一种核苷水解酶突变体、基因、表达载体、细胞及其应用

1.本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，具体涉及一种核苷水解酶突变体、基因、表达载体、细胞及其应用。


背景技术：

2.嘌呤类物质作为重要的医药合成物前体一直都有着相当的市场需求。如鸟嘌呤在医药领域可用作洛韦抗病毒药物的中间体，还可以用于化妆品、涂料等领域。以鸟嘌呤为原料合成的双乙酰鸟嘌呤，是合成阿昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦原料药的关键中间体，具有极大的工业生产价值(lehmann b.high yield preparation of acyclovir from guanine and dioxolan:de19604101-a1)。次黄嘌呤是合成抗恶性肿瘤药6-巯嘌呤和硫唑嘌呤的重要中间体。此外，在农业生产上，次黄嘌呤具有杀菌作用，可用作农药中间体。
3.目前，鸟嘌呤和次黄嘌呤的化学合成方法很多，如专利文献cn202210082862.8公开一种鸟嘌呤的一步法合成方法，具体将2，4-二氨基-5-亚硝基-6-羟基嘧啶与甲酰胺溶液混合，加入催化剂升温至80-160℃下进行甲酰化反应，随后再升温进行脱水处理，反应得到鸟嘌呤粗品。专利文献cn202010325300.2公开一种肌苷水解法制备次黄嘌呤的方法，具体是在反应釜中加入溶剂水和酸和肌苷进行搅拌，加热反应至原料反应完毕，随后冷却至室温并调节体系ph至中性，过滤，收集滤饼；滤饼用冰水浸泡、洗涤，抽滤，最后干燥，得到成品次黄嘌呤。
4.然而，化学法通常在较危险的高温高压环境下进行，同时伴随着强氧化剂、强酸及各种有机试剂的使用，对生态环境影响较大，因此绿色环保高效的酶催化法或许是未来的合成方向。
5.酶水解是以多种核苷为原料，在核苷水解酶的催化下反应得到母液，再经过分离得到核糖和对应的嘌呤，无需添加强酸，也无需高温高压环境，同时酶催化的转化率高。但是工业生产条件往往会对酶造成不可逆的破坏，因此，对核苷水解酶进行改造提高酶学性质是非常必要的。


技术实现要素：

6.本发明以来源于trypanosoma cruzi的核苷水解酶为模版，采用分子生物学技术进行定点突变，所述突变体包括对来源于trypanosoma cruzi的核苷水解酶的第63位，第95位，第240位，第248位和第249位氨基酸的单点突变或组合位点突变。本发明获得一系列核苷酸水解酶突变体，经过检测发现，与野生型核苷水解酶相比，突变体的酶活更高，热稳定性更好，同时催化核苷水解活性更高。
7.本发明包括如下具体技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种核苷水解酶突变体，其特征在于，所述突变体是对来源于trypanosoma cruzi的核苷水解酶氨基酸序列进行突变，所述突变包括r63y、s95c、s240l、h248y、v249e中的一种或两种以上的组合。
9.本发明所述的来源于trypanosoma cruzi的核苷水解酶氨基酸序列如seq id no:1所示：
10.mpkavildqdgnhddiislalllawpekvsvigcictdadcfvadafnitgklmcllnkranrplfpigissfhgvnpfpmewrcsaknmddlpslnipehtemweklkpeyeklvgeelladlvmnspekvticvtgplsnvawciekygrrftdkveecvimggavdvggnvflpgtdgtaewniywdppaaktvlecphirnvlfslnstntvpvcsslvkrfgaqneyllsqfvgstwamcthhvllrpgdgyyawdsltaayvidnnladlepmaleveinktkdegrtfrstqgrtctyvakntnaelfydmvlssmric。
11.r63y是指将seq id no:1所示氨基酸序列中第63位的精氨酸(r)突变为酪氨酸(y)；
12.s95c是指将seq id no:1所示氨基酸序列中第95位的丝氨酸(s)突变为半胱氨酸(c)；
13.s240l是指将seq id no:1所示氨基酸序列中第240位的丝氨酸(s)突变为亮氨酸(l)；
14.h248y是指将seq id no:1所示氨基酸序列中第248位的组氨酸(h)突变为酪氨酸(y)；
15.v249e是指将seq id no:1所示氨基酸序列中第249位的缬氨酸(v)突变为谷氨酸(e)。
16.在本发明的一个实施方式中，所述的来源于trypanosoma cruzi的核苷水解酶氨基酸序列中的突变为r63y、s95c、s240l、h248y、v249e中的一种。
17.在本发明的一个实施方式中，所述的来源于trypanosoma cruzi的核苷水解酶氨基酸序列中的突变为：h248y和v249e的组合；r63y、h248y和v249e的组合；r63y、s95c和v249e的组合；r63y、s240l、h248y和v249e的组合；s95c、s240l、h248y和v249e的组合。
18.第二方面，本发明提供一种编码核苷水解酶突变体的基因。
19.第三方面，本发明提供一种核苷水解酶突变体的表达载体，其特征在于，所述表达载体携带编码核苷水解酶突变体的基因。
20.优选的，所述表达载体为质粒、噬菌体或病毒。
21.第四方面，本发明提供一种表达核苷水解酶突变体、含有编码核苷水解酶突变体的基因或核苷水解酶突变体的表达载体的微生物细胞。
22.优选的，所述微生物细胞为原核细胞或真核细胞。
23.更优选的，所述微生物细胞选自大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、乳酸杆菌、曲霉或木霉。
24.第五方面，本发明提供一种核苷水解酶突变体、编码核苷水解酶突变体的基因、核苷水解酶突变体的表达载体在催化核苷制备次黄嘌呤和/或鸟嘌呤中的应用。
25.所述核苷为肌苷和/或鸟苷。
26.本发明提供的以来源于trypanosoma cruzi的核苷水解酶为模版进行定点突变获得的突变体与野生型核苷水解酶相比，突变体的酶活更高，热稳定性更好，同时催化核苷水解活性更高。其中，h248y和v249e双位点突变体，酶活性相比野生型提高了2.4倍，热稳定性提高了1.3倍；r63y、s95c和v249e三位点突变体，酶活性相比野生型提高了2.6倍，热稳定性提高了2.6倍；r63y、s240l、h248y和v249e四位点突变体，酶活性相比野生型提高了1.8倍，
热稳定性提高了5.3倍；s95c、s240l、h248y和v249e四位点突变体，酶活性相比野生型提高了1.4倍，热稳定性提高了7.0倍。
附图说明
27.图1野生型核苷水解酶和各突变体的sds-page电泳图。
28.图2核苷水解酶突变体催化肌苷水解活性图。
29.图3核苷水解酶突变体催化鸟苷水解活性图。
具体实施方式
30.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.实施例1构建野生型核苷水解酶重组表达质粒
32.本发明所述的来源于trypanosoma cruzi的核苷水解酶(野生型核苷水解酶)核苷酸序列如seq id no:2所示：
33.atgccaaaggccgttattttggatcaggatggtaatcacgatgacatcatttctctggcactgctgctagcgtggccagagaaggtaagtgtcattggctgcatctgcacagatgccgattgttttgttgctgatgcattcaacatcaccgggaaactgatgtgccttttaaacaagcgtgcgaaccggcctctttttcccattggcatttcgtcttttcatggcgtgaatccgtttccgatggagtggcgctgttctgcgaaaaacatggatgatttgccctctctgaacattcctgagcacaccgagatgtgggagaagttgaagccagagtatgaaaaactcgtgggtgaggagttgcttgcggatctggtgatgaattcgccggaaaaggtaacgatatgtgtgaccggaccactctccaatgtggcgtggtgtatagagaagtatgggagacgctttacagacaaggtggaggagtgtgtcatcatgggtggcgctgtggatgtcggtggcaatgtttttctcccgggcactgacgggacggcagaatggaacatttattgggatccaccagcagcgaagacggtgctggaatgccctcatatacgcaacgttctcttctcacttaattcgacgaataccgttcctgtatgctcatctcttgtgaagcgctttggtgcccaaaatgagtacttgctttcgcaatttgtgggttccacctgggccatgtgcacgcaccatgtgcttcttcgcccaggcgatggctactatgcctgggattctctgacagccgcctacgtaattgacaacaatttggcagatcttgagccgatggctctggaggtagagattaataaaacaaaggacgaggggcgcacgtttcgttcgacgcaaggacgtacttgcacatatgttgccaagaacaccaatgcagaattattttatgacatggtgctttccagtatgcgtatttgctga
34.将所述野生型核苷水解酶基因与pet-28a(+)质粒通过本领域常规方法进行酶切后连接，将连接产物转化至bl21(de3)，获得重组菌。过夜培养，挑选阳性克隆进行鉴定，将鉴定正确重组表达质粒载体命名为：pet-28a(+)-野生核苷水解酶。
35.野生型核苷水解酶的制备
36.接种上述重组菌至50ml含有50mg/l卡那霉素的lb中，37℃，220rpm培养6-8h，随后按2％接种量接入100ml的lb中于37℃培养，待od600达0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mm的iptg，18℃，220rpm诱导16-18h。离心收集菌体，弃去上清，加入适量的含有10mm咪唑，500mm nacl的50mm nah2po4缓冲液(ph8.0)重悬菌体。将重悬后的菌体加入高压匀浆机中进行破碎，压力为700-800bar，直至菌液变澄清。收集破碎后的菌体，离心得到上清，将上清倒入镍柱中，使用含有不同浓度咪唑的nah2po4缓冲液洗脱，收集200mm咪唑浓度下的洗脱液。将洗脱液超滤浓缩，直至剩余体积达1ml左右，按体积比1:1加入50％的分子级甘油，混匀后分
装，置于-80℃保存备用，对纯化得到的蛋白进行sds-page分析，结果如图1所示。
37.实施例2构建核苷水解酶突变体(单点突变)
38.以含有野生型核苷水解酶基因的重组质粒(pet-28a(+)-野生核苷水解酶)作为模板，对特定位点进行定点突变。利用oligo7软件设计引物后进行pcr定点突变，特定位点的引物如表1所示。
39.表1引物序列
40.引物引物序列r63y-f(seq id no:3)caaacgtgcgaactacccgctgttcccgatcggr63y-r(seq id no:4)ccgatcgggaacagcgggtagttcgcacgtttgs95c-f(seq id no:5)gatctgccgtgcctgaacatcccggaacacas95c-r(seq id no:6)tgtgttccgggatgttcaggcacggcagatcs240l-f(seq id no:7)agttcgttggtctgacctgggcs240l-r(seq id no:8)gcccaggtcagaccaacgaacth248y-f(seq id no:9)aatgtgcacccactacgttctgctgcgtcch248y-r(seq id no:10)gcagaacgtagtgggtgcacattgcccaggv249e-f(seq id no:11)aatgtgcacccaccacgaactgctgcgtccgv249e-r(seq id no:12)cagcagttcgtggtgggtgcacattgcccagg
41.pcr反应体系如下：
[0042][0043][0044]
pcr循环过程如下：
[0045]
预热98℃5min变性98℃10s退火55℃40s延伸72℃30s终延伸72℃10min
[0046]
变性-退火-延伸循环30次。dna聚合酶购买自南京诺唯赞生物科技有限公司。将pcr产物回收，以琼脂糖(1％)凝胶电泳检测，之后进行连接。
[0047]
扩增片段3.5μl载体3.5μl
同源重组酶10μl水3μl总体积20μl
[0048]
混合均匀后，利用同源重组酶(上海吐露港生物科技有限公司)在37℃下连接两段pcr产物25min，得到环化的突变株质粒。连接产物转化大肠杆菌，利用卡那霉素抗性平板培养后，挑单克隆送测序，验证序列正确，得到突变体质粒。根据上述方法分别获得核苷酸水解酶r63y、s95c、s240l、h248y、v249e单突变体。
[0049]
实施例3构建核苷水解酶突变体(组合位点突变)
[0050]
以h248y突变质粒为模板，用上述v249e引物扩增后，利用同源重组酶将得到的dna片段连接，构建h248y/v249e双突变质粒；再以所述双突变质粒为模板，用上述r63y或s95c引物扩增，利用同源重组酶将得到的dna片段连接，得到三突变质粒r63y/h248y/v249e或s95c/h248y/v249e。得到组合突变的核苷水解酶质粒后，转化到大肠杆菌bl21(de3)菌株中，蛋白纯化方法如上所述。
[0051]
根据如上所述的制备方法分别获得核苷酸水解酶h248y/v249e双位点突变体(命名为m1)、核苷酸水解酶r63y/s95c/v249e三位点突变体(命名为m2)、核苷酸水解酶r63y/s240l/h248y/v249e四位点突变体(命名为m3)、核苷酸水解酶s95c/s240l/h248y/v249e四位点突变体(命名为m4)，突变体m1-m4蛋白的sds-page结果如图1所示。
[0052]
效果验证
[0053]
一、酶活测定
[0054]
本发明涉及的核苷水解酶活性测定方法
[0055]
反应体系及反应条件：反应体系包括终浓度10mm的cacl2，16mm的肌苷，ph 4.0-5.0的50mm pb缓冲液，酶液浓度为0.05g/l，总体积500ul。
[0056]
将反应液于37℃反应3min，取样，按照体积比1:1加入1m的盐酸终止反应，将样品在冰上静置10min，随后12000转离心10分钟，收集上清液，使用高效液相色谱检测次黄嘌呤或鸟嘌呤的含量。
[0057]
根据测定得到的次黄嘌呤或鸟嘌呤的浓度计算酶活，酶活定义为每克酶每分钟生成产物微摩尔量。本发明提供的野生型核苷水解酶、单点突变体的酶活数据如下表所示。
[0058]
表2酶活数据
[0059]
菌株野生型r63ys95cs240lh248yv249e酶活(mm/min/g)21.438.516.720.927.833.2酶活比例100％180％78％98％130％155％
[0060]
从酶活检测结果中可见，s95c的酶活出现了下降，而s240l的酶活未明显变化，r63y、h248y、v249e突变都使得酶活性得到了不同程度的提高。
[0061]
二、酶热稳定性测定
[0062]
本发明涉及的核苷水解酶热稳定性测定方法
[0063]
反应体系及反应条件：反应体系包括终浓度10mm的cacl2，16mm的肌苷，ph 4.0-5.0的50mm pb缓冲液，酶液浓度为0.05g/l，总体积500ul。
[0064]
所有酶在纯化后均稀释到终浓度1g/l，并在50℃下进行热处理，每隔一段时间，取25μl酶液加入上述酶活测定体系测定酶活，剩余酶液继续放置于50℃下热处理，测定其酶
活降低为初始酶活一半的时间，记为t
1/2
。本发明提供的野生型核苷水解酶、单点突变体的酶热稳定性据如下表所示。
[0065]
表3酶热稳定性数据
[0066]
菌株野生型r63ys95cs240lh248yv249et
1/2
(h)3.05.17.219.520.212.8
[0067]
从上表热稳定性数据可以看到，本发明提供的核苷水解酶单点突变体的热稳定性菌比野生型核苷水解酶有显著提升。
[0068]
按照如上所述的方法对本发明所述的组合位点突变体的酶活及热稳定性进行检测，结果如下表所示。
[0069]
表4组合位点突变体数据
[0070]
突变体突变位点酶活(mm/min/g)酶活比例t
1/2
(h)m1h248y/v249e/52.4245％4.0m2r63y/s95c/v249e56.2263％7.7m3r63y/s240l/h248y/v249e39.2183％16.1m4s95c/s240l/h248y/v249e30.4142％21.8
[0071]
从上表数据可以看出，m1和m2突变体的酶活有非常显著的提升，m3和m4突变体的热稳定性有非常显著的提升。
[0072]
三、酶催化核苷水解活性测定
[0073]
本发明涉及的核苷水解酶突变体催化核苷水解活性测定方法
[0074]
反应体系及反应条件：反应体系包括终浓度10mm的cacl2，10g/l的肌苷或4g/l的鸟苷，ph 4.0-5.0的50mm pb缓冲液，酶液浓度10mg/l，总体积200ul。
[0075]
将反应液于37℃反应5小时，每反应1小时取样，按照体积比1:1加入1m的盐酸终止反应，将样品在冰上静置10min，随后12000转离心10min，收集上清液，使用高效液相色谱检测次黄嘌呤和鸟嘌呤的含量，计算反应的产率。结果如下表所示，以下数据分别是野生型核苷水解酶、突变体m1、m2、m3、m4催化核苷水解活性数据。
[0076]
表5突变体催化水解活性数据
[0077][0078]
从上表数据可以看到，本发明提供的m1-m4突变体催化核苷的水解活性均比较高，水解5小时后肌苷的水解活性可达到99％，鸟苷的水解活性可达到97％。通过对水解活性曲线分析，m2突变体的肌苷水解活性更高，m1突变体的鸟苷水解活性更高。
[0079]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽
管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种核苷水解酶突变体，其特征在于，所述突变体是对来源于trypanosoma cruzi的核苷水解酶氨基酸序列进行突变，所述突变包括r63y、s95c、s240l、h248y、v249e中的一种或两种以上的组合。2.根据权利要求1所述的核苷水解酶突变体，其特征在于，所述的来源于trypanosoma cruzi的核苷水解酶氨基酸序列中的突变为r63y、s95c、s240l、h248y、v249e中的一种。3.根据权利要求1所述的核苷水解酶突变体，其特征在于，所述的来源于trypanosoma cruzi的核苷水解酶氨基酸序列中的突变为：h248y和v249e的组合；r63y、h248y和v249e的组合；r63y、s95c和v249e的组合；r63y、s240l、h248y和v249e的组合；s95c、s240l、h248y和v249e的组合。4.一种编码权利要求1所述的核苷水解酶突变体的基因。5.一种核苷水解酶突变体的表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求4所述的基因。6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为质粒、噬菌体或病毒。7.一种表达权利要求1所述的核苷水解酶突变体、含有权利要求4所述的编码核苷水解酶突变体的基因或权利要求5所述的表达载体的微生物细胞。8.根据权利要求7所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为原核细胞或真核细胞，具体选自大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、乳酸杆菌、曲霉或木霉。9.一种权利要求1所述的核苷水解酶突变体、权利要求4所述的编码核苷水解酶突变体的基因、权利要求5所述的表达载体在催化核苷制备次黄嘌呤和/或鸟嘌呤中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述核苷为肌苷和/或鸟苷。

技术总结
本发明公开一种核苷水解酶突变体，所述突变体以来源于Trypanosoma cruzi的核苷水解酶为模版，采用分子生物学技术进行定点突变，所述突变包括R63Y、S95C、S240L、H248Y、V249E中的一种或两种以上的组合。本发明提供的核苷水解酶突变体与野生型核苷水解酶相比，突变体的酶活更高，热稳定性更好，同时催化核苷水解活性更高。更高。更高。


技术研发人员：赵成源 李志敏 李宗霖 徐文杰 杨思豪
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：2023.07.10
技术公布日：2023/10/15