩大培养2-6h，振荡频率为150-200rpm，厌氧管在28-30℃条件下静置扩大培养4-12h；
20.3)取好氧扩大培养液，在洁净环境中涂布在tsa平板和血平板上，在生化培养箱中于28-30℃静置培养12-120h，根据菌株生长情况，在12h、24h、48h时间点挑取单菌落，进行多次传代纯化后鉴定菌种；
21.4)取厌氧扩大培养液，在氧气含量≤0.5％、温度为28
±
2℃条件下涂布在tsa平板和血平板上，然后在tsa平板和血平板上倒入tsa胶，形成密封层，密封层的厚度为2-3mm，在生化培养箱中于28-30℃精静置培养12-120h，根据菌株生长情况，在12h、24h、48h时间点挑取单菌落，进行多次传代纯化后鉴定菌种。
22.进一步的，步骤3)挑取单菌落的tsa平板和血平板放入冰箱，保存1-2月后，根据平板上菌株生长情况，进行第二批挑取多次传代纯化；步骤4)挑取单菌落的tsa平板和血平板放入冰箱，保存1-2月后，根据平板上菌株生长情况，进行第二批挑取多次传代纯化。
23.采用上述技术方案具有以下有益效果：
24.1、本发明为一种活体肠道菌群采集方法，有望代替牺牲动物为代价的传统解剖采样，成为新型的、经济的、动物福利保障的肠道菌群活体采样方法，可为持续多次采样、定量给药、精准检测、调控治疗等生物医学和人类健康研究提高重要的参考价值和技术支持。可弥补传统粪便采样的菌种缺失、环境因素的影响、和解剖采样中杀死动物的损失、挤压冲洗肠道提取菌群不充分等缺点，对珍稀鱼类和实验样本、连续采样、菌群调控、经胃肠道暴露毒物等具有非常重要意义。并且，动物肠道菌群活体采样后的原液扩大培养，整个操作过程保证好氧和厌氧细菌的同时存活，有利于扩大筛选可体外培养的肠道细菌，特别是兼性厌氧和严格厌氧菌的范围，对其后期菌株分离纯化和功能研究奠定基础。
25.2、本发明通过先将目标成鱼麻醉和/或包裹在纱布中，且定位在凝胶平板上的凹槽中，固定目标成鱼的位置，避免在活体取样中对目标成鱼造成损伤，且保证取样位置准
确。利用凝胶作为固定载体，方便技术不熟练人员操作，纱布固定利于技术人员单手操作，满足不伤害鱼体并快速活体采样的需求。然后利用培养基或生理盐水作为冲洗液和肠道菌群载体，分别在目标成鱼的肠道胃球、前肠部位、肠道中后部进行冲洗，与目标成鱼肠道各部分的内容物混合，并吸取肠道内容物混合液用于扩大培养、分离和鉴定，实现目标成鱼活体采集肠道菌群的目的，整个采样过程简单、高效，且保证采集的肠道菌群完整，采集肠道菌群完毕的目标成鱼立即置于正常养殖水中30s-1min内即可恢复自由活泼游动，单独环境养殖1-2天观察无恙后可放回原实验环境进行后续采样和重复利用，还保证长期试验的重现性和珍稀鱼类的可持续性，同时也有利于定量给药、肠道暴露毒物等处理后肠道菌群的精准采集和鉴定。通过将使用的注射器的针头折弯，可以精确控制注射器针头针尖进入目标成鱼肠道的位置，保证采样位置准确，且杜绝对目标成鱼的肠道造成损伤，保证目标成鱼的利用率。得到的第一原液、第二原液经好氧和厌氧扩大培养、菌落分离和鉴定，为今后鱼类动物肠道菌群分离、鉴定、及功能研究提供参考。
26.3、本发明活体采样方法，目标成鱼在活体采样前正常养殖，麻醉前无菌水清洗，麻醉后75％酒精快速消菌杀毒，由于活体采样使用无菌平头针直接取样，故可避免外部环境细菌对采样造成干扰，且节省了解剖采样前成鱼的无菌饲养和消毒工序。
27.4、本发明活体采样方法，注射器在吸取培养基或生理盐水时，以及进入目标成鱼体内进行冲洗和吸取动作时使用平头针，其目的是避免一次性无菌注射器的尖头针对鱼体肠道的刺伤。
28.5、本发明活体采样方法，通过控制成鱼的麻醉时间在2-5min、注射器针头在成鱼体内的总体时间≤1min，降低活体采样操作对目标成鱼的损伤。采样完毕后立即将目标成鱼放入28
±
2℃无菌纯水或正常养殖过滤水中清洗，恢复时间约为30s-1min即可完全苏醒及自由游动，正常喂食3-7d后，作为目标成鱼重复进行活体采样。有效降低活体采样的成本，可保证长期实验和珍稀鱼类的连续多次采样，同时也有利于定量给药、肠道暴露毒物等处理后肠道菌群的精准采集和鉴定。
29.6、本发明活体采样方法，采集得到的第一原液、第二原液在厌氧和好氧操作平台进行扩大培养，有利于后续根据单菌落特征进行好氧、兼性厌氧、严格厌氧菌株的体外培养及分离，可在原液采集量少的情况下提高肠道菌群在后续体外培养和分离纯化时的筛选范围和机率，保证对目标成鱼肠道菌株鉴定的丰度和菌属的多样性。扩大培养平板经第一次挑取单菌落后，保存在冰箱中1-2个月，根据平板上菌株生长情况，进行第二批挑取进行多次传代纯化，以筛选出生长速度较慢但不同类型的菌株，提高对目标成鱼肠道菌株的分离鉴定，保证对目标成鱼肠道菌群的鉴定准确性和范围广泛性。
30.本方法鱼类肠道菌群活体采样方法具有筛选范围广、活菌数量多、避免动物死亡、可连续多次采样、得到纯化菌株时间短、成本低、易操作等优点。由于菌群分离是在肠道可解剖的几乎所有鱼类及其他水生生物模型上均能得到，具有普遍适用性，且肠道菌群的分离和鉴定是后续研究单独菌株的功能与宿主健康联系的关键前提，故本发明方法将为肠道菌群功能的科学研究和水产养殖、环境保护等方面研究提供实验基础和技术参考。
31.下面结合附图和具体实施方式作进一步的说明。
附图说明
32.图1-1为实施例1斑马鱼活体采样好氧筛菌平板特征图；
33.图1-2为对照例1斑马鱼解剖采样好氧筛菌平板特征图；
34.图1-3为实施例1斑马鱼活体采样厌氧筛菌平板特征图；
35.图1-4为对照例1斑马鱼解剖采样厌氧筛菌平板特征图；
36.图1-5为实施例1斑马鱼解剖采样筛菌dna电泳图；
37.图1-6为实施例1斑马鱼解剖采样筛菌平板特征图；
38.图2为实施例1得到的斑马鱼活体采样筛选肠道不同菌种测序峰图；
39.图3为对照例1得到的斑马鱼肠道菌种v3-v4区按顺序no.1-8的峰图；
40.图4为实施例1梅里埃鉴定试剂条上各个检测的反应结果图；
41.图5为对照例1梅里埃鉴定试剂条上各个检测的反应结果图。
具体实施方式
42.本发明中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
43.本发明中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
44.其中，一次性无菌注射器，一次性无菌涂布棒、一次性无菌接种环、平头针可灭菌、厌氧管、好氧玻璃管、一次性无菌培养皿、烧杯等，可商业采购。
45.tsb培养基：称取3g胰蛋白胨，1g大豆蛋白胨，1g nacl加入200ml超纯水混匀为胰蛋白胨大豆肉汤(trypticase soy borth,tsb)培养基；
46.bhi培养基：称取脑心浸液培养基(brain heart infusion medium,bhi)3.7g溶于100ml超纯水，混匀灭菌备用；来源solarbio，货号：cat#b8130；
47.tsa平板：称取3g胰蛋白胨，1g大豆蛋白胨，1g nacl，3g琼脂粉配制200ml胰蛋白胨大豆肉琼脂(trypticase soy agar,tsa)培养基，混匀灭菌倒板备用；
48.血平板：tsa平板加5％无菌脱纤维绵羊血，来源solarbio，货号：cat.no.tx0030；
49.双平板：tsa平板涂板后倒入上层tsa固体培养基，厚度为2-3mm。
50.厌氧管：配置好tsb和bhi培养基分装至厌氧管，充高纯氮气排净空气。
51.以上实验材料高压灭菌后，固体培养基倒板，液体培养基冷却至室温后放置4℃冰箱备用。
52.厌氧操作系统参数：氧气含量范围为0-0.5％，操作时持续充氮气，使用前后紫外杀菌30min。
53.实施例1
54.以斑马鱼为例，获得的主要为好氧、兼性厌氧和严格厌氧肠道菌种。
55.1、成年雌雄斑马鱼采样前处理：
56.首先，斑马鱼饲养在循环水系统，光暗周期为14h光照，10h黑暗，水温为28℃，喂食新孵化清洗过的活的丰年虫，每天2次分别为早9:00晚上17：00，期间注意经常换水，避免环境细菌对肠道菌群结构的影响。在采样处理前，挑选健康生长状态、饲养环境良好的成年雌雄斑马鱼》3-6月龄，分缸和性别用超纯水单独驯养，驯化为期一周保持每天换水。
57.在成年斑马鱼活体采样前，在灭菌超净工作台使用150mg/l浓度ms-222麻醉成鱼3min至侧躺不游动，固定于特制的琼脂糖凝胶平板凹槽，或包裹于无菌双层纱布，固定放好
麻醉鱼体后稍侧面倾斜利于操作，保持鱼体湿润环境。麻醉后鱼体固定及采样过程控制在1-2min内,最长不超过3min，麻醉浓度过高和时间过久会造成动物死亡。其中，麻醉浓度和时间可根据鱼类种类、年龄、个体大小、体重等基本指标进行调整，保证麻醉操作时间及采样后放回养殖环境中快速苏醒恢复自由游动。
58.2、肠道菌群活体采样
59.使用一次性无菌注射器(1ml量程))换平头针(23号针头，在1.0-1.5cm处弯折10-35
°
夹角)吸取厌氧管中脑心浸液(bhi)培养基或胰蛋白胨大豆(tsb)培养基或者生理盐水约50-200μl。
60.用平头解剖镊轻轻夹住鱼体头部稍微分开口腔后，经口进入肠道的胃球和前肠部位进行冲洗2-3次，吸取肠道内容物混合液约30-80μl即为第一菌群原液；使用一次性无菌注射器(1ml量程)换平头针(26号针头)并在0.4-0.8cm处弯折5-25
°
夹角，吸取厌氧管中脑心浸液(bhi)培养基或胰蛋白胨大豆(tsb)培养基或者生理盐水约50-100μl，经前后调节轻轻插入鱼类泄殖腔肠道中后肠部位进行冲洗1-2次，吸取肠道菌群原液约20-50μl，即为第二菌群原液。(无菌针头的型号、弯折角度、插入鱼体长度等，可根据动物的种类、肠道组织结构、口腔和泄殖腔等进行调整)。
61.取样完毕后，将麻醉鱼置于28
±
0.5℃无菌超纯水中清洗1-2min即可恢复清醒，最终可自由游动，观察4-6h后正常喂食即可；在同一条样本鱼恢复休息3-7天后，可按照以上步骤再次活体采样，可保证长期实验和珍稀鱼类的连续多次采样，同时也有利于定量给药、肠道暴露毒物等处理后肠道菌群的精准采集和鉴定。
62.3、原液扩大培养
63.将吸取胃球和前肠的注射针管换成原始注射针头分别注入10-25μl到tsb、bhi的好氧管和厌氧管进行体外扩大培养。设置体外扩大培养的条件为：好氧玻璃试管在28-30℃恒温培养振荡器150-200rpm摇菌2-6h，优选2h；厌氧管在28-30℃生化培养箱静置培养4-36h，优选4h。此步骤目的是将肠道菌群原液中含量较少和不易体外存活的严格厌氧和兼性厌氧、及部分好氧细菌扩大丰度，可在原液采集量少的情况下提高肠道菌群在后续体外培养和分离纯化时的筛选范围和机率。
64.4、平板体外培养
65.将步骤3中斑马鱼肠道扩大培养菌液稀释100
×
后涂布tsa平板、血平板、及双层厌氧培养板，每组做至少3个重复。其中双层厌氧培养板的基层为tsa平板或血平板，第二层为较薄(2-3mm)的透明tsa培养基，易于观察菌斑形态和颜色，便于后续挑单菌落；其中，平板均不加抗生素，避免环境细菌的污染。
66.双层厌氧培养板的制作为扩大培养菌液涂布tsa和血平板后，立即倒入合适温度tsa胶约2-3mm厚度并完全封住第一层平板置于超净台晾干后封口，切记tsa胶温度不可过高，以免影响肠道菌种存活，并且第二层的tsa胶较薄透明便于后续筛菌。
67.5、在厌氧操作系统和好氧操作平台进行分离纯化
68.将步骤4中所有平板正置于30℃生化培养箱孵育48h，开始挑取不同特征的菌斑，进行第一批筛选菌种的划线分离培养；再次筛选：原始平板封口后置于4℃冰箱1-2月后，根据菌斑色素变化及生长形态的差异，挑取第二批进行分离培养。
69.本实施例中肠道菌种的平板培养温度和时间很重要，由于斑马鱼生长环境为28
±
0.5℃，其肠道菌群的培养在28-30℃为宜，在培养24h、48h时部分好养菌和丰度较高的优势菌已经长成菌斑可挑菌后继续培养，在平板低温放置处理后，某些丰度较小的菌斑会长出，尤其针对某些菌斑分泌色素会加深，以便再次筛选生长速度较慢但是丰度和好氧、兼性厌氧菌较多的菌斑，在tsa和血平板厌氧板上会挑出更多不同菌属。
70.本实施例在鱼类前肠和后肠菌液的所有tsa、血平板、双层板等平板上第一次筛菌共挑选6种不同生长特征(颜色，大小，边缘，干燥或湿润，透明与否等)的菌斑，第二次共10种显著差异特征的菌斑。
71.6、多次传代纯化菌种
72.按照如下步骤进行传代纯化，原始平板多种菌斑-单菌落平板划线01-单菌落平板划线02-单菌落平板划线03-单菌落摇菌04-菌液涂布平板05-单菌落摇菌06-菌液进行分子鉴定-25-30％甘油冻存备份。
73.其中，tsa平板菌落使用tsb培养基28-30℃生化培养箱150-180rpm摇菌16h，血平板单菌落使用bhi脑心浸液培养基28-30℃生化培养箱150-180rpm摇菌16h。
74.在此步骤，肠道菌种的单菌落划线时要注意记录对应菌斑的原始命名，后续多次传代纯化要一一对应，以免交叉污染。
75.在平板传代过程中，第一次筛菌平板28-30℃生化培养箱正置24h即可进行下一次划线，本实施例中活体采样的第一筛菌平板特征见图1-1，第二次筛菌传代由于大多为丰度低生长慢菌种，一般28-30℃生化培养箱正置48-72h再进行下一次划线，并且tsa平板和血平板菌落传代至相对应平板，在血平板菌落鉴定后可转移至tsa平板培养，目前筛出的肠道菌种在2种平板均可存活。
76.7、菌种的形态鉴定和分子鉴定
77.在经过多次传代纯化后，取最后一步摇菌菌液进行革兰氏染色，在油镜下观察拍照，判断菌种的革兰氏阴性或阳性；同时取最后菌液使用细菌基因组dna提取试剂盒，其中革兰氏阳性菌由于含有细胞壁不易破裂，要加溶菌酶作用；提取的dna使用微量分光光度计进行浓度和纯度检测后，可稀释调整到合适浓度，同时用1％琼脂糖凝胶验证dna条带大小和单一性，本实施例中斑马鱼活体采样好氧和厌氧筛菌平板菌落特征件图见图1-1,1-3，细菌pcr产物电泳图见图1-6；基因组dna验证合格后用细菌通用引物27f(seq id no.9：5
’‑
aga gtt tga tcm tgg ctc ag-3’)和1492r(seq id no.10：5
’‑
acg gyt acc ttg tta cga ctt-3’)进行pcr验证，pcr验证体系共20μl，其中takara taq dna聚合酶0.1μl、10
×
buffer(mg2+)2.1μl、dntp 1.6μl、细菌dna 1.0μl、引物27f(10μm)1.0μl和1492r(10μm)1.0μl、dna/rna free h2o 13.2μl；pcr反应程序为：95℃ 4min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min共30个循环；72℃ 10min。
78.pcr产物取1.0μl跑1％琼脂糖凝胶验证条带亮度和大小在1500bp左右，可送测序公司用同样引物双向测序。
79.本实施例中得到斑马鱼肠道菌种的峰图(以与对照例中不同菌株，好氧为例)，其v3-v4区如图2。
80.由chromos、dnaman、vector等软件分析后，序列拼接输入ncbi-blast数据库进行比对，根据不同数据库包括nucleotide database和16s ribosomal rna(bacteria and archaea)database比对前50种相似度最高的菌种信息包括序列相似度、不配对碱基位置、
物种、来源等，综合分析确定分离的肠道菌株的属，顺序与前编号一致。其中在筛选比对时发现有菌种序列相似度很高，达到100％可判定为同一菌种，其余为同属相似菌株。8、斑马鱼肠道菌株的体外代谢功能鉴定：
81.利用梅里埃鉴定试剂盒(api 20e，ref 20100kits，no.1005915090，sa，france)对分离纯化的斑马鱼肠道菌株的代谢功能进行检测。具体步骤如下：
82.(a).根据分离纯化及鉴定结果，复苏冻存的相应斑马鱼肠道菌株涂布于tsb培养基，倒置于30℃生化培养箱过夜；
83.(b).然后挑取单菌落进行30℃摇床180rpm 16h后获得新鲜细菌，取出2ml于离心管3000rpm离心2min沉淀后，加入0.85％ nacl溶液进行重新悬浮稀释；
84.(c).提前处理试验条平衡至室温，并在孵育板内加入灭菌超纯水保持湿润状态，每个试剂条标记菌株名称和时间备用；
85.(d).按照试验条说明书进行加样，将每单个菌株3组重复加到api试验条后置于37℃生化培养箱继续孵育18-24h；
86.(e).根据说明书加入tda和vp等试剂，在10min内完成观察并记录试剂条上各个检测的反应结果，详见附图4。
87.其中，每个api 20e试剂条均包括19-22项检测，包括邻硝基苯-β-d-半乳糖酸苷(o-nitrophenyl-β-d-galactopyranoside，onpg)、精氨酸双水解酶(arginine dihydrolase，adh)、赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase，ldc)、鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase，odc)、柠檬酸盐(citrate，cit)、硫化氢(hydrogen sulfide，h2s)、尿素酶(urease，ure)、色氨酸脱氨酶(tryptophane deaminase，tda)、丙酮酸盐(voges proskauer，vp)、明胶酶(gelatinase，gel)、葡萄糖(glucose，glu)、甘露醇(mannitol，man)、肌醇(inositol，ino)、山梨糖醇(sorbitol，sor)、鼠李糖(rhamnose，rha)、蔗糖(saccharose，sac)、蜜二糖(melibiose，mel)、苦杏仁苷(amygdalin，amy)和阿拉伯糖(arabinose，ara)等。另外，试剂盒外试剂有1-萘酚(》99.0％)、nacl(≥99.5％，cas:7647-14-5)、fecl3
·
6h2o(≥99.0％，cas:10025-77-1)、液体石蜡(paraffin oil，cas:8012-95-1，500ml)等均为分析纯等级。
88.9、长期保存及数据发表
89.在确定菌种形态、序列信息、体外代谢试验(梅里埃鉴定试剂盒)后，将验证后菌种再次甘油冻存-80℃冰箱备用；序列数据按照要求命名菌种后上传到ncbi数据库，获得官方审核的菌种序列号，便于保存数据并为今后鱼类肠道菌群分离、鉴定等研究提供参考。
90.本实施例中获得活体采样斑马鱼肠道好氧和厌氧菌株归类为8个菌属，测序峰图见图2(仅展示与解剖采样的不同菌株)，具体菌株测序比对信息见表1，其中前4种为胃球和前肠部位分离出含量较为丰富的主要菌属acinetobacter、vibrio、pseudomonas、aeromonas、plesiomonas、shewanella等。与对照实例相比，活体采样在好氧和厌氧条件下，除了解剖采样可分离出的主要菌属外，还可分理处更多不同或稀有菌属，它们的代谢功能经鉴定也统计在表2中(仅展示不同菌株的检测结果)和图4。根据以上结果与解剖采样相比，活体采样可在好氧和厌氧条件下更大范围的分离鉴定出丰度较低确更多样性的肠道菌株。
91.表1.斑马鱼活体采样肠道分离菌种的特征、命名和ncbi序列号等信息
[0092][0093][0094]
备注：以上表格中以斑马鱼活体采样鉴定的好氧菌属为例。
[0095]
表2.斑马鱼活体采样肠道4个不同好氧菌属代表菌株的体外代谢功能总结*
[0096][0097]
*代表试验结果为明显可见的阳性现象出现在18-24h范围内；仅展示与解剖采样鉴定不同菌株的检测。
[0098]
对照例1
[0099]
取实施例1步骤1中驯化得到的斑马鱼作为采样目标：
[0100]
将其放入一次性无菌培养皿，并加入配制好的抗生素混合液处理30min，其中抗生素终浓度为卡那霉素5mg/l、氨苄霉素100mg/l、两性霉素b 250μg/l；在紫外灭菌照射30min的无菌超净工作台用80-200mg/l ms-222溶液麻醉处理3-5min后浸入75％的无水乙醇10s进行全身皮肤杀菌消毒。在处理成年斑马鱼制作简易的体外无菌模型过程中，斑马鱼的雌雄按组分开处理方式。需要注意的是，鱼类动物的杀菌消毒的处理方法不仅限于本实施例提及的抗生素和酒精处理，也可以采用本领域其他配套的灭菌器皿和无菌操作体系。
[0101]
将处理好的斑马鱼放于一次性无菌培养皿中进行解剖，无菌手术镊固定和手术剪沿腹部中线打开，换另一把无菌镊子取出完整肠道，将附着在肠道的弥散状肝脏、性腺、脂肪等组织剔除干净；然后肠道组织剪开分为前肠和中后肠部位，立即置于含有200μl脑心浸液培养基(bhi)的灭菌离心管内，轻轻碾压挤出肠道内含物，并冲洗肠道，吹打混匀后取上清即获得菌群原液。
[0102]
获得的菌群原液按照实施例1步骤3-9进行相同的处理，斑马鱼解剖采样好氧和厌氧筛菌平板特征见图1-2和1-4，提细菌dna进行pcr电泳条带结果为图1-5,最终得到的好氧和厌氧/兼性菌株经测序比对确定(测序峰图见图3)。
[0103]
本对照例中获得传统解剖斑马鱼成鱼取肠道组织进行好氧菌株归类为8个菌属，每个菌属上传1个代表菌株序列，具体菌种命名和获得8个序列号见表3，其中前4种为胃球和前肠部位分离出含量较为丰富的主要菌属pseudomonas、aeromonas、shewanella、vibrio，后4种为中后肠部位丰度较低不易分离培养但比较重要的菌属microbacterium、rhodococcus、exiguobacterium、bacillus，它们的代谢功能经鉴定也统计在表4中和图5(以好氧菌株为例)。
[0104]
表3.解剖斑马鱼肠道分离好氧菌种的特征和测序鉴定
[0105][0106][0107]
备注：以上表格中为斑马鱼解剖采样鉴定的好氧菌属为1-8号。
[0108]
表4.解剖斑马鱼肠道8个好氧菌属代表菌株的体外代谢功能总结
[0109][0110]
*代表试验结果为明显可见的阳性现象出现在24-48h范围内。

技术特征：
1.一种鱼类肠道菌群活体采样方法，其特征在于，包括以下步骤：1)根据目标成鱼的体长、体高和体宽，在凝胶平板上设置凹槽；2)取目标成鱼，经消毒、麻醉和/或包裹于纱布中，在洁净环境中侧躺搁置在步骤1)凝胶平板的凹槽中形成定位，保持目标成鱼鱼体湿润；3)使用第一注射器吸取培养基或生理盐水，且将针头折弯，经目标成鱼的口部进入肠道胃球和前肠部位冲洗，吸取肠道内容物混合液，得到第一原液，用于扩大培养、分离和鉴定；4)使用第二注射器吸取培养基或生理盐水，且将针头折弯，经目标成鱼的泄殖孔进入中后肠部位冲洗，吸取肠道内容物混合液，得到第二原液，用于扩大培养、分离和鉴定。2.根据权利要求1所述的采样方法，其特征在于，步骤1)所述目标成鱼为淡水鱼或咸水鱼，所述凝胶平板为琼脂糖凝胶平板，且位于无菌环境中，当目标成鱼为咸水鱼时，琼脂糖凝胶平板中加入盐，且盐浓度与咸水鱼养殖用水盐浓度相适应。3.根据权利要求1所述的采样方法，其特征在于，步骤2)所述目标成鱼正常饲养，取样前使用无菌超滤水清洗，所述麻醉，为使用80-200mg/l ms-222麻醉目标成鱼至侧躺不游动，麻醉时间为3-5min，所述纱布为无菌双层纱布，麻醉后用75％医用酒精消毒10-20s。4.根据权利要求1所述的采样方法，其特征在于，步骤3)使用的第一注射器的量程≤1ml，然后更换为平头针，吸取培养基或生理盐水50-200μl，且在针头1.0-1.5cm处弯折10-35
°
，所述冲洗的次数为2-3次，吸取混合液30-80μl。5.根据权利要求1所述的采样方法，其特征在于，步骤4)使用的第二注射器的量程≤1ml，然后更换为平头针，吸取培养基或生理盐水50-100μl，且在针头0.4-0.8cm处弯折5-25
°
，所述冲洗的次数为1-2次，吸取混合液20-50μl。6.根据权利要求1所述的采样方法，其特征在于，步骤3)、步骤4)所述培养基为bhi培养基或tsb培养基，当目标成鱼为咸水鱼，bhi培养基或tsb培养基中加入盐，且盐浓度与咸水鱼养殖用水盐浓度相适应。7.根据权利要求1所述的采样方法，其特征在于，步骤3)第一注射器针头在目标成鱼体内的时间≤30s，步骤4)第二注射器针头在目标成鱼体内的时间≤10s。8.根据权利要求1所述的采样方法，其特征在于，步骤4)得到第二原液后，将目标成鱼放入28
±
2℃无菌纯水中清洗至自由游动，正常喂食3-7d后，作为步骤2)的目标成鱼。9.根据权利要求1所述的采样方法，其特征在于，步骤3)、步骤4)所述扩大培养、分离和鉴定包括以下步骤：1)取吸取有第一原液的第一注射器、吸取有第二原液的第二注射器，向含有培养基的厌氧管、好氧管中注入第一原液、第二原液；2)好氧管在28-30℃条件下振荡摇菌扩大培养2-6h，振荡频率为150-200rpm，厌氧管在28-30℃条件下静置扩大培养4-12h；3)取好氧扩大培养液，在洁净环境中涂布在tsa平板和血平板上，在生化培养箱中于28-30℃静置培养12-120h，根据菌株生长情况，在12h、24h、48h时间点挑取单菌落，进行多次传代纯化后鉴定菌种；4)取厌氧扩大培养液，在氧气含量≤0.5％、温度为28
±
2℃条件下涂布在tsa平板和血平板上，然后在tsa平板和血平板上倒入tsa胶，形成密封层，密封层的厚度为2-3mm，在生化
培养箱中于28-30℃精静置培养12-120h，根据菌株生长情况，在12h、24h、48h时间点挑取单菌落，进行多次传代纯化后鉴定菌种。10.根据权利要求9所述的采样方法，其特征在于，步骤3)挑取单菌落的tsa平板和血平板放入冰箱，保存1-2月后，根据平板上菌株生长情况，进行第二批挑取多次传代纯化；步骤4)挑取单菌落的tsa平板和血平板放入冰箱，保存1-2月后，根据平板上菌株生长情况，进行第二批挑取多次传代纯化。

技术总结
一种鱼类肠道菌群活体采样方法，包括步骤：1)在凝胶平板上设置凹槽；2)取目标成鱼，经麻醉和/或包裹于纱布中，在洁净环境中侧躺搁置在步骤1)凝胶平板的凹槽中形成定位，保持目标成鱼鱼体湿润；3)使用第一注射器吸取培养基或生理盐水，且将针头折弯，经目标成鱼的口部进入肠道胃球和前肠部位冲洗，吸取肠道内容物混合液，得到第一原液，用于扩大培养、分离和鉴定；4)使用第二注射器吸取培养基或生理盐水，且将针头折弯，经目标成鱼的泄殖孔进入中后肠部位冲洗，吸取肠道内容物混合液，得到第二原液，用于扩大培养、分离和鉴定。本发明可高准确性、广筛选范围、低成本、快速获得目标成鱼肠道菌群，且目标成鱼可以重复利用。且目标成鱼可以重复利用。且目标成鱼可以重复利用。


技术研发人员：裴得胜 贾盼盼
受保护的技术使用者：重庆医科大学
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/10/15