狄氏副拟杆菌在制备促进肝脏再生的产品中的应用

1.本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及狄氏副拟杆菌在制备促进肝脏再生的产品中的应用。


背景技术：

2.活体肝移植和部分肝切除(partial hepatectomy，phx)是目前临床上治疗终末期肝癌、肝硬化等终末期肝脏疾病最常用、最有效的手段。肝脏强大的再生能力是临床上实施活体肝移植和部分肝切除的基础，但残余肝脏再生能力不良常常会导致肝病患者术后严重的肝衰竭，最终导致死亡。因此，肝脏再生对于损伤后肝功能的恢复至关重要，开发能够提高肝移植和切除术后肝脏再生能力的药物和方法，对于临床上促进肝脏再生、提高肝移植或部分肝切除患者的预后，具有重要的临床意义。
3.现有研究发现，肠道菌群衍生信号在肝再生过程的重要调控作用，深入探讨肠道细菌及其代谢产物对肝再生的调控机制有助于提高肝移植和切除术后肝脏再生能力的药物的开发。但现有关于能够提高肝移植和部分肝切除术后肝脏再生能力的菌株的报道较少，不利于相关药物的开发。另肠道细菌数量众多，如何从中挖掘出有益于肝脏再生的细菌也是不小的挑战。
4.狄氏副拟杆菌(parabacteroides distasonis，p.distasonis)是1933年sakamoto和benno首次从临床标本中分离出来的革兰氏阴性专性厌氧菌。现有报道发现其具有改善雷公藤甲素引起的雄性生殖毒性、缓解阿尔茨海默病的病理改变以及缓解肝纤维化等作用。此外，有研究发现，在绿原酸改善乙酰氨基酚所致的急性肝损伤小鼠模型中观察到狄氏副拟杆菌和阿克曼菌属的丰度增加，提示这两种细菌可能对急性肝损伤可能有益。但能缓解肝纤维化或对急性肝损伤有益并不意味着狄氏副拟杆菌就可以促进肝脏再生，目前也并未见有关于狄氏副拟杆菌可以促进肝脏再生的报道。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是克服缺乏提高肝移植和部分肝切除术后肝脏再生能力的药物的缺陷和不足，提供狄氏副拟杆菌在制备促进肝脏再生的产品中的应用。
6.本发明的第一个目的是提供狄氏副拟杆菌在制备促进肝脏再生的产品中的应用。
7.本发明的第二个目的是狄氏副拟杆菌在制备促进肝脏细胞增殖的产品中的应用。
8.本发明的第三个目的是提供一种促进肝脏再生的药物。
9.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
10.本发明发现狄氏副拟杆菌可以通过促进部分肝切除术后肝组织脂肪酸氧化生成代谢物β-羟基丁酸(β-hydroxybutyric acid，bhb)，加速肝重恢复和促肝细胞增殖，进而促进肝脏再生。因此，本发明请求保护狄氏副拟杆菌的以下应用：
11.本发明请求保护狄氏副拟杆菌在制备促进肝脏再生的产品中的应用。
12.本发明还请求保护狄氏副拟杆菌在制备促进肝脏细胞增殖的产品中的应用。
13.具体地，狄氏副拟杆菌通过促进肝脏脂肪酸氧化，通过增加β-羟基丁酸生成促进肝细胞增殖，进而促进肝脏再生和肝脏恢复。
14.具体地，所述狄氏副拟杆菌为狄氏副拟杆菌活菌。
15.具体地，所述肝脏为部分肝切除术后的肝脏。
16.具体地，肝切除部分不超过原肝脏体积的2/3。
17.具体地，所述促进肝脏再生或促进肝细胞增殖的产品中包括狄氏副拟杆菌及其药学上可接受的载体。
18.可选地，所述狄氏副拟杆菌为保藏编号为gdmcc no：1.1564的狄氏副拟杆菌。
19.可选地，所述药学上可接受的载体为磷酸缓冲盐(pbs)溶液。
20.具体地，所述产品包括但不限于药物和保健品。
21.本发明还提供了一种促进肝脏再生的药物，所述药物中含有狄氏副拟杆菌及其药学上可接受的载体。
22.可选地，所述狄氏副拟杆菌为保藏编号为gdmcc no：1.1564的狄氏副拟杆菌。
23.可选地，所述药学上可接受的载体为磷酸缓冲盐(pbs)溶液。
24.具体地，所述狄氏副拟杆菌的用量至少为109cfu/d。
25.本发明具有以下有益效果：
26.本发明发现，狄氏副拟杆菌可以通过促进部分肝切除手术后的肝组织脂肪酸氧化增加代谢物β-羟基丁酸生成，加速肝重恢复和肝细胞增殖，从而促进肝脏再生，即可将狄氏副拟杆菌用于制备促进肝脏再生的产品。本发明不仅公开了狄氏副拟杆菌在促肝再生方面的新应用，同时为后续临床上开发促进肝再生的干预策略提供理论基础，有助于用于提高肝移植和部分肝切除术后肝脏再生能力的药物的开发。
附图说明
27.图1为狄氏副拟杆菌对小鼠部分肝切除术后肝脏体积、肝重及肝/体重比的影响结果；图中的a为给菌后不同时间点小鼠肝脏图片；图中的b为给菌后不同时间点小鼠的肝重变化；图中的c为给菌后不同时间点小鼠的肝/体重比变化；数据表示为平均值
±
标准差；与vehicle组相比，*p《0.05。
28.图2为狄氏副拟杆菌对小鼠部分肝切除术后肝细胞增殖的影响结果；图中的a为肝组织ki67染色结果；图中的b为ki67阳性细胞定量结果(n＝3)；数据表示为平均值
±
标准差；与vehicle组相比，***p《0.001，n.s.表示没有统计学意义；比例尺＝50μm。
29.图3为狄氏副拟杆菌对小鼠部分肝切除术后肝细胞增殖相关蛋白表达的影响结果；图中的a为肝组织中ccna1、ccnd1、ccne1、cdk4蛋白表达检测结果；图中的b为增殖相关蛋白表达和定量结果(n＝3)；数据表示为平均值
±
标准差；与vehicle相比，*p《0.05，***p《0.001。
30.图4为狄氏副拟杆菌对小鼠部分肝切除术后肝脏中脂肪酸氧化相关基因mrna水平的影响结果；图中的a为脂肪酸摄取相关基因mrna水平；图中的b为脂肪酸合成相关基因mrna水平；图中的c为脂肪酸氧化相关基因mrna水平；图中的d为β-羟基丁酸生成相关基因mrna水平；数据表示为平均值
±
标准差(n＝6)；与vehicle组相比，*p《0.05。
31.图5为狄氏副拟杆菌对小鼠部分肝切除术后肝脏中脂肪酸氧化相关蛋白的影响结
果；图中的a为脂肪酸氧化相关蛋白表达检测结果；图中的b为蛋白表达的定量结果(n＝3)；数据表示为平均值
±
标准差；与vehicle组相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
32.图6为狄氏副拟杆菌对小鼠部分肝切除术后肝脏中β-羟基丁酸含量的影响结果；数据表示为平均值
±
标准差；与vehicle组相比，**p《0.01。
具体实施方式
33.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
34.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
35.本发明实施例中所用狄氏副拟杆菌(parabacteroides distasonis，p.distasonis)购自广东省微生物菌种保藏中心，编号为gdmcc no：1.1564。狄氏副拟杆菌厌氧由广州睿博科技有限公司进行测序鉴定。
36.本发明实施例中所用实验动物为c57bl/6小鼠，雄性，周龄7周，体重20～23g，购于广东药康生物科技有限公司，动物合格证号scxk(粤)2020-0054；检验检疫后饲养于南方医科大学实验动物中心；饲养的标准实验条件：温度22～25℃，湿度55～70％，光照黑暗循环各12h，光照8:00～20:00；黑暗20:00～次日8:00，自由摄取水和食物，用南方医科大学实验动物中心提供的普通饲料适应性喂养1周；所述动物研究方案符合南方医科大学实验动物伦理委员会要求。
37.本发明的实验数据均以平均值
±
标准误差(mean
±
s.d.)进行统计，使用spss 20.0软件对数据进行统计分析；蛋白条带灰度检测使用image j 1.53软件进行处理；采用one-way anova进行多样本均数比较和方差分析，student’s t test进行两组间比较分析；采用graphpad prism 8.0软件进行图表绘制；p《0.05代表两者间具有统计学意义(*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001)。
38.实施例1狄氏副拟杆菌对小鼠部分肝切除术后肝脏体积、肝重及肝/体重比的影响
39.1、实验方法
40.(1)部分肝切除手术
41.对实验小鼠进行部分肝切除手术，手术方法如下：
42.1)将所有手术器械和小鼠缝合钉进行高压灭菌消毒。
43.2)小鼠麻醉：采用3.5％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量为350mg/kg；
44.3)开腹：用医用胶布将小鼠四肢固定于手术板上，去掉胸腹部鼠毛，腹部用碘伏消毒，用手术剪沿腹中线剪开至剑突下约1cm的开口。
45.4)切除肝叶：用手轻轻挤压小鼠切口两侧将左前叶、右前叶和左后叶挤出腹部切口，将4-0缝合线置于左前叶底部进行外科打结法结扎，用剪刀小心剪去结扎的肝叶和多余的缝合线，用棉签吸去腹腔中的血液；右前叶和左后叶同左前叶的切除方法一样；约切除肝脏总体积的2/3。
46.5)缝合：用镊子将开口两边腹膜和皮肤提起，利用9mm缝合钉把开口两边的腹膜和皮肤一起钉住；给小鼠皮下注射1ml生理盐水，将其置于温暖环境中促其苏醒。
47.(2)抗生素(antibiotics，abx)溶液配制
80℃冰箱保存。摘取眼球取血并颈椎脱臼处死小鼠，剖腹，取出肝脏，去除坏死组织，用生理盐水涮洗肝脏表面血液，滤纸吸干表面水分，称量肝脏重量并记录，摆放好直尺拍摄立体肝脏照片。每一份肝脏样本取同一叶肝脏部位大致分为相同的两块肝组织，一份固定于4％多聚甲醛溶液中，做后续h&e和ki67染色实验，剩余肝脏组织装入ep管中，置于-80℃冰箱保存；取出小肠、盲肠、盲肠内容物及结直肠，装入ep管中，置于-80℃冰箱保存。
68.2、实验结果
69.狄氏副拟杆菌(p.distasonis)对小鼠部分肝切除(phx)术后肝脏体积、肝重及肝/体重比的影响结果如图1所示；图1中的a为给菌后不同时间点小鼠肝脏图片；图1中的b为给菌后不同时间点小鼠的肝重变化；图1中的c为给菌后不同时间点小鼠的肝/体重比变化；数据表示为平均值
±
标准差；与vehicle组相比，*p《0.05。由图1可知，phx术后不同时间点vehicle组和p.distasonis组小鼠肝重分别为0d(0.37
±
0.04g、0.35
±
0.05g)、1d(0.42
±
0.06g、0.45
±
0.04g)、2d(0.48
±
0.06g、0.55
±
0.04g)和5d(0.73
±
0.08g、0.78
±
0.08g)；肝/体重比分别为0d(1.7％、1.7％)、1d(2.0％、2.1％)、2d(2.2％、2.6％)和5d(3.0％、3.5％)；从结果可以看到，两组小鼠肝体积、肝重和肝/体重比随着phx术后时间延长而增加。在术后1d，两组小鼠肝体积，肝重和肝/体重比无显著差异；但在术后2d，相比于vehicle组，p.distasonis组小鼠肝体积、肝重和肝/体重显著增加；在phx术后5d，p.distasonis组小鼠肝体积和肝/体重显著增加；表明狄氏副拟杆菌可加速小鼠phx术后肝再生和肝重恢复。
70.实施例2狄氏副拟杆菌对小鼠部分肝切除术后肝细胞增殖的影响
71.1、实验方法
72.(1)肝脏组织ki67染色
73.ki67蛋白在细胞核表达，其水平能够准确的反映肝细胞增殖水平。肝脏组织ki67染色过程如下所示：
74.1)脱蜡复水：将石蜡切片依次放入二甲苯ⅰ5min
→
二甲苯ⅱ5min
→
二甲苯ⅲ5min
→
50％无水乙醇/50％二甲苯1min
→
无水乙醇ⅰ1min
→
无水乙醇ⅱ1min
→
95％酒精2min
→
80％酒精2min
→
70％酒精2min，将切片取出，用蒸馏水洗涤3次，5min/次；
75.2)抗原修复：染缸中加0.01mol/l枸橼酸溶液没过切片，于微波炉中高火加热至沸腾后加盖，转中低火加热11min，结束后取出，室温冷却；
76.3)pbs漂洗：切片冷却至室温后，弃掉抗原修复液，加入pbs缓冲液没过切片，于水平摇床上漂洗3次，80r/min，5min/次；
77.4)内源性过氧化酶阻断：pbs缓冲液漂洗过后，用滤纸吸干多余的pbs,用免疫组化笔画圈标记组织，滴加3％过氧化氢溶液覆盖组织，置于湿盒中，室温避光孵育15min；使用pbs缓冲液于水平摇床上漂洗3次，80r/min，5min/次；
78.5)封闭：在圈内滴加10％山羊血清，室温下湿盒中封闭1h；
79.6)一抗孵育：用滤纸擦去多余的山羊血清，切勿碰到组织，按照一抗说明书稀释抗体，将抗体稀释液滴加在组织上，放入湿盒中4℃孵育过夜；
80.7)二抗孵育：轻轻甩掉玻片上的一抗，放入染缸中，加入pbs缓冲液于摇床上漂洗3次，5min/次；用滤纸吸干玻片上多余的pbs，滴加相应的二抗并于湿盒中室温孵育1h，使用pbs缓冲液于摇床上漂洗3次，5min/次；
81.8)dab显色液配置：玻片漂洗期间按照每1ml b液滴加一滴a液的比例配置dab工作液，现用现配；
82.9)dab显色：将dab工作液滴加到组织上，于显微镜下观察至阳性区域显色，记录显色所需要的时间，结束后将切片放入含有蒸馏水的染缸中终止显色；
83.10)苏木素染细胞核：将切片置于苏木素染液中浸泡1～5s，流水冲洗至不变色，再用盐酸酒精分化1～2s，自来水洗涤，然后用1％氨水浸泡破片3min返蓝，再次自来水洗涤。
84.11)脱水封片：将切片依次放入70％乙醇2min
→
80％乙醇2min
→
95％乙醇2min
→
无水乙醇ⅰ1min
→
无水乙醇ⅱ1min
→
50％无水乙醇/50％二甲苯1min
→
二甲苯ⅰ5min
→
二甲苯ⅱ5min
→
二甲苯ⅲ5min中脱水，将切片从二甲苯中拿出，立即在组织上滴加中性树脂，盖上盖玻片，封片时避免产生气泡，晾干切片，于显微镜下拍照。
85.(2)蛋白质免疫印记
86.本发明进一步检测了phx术后vehicle组和p.distasonis组肝组织中细胞周期蛋白a1(cyclin a1，ccna1)、d1(cyclin d1，ccnd1)、e1(cyclin e1，ccne1)和周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，cdk4)的表达水平。ccna1和ccnd1的表达是肝细胞进入细胞周期s期的主要标志物；ccne1和cdk4调控细胞周期g1期向s期转变。蛋白质免疫印记的主要步骤如下所示：
87.1)肝脏组织总蛋白提取
88.①
将肝组织从-80℃冰箱中取出，放于冰上解冻；
89.②
标记匀浆管并在匀浆管中放入2粒陶珠；
90.③
称取30mg左右的肝组织，放入匀浆管中，加入500μl蛋白ripa裂解液(用前按1：100比例加入pmsf和磷酸酶抑制剂)，拧紧匀浆管盖；
91.④
将匀浆管放入匀浆器中，匀浆2次；
92.⑤
匀浆结束后冰上静置20min，将上清液转移至新的1.5ml离心管中，4℃、16000g离心30min；
93.⑥
离心结束后，将200μl上清液转移至新的1.5ml离心管中，使用bca试剂盒测定蛋白浓度。
94.2)bca法蛋白浓度测定
95.①
将浓度为2000μg/ml的牛血清白蛋白标准品用pbs缓冲液分别稀释成1000、500、250、125和62.5μg/ml；
96.②
吸取10μl待测样本原液，加入290μl pbs缓冲液，将待测样本稀释30倍；
97.③
按照+2的检测样品量配置bca工作液，将bca试剂a和试剂b按照50：1的比例混合，然后将bca工作液加入到96孔板中(避免产生气泡)，200μl/孔；
98.④
将25μl稀释的蛋白标准品和样本加入到96孔板对应孔中，轻拍混匀；
99.⑤
将96孔板放置于37℃隔水式电热恒温培养箱中反应30min；
100.⑥
使用多功能酶标仪在562nm波长处测量标准品和待测样品的od值；
101.⑦
根据稀释的蛋白标准品浓度和测得的od值绘制标准曲线，然后根据该曲线计算待测样品的蛋白浓度；
102.⑧
根据计算得到的样本蛋白浓度，用双蒸水和5
×
loading buffer稀释蛋白浓度至2μg/μl，将配制后的蛋白样品放在100℃的干式恒温器中，加热10min使蛋白变性，冷却至
室温后，于-80℃冰箱保存。
103.3)蛋白质免疫印迹实验
104.①
配置分离胶，用无水乙醇压平液面，等待30min至分离胶凝固；
105.②
弃掉无水乙醇，用滤纸吸干多余的无水乙醇；配置浓缩胶，小心快速的加入到胶板中，尽量避免产生气泡，然后插入15孔梳，等待30min至浓缩胶凝固，将制备好的凝胶浸泡于电泳液中，4℃冰箱保存备用；
106.③
上样：将蛋白样品从-80℃冰箱取出，放在100℃干式恒温器加热2min解冻样品，涡旋混匀，瞬离；将凝胶版装入电泳架中，加入电泳液，轻轻拔出15孔梳；用上样枪头在相应泳道中加入15μl蛋白样品以及3μl蛋白marker，放入电泳槽中准备电泳；
107.④
电泳：完成上样后，盖上转印槽盖子，接通电源(注意正负极：红对红，黑对黑)，恒压70v电泳30min后，再转换电压为120v，继续电泳，待loading buffer蓝色指示带跑到胶板底部时，即可停止电泳；
108.⑤
电转：将裁剪好的pvdf膜浸泡在甲醇中活化；取出胶板，切下目的蛋白凝胶，电转夹从负极到正极依次放置海绵、滤纸、凝胶、pvdf膜、滤纸、海绵，注意膜与胶之间产生不要有气泡；接通电源，恒流230a条件下电转；根据蛋白的分子量设置电转时间，70kd以下蛋白电转75min，70kd以上蛋白电转90min，90kd以上蛋白电转120min，120kd以上蛋白电转150min；
109.⑥
封闭：转膜结束后，取出转膜夹，将pvdf膜置于5％脱脂牛奶中，水平摇床上室温封闭1h；
110.⑦
一抗孵育：封闭结束后取出pvdf膜，tbst涮洗去除残留牛奶，放于对应的一抗稀释液中，4℃孵育过夜；
111.⑧
二抗孵育：将膜取出，tbst洗膜3次，10min/次；室温孵育相应二抗1h；再取出膜，用tbst洗膜3次，10min/次；
112.⑨
显影：打开化学发光仪，使仪器预冷至工作温度；将a、b液等体积混合置成显影液，用滤纸吸干pvdf膜上多余的tbst，完全浸泡在显影液中5～10s，然后放入化学发光仪中显影。
113.2、实验结果
114.(1)狄氏副拟杆菌促进部分肝切除术后小鼠肝细胞增殖
115.狄氏副拟杆菌(p.distasonis)对小鼠部分肝切除(phx)术后肝细胞增殖的影响结果如图2所示；图2中的a为肝组织ki67染色结果；图2中的b为ki67阳性细胞定量结果(n＝3)；数据表示为平均值
±
标准差；与vehicle组相比，***p《0.001，n.s.表示没有统计学意义；比例尺＝50μm。由图2可知，p.distasonis组小鼠在phx术后1d观察到ki67表达，但在vehicle组中未观察ki67阳性细胞染色；phx术后2d，p.distasonis组中可见密集的棕黄色细胞核染色，ki67阳性细胞达到峰值(阳性细胞率为41.5％)，显著高于vehicle组(阳性细胞率为17.6％)；phx术后5d，p.distasonis组中ki67阳性细胞数虽明显减少(阳性细胞率为10.4％)，表明细胞增殖活力下降，但仍高于vehicle组(阳性细胞率为3.2％)；以上结果表明，狄氏副拟杆菌促进部分肝切除术后肝脏细胞的增殖。
116.(2)狄氏副拟杆菌上调部分肝切除术后小鼠肝脏中增殖相关蛋白表达
117.狄氏副拟杆菌(p.distasonis)对小鼠部分肝切除(phx)术后肝细胞中增殖相关蛋
白表达的影响结果如图3所示；图3中的a为肝组织中ccna1、ccnd1、ccne1、cdk4蛋白表达检测结果；图3中的b为增殖相关蛋白表达和定量结果(n＝3)；数据表示为平均值
±
标准差；与vehicle相比，*p《0.05，**p《0.01。由图3可知，与vehicle组相比，p.distasonis组的肝组织中ccna1蛋白表达在术后1d显著上调(上调了1.7倍)，在术后5d基本恢复至vehicle组初始水平；ccnd1蛋白表达在术后1d显著上调(上调了1.5倍)；cdk4蛋白表达在phx术后1d和2d时间点显著上调(分别上调了2.1、2.1倍)；而ccne1蛋白表达在术后均无显著差异；表明给予狄氏副拟杆菌能够上调部分肝切除术后肝脏中增殖相关蛋白表达。
118.实施例3狄氏副拟杆菌对小鼠部分肝切除术后肝脏脂肪酸氧化的影响
119.1、实验方法
120.(1)实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，qpcr)方法
121.当部分肝切除术后肝细胞复制需要能量时，可以从血液中摄取或者从头合成脂肪酸，随后经脂肪酸氧化酶氧化产生能量。为了进一步考察狄氏副拟杆菌是否调节部分肝切除术后肝再生过程脂肪酸代谢，本发明运用qrcr方法检测了vehicle组和p.distasonis组小鼠肝组织中脂肪酸摄取、合成、氧化及β-羟基丁酸(bhb)生成相关基因mrna水平。qrcr方法的主要步骤如下所示：
122.1)rna提取
123.①
将肝组织从-80℃冰箱中取出，放于冰上解冻；
124.②
预冷离心机，准备2套无rna酶1.5ml离心管，标记匀浆管并在匀浆管中放入2粒陶珠；
125.③
称取约30mg肝脏组织，加入500μl ag rnaex pro reagent，拧紧匀浆管管盖；
126.④
将匀浆管放入匀浆器中，匀浆2次；
127.⑤
匀浆结束后，掌上离心机瞬离，然后将匀浆液转移到新的1.5ml离心管中，4℃、12000g离心5min，离心结束后小心吸取400μl上清液，转移到新1.5ml离心管中；
128.⑥
每管加入1/5rnaex体积量的氯仿，充分涡旋混匀，室温静置10min后4℃、12000g离心15min；
129.⑦
离心后液体分为3层，小心吸取上清液转移到新的1.5ml离心管中(切勿吸出中间蛋白层)；
130.⑧
每管加入1/2rnaex体积量的异丙醇，上下温柔颠倒混匀，室温静置10min，4℃、12000g离心10min，离心结束后，弃掉上清；
131.⑨
沉淀用500μl 75％乙醇(无水乙醇：depc水＝3:1)充分洗涤rna沉淀，小心尽量不要将rna沉淀吹散，4℃、7500g离心5min；
132.⑩
离心结束后，大枪头套小枪头吸掉75％乙醇溶液，在通风橱中室温挥干残留乙醇，加入depc水溶解沉淀，得rna溶液；使用nanodrop 2000测定rna浓度和纯度。
133.2)rna逆转录成cdna
134.①
去除基因组dna反应
135.根据所测rna浓度计算出每个样本反应所需的rnase free h2o和rna的体积(基因组dna去除体系参见表1)；在无rnase的200μl pcr八联管中分别加入相应的rnase free h2o，然后再加入5
×
g dna digester mix到每个pcr八联管，最后加入rna样本，混匀后瞬离；将pcr反应管放在普通梯度pcr仪中，反应程序设为42℃，2min
→
4℃。
136.表1基因组dna去除体系
[0137][0138]
②
逆转录反应
[0139]
去除基因组dna反应结束后，在第1步的反应液中，将5μl的ⅲsupermix plus分装到每个pcr反应孔中，混匀，瞬离；将pcr反应管放在普通梯度pcr仪中，反应程序设为：25℃5min
→
55℃15min
→
85℃5min
→
4℃；反应完成后进行实时荧光定量pcr反应，或暂存放于超低温冰箱。
[0140]
3)qpcr
[0141]
①
设计qpcr所需引物(如表2所示)并委托华大基因公司合成，收到的引物干粉保存于-20℃冰箱；
[0142]
②
引物稀释：引物干粉于4000rpm离心1min后小心打开引物管盖，加入超纯水使其浓度为10μm，轻轻混匀后瞬离，分装，保存于-20℃冰箱；
[0143]
③
cdna稀释：将cdna原液用depc水稀释7～10倍，加入的模板量以扩增得到的ct值在20～30个循环为好；
[0144]
④
在冰上配制反应液，qpcr反应体系如表3所示；按照样本数+3的量配制hieff qpcr sybr green master mix、forward primer、reverse primer混合液；
[0145]
⑤
将cdna稀释液和混合液先后加至qpcr 96孔板中，盖上封板膜，混匀后瞬离；
[0146]
⑥
将qpcr 96孔板放于7500real time pcr仪中(仪器提前10min开机预热)，反应程序设为：95℃5min
→
(95℃10s，60℃30s)
×
40cycles
→
95℃15s
→
60℃60s
→
95℃15s；
[0147]
⑦
反应结束后，查看溶解曲线是否出现双峰，若无双峰，可进行后续统计分析。
[0148]
表2rt-qpcr引物序列
[0149][0150][0151]
表3qpcr反应体系
[0152][0153]
(2)蛋白质免疫印记
[0154]
本发明通过蛋白质免疫印记实验进一步检测了狄氏副拟杆菌对小鼠部分肝切除术后肝再生过程中mrna水平显著变化基因的蛋白表达变化水平，所述蛋白质免疫印记实验过程同实施例2。
[0155]
(3)肝组织中β-羟基丁酸含量检测
[0156]
本发明根据β-羟基丁酸测定试剂盒说明书检测了vehicle组和p.distasonis组部分肝切除术后各个时间点肝脏中β-羟基丁酸含量，具体步骤如下：
[0157]
1)溶液配制
[0158]
①
β-羟基丁酸酶溶液：临用前取出混合冻干酶粉，加入2.4mlβ-羟基丁酸检测缓冲液充分溶解，置于冰上备用。
[0159]
②
显影剂溶液：临用前取一支重组酶溶液加入100μl wst-1溶液，充分溶解，置于冰上备用。
[0160]
③
标准溶液配置：取8个干净的1.5ml离心管，做好标记；将1mmβ-羟基丁酸标准溶液，用β-羟基丁酸检测缓冲液稀释为0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025、0mm标准溶液，置于冰上备用。
[0161]
2)样本处理
[0162]
将肝组织样本从-80℃冰箱取出，冰上解冻；称取350～400mg组织，放入匀浆管中，加入β-羟基丁酸检测缓冲液(用前按1：100比例加入蛋白酶抑制剂)，选择“work”程序，匀浆2次；匀浆结束后，样本转移至低温高速离心机4℃、1000g离心10min；将上清液转移到新的1.5ml离心管中并在4℃、10000g离心10min；去除上清液，加入1ml检测缓冲液重悬，放置冰上备用。
[0163]
3)检测
[0164]
在96孔板中加入50μl标准品或者样本，然后向所有使用的孔中加入50μl显影剂溶液，加样时避免产生气泡；将板放在25℃避光孵育30min；使用酶标仪读取445～455nm处的吸光度。
[0165]
4)β-羟基丁酸含量计算
[0166]
①
用标准品和样品所得的吸光度值减去标准品0mm的吸光度值，得到校正后的吸光度。
[0167]
②
将每个标准品的校正吸光度值绘制标准曲线，然后根据该曲线计算待测样品中β-羟基丁酸的浓度。
[0168]
2、实验结果
[0169]
(1)狄氏副拟杆菌上调部分肝切除术后肝脏中脂肪酸氧化相关基因mrna水平
[0170]
狄氏副拟杆菌(p.distasonis)对小鼠部分肝切除(phx)术后肝脏中脂肪酸氧化相关基因mrna水平的影响如图4所示；图4中的a为脂肪酸摄取相关基因mrna水平；图4中的b为脂肪酸合成相关基因mrna水平；图4中的c为脂肪酸氧化相关基因mrna水平；图4中的d为β-羟丁酸(bhb)生成相关基因mrna水平；数据表示为平均值
±
标准差(n＝6)；与vehicle组相比，*p《0.05。由图4可知，两组小鼠肝组织中脂肪酸摄取相关基因长链脂肪酸转运蛋白1(long-chain fatty acid transport protein 1，fatp)、长链脂肪酸辅酶a连接酶(long chain fatty acid coa ligase，acsl)和脂肪酸转位酶(fatty acid translocase，cd36)mrna水平在phx术后各个时间点均无显著差异，说明给予狄氏副拟杆菌不影响术后肝脏对脂肪酸的摄取(图4中的a)。随后，脂肪酸合成相关基因脂肪酸合酶(fatty acid synthase，fas)、硬脂酰辅酶a去饱和酶1(stearyl coenzyme adesaturation 1，scd1)、脂滴包被蛋白2(perilipin 2，plin2)mrna水平检测发现，两组间fas水平在术后各个时间点无显著差异。与vehicle组相比，p.distasonis组中scd1和plin2 mrna水平在部分肝切除术后2d显著下调(分别下调了1.4、1.8倍)(图4中的b)。
[0171]
而针对脂肪酸氧化相关基因肉毒碱棕榈酰转移酶1a(carnitine palmitoyl transferase 1α，cpt1α)、过氧化物酶体激活受体α(proliferators-activated receptors alpha，pparα)、长链特异性酰基辅酶a脱氢酶(long-chain specific acyl-coa dehydrogenase，lcad)mrna的检测发现，与vehicle组相比，p.distasonis组中cpt1αmrna水平在术后1d显著上调(上调了2.3倍)；pparαmrna水平在术后1d和5d呈现上调的趋势。与vehicle组相比，lcad mrna水平在术后1d呈上调的趋势，在术后2d和5d呈下调的趋势，但无显著差异(图4中的c)。进一步检测了脂肪酸氧化下游β-羟基丁酸生成相关酶3-羟甲基戊二酰辅酶a合酶2(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coa synthase 2，hmgcs2)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a裂解酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coa lyase，hmgcl)、β-羟丁酸脱氢酶(β-hydroxybutyrate dehydrogenase 1，bdh1)的基因表达水平。如图4中的d所示，相比vehicle组，在phx术后1d，给予狄氏副拟杆菌显著上调hmgcs2、hmgcl、bdh1基因表达(分别上调了1.9、2.5、1.8倍)。由上述结果可知，狄氏副拟杆菌上调部分肝切除术后小鼠肝脏中脂肪酸氧化和β-羟基丁酸生成相关基因的表达，表明狄氏副拟杆菌通过促进肝组织脂肪酸氧化生成代谢物β-羟基丁酸促进肝细胞增殖和肝脏再生。
[0172]
(2)狄氏副拟杆菌上调部分肝切除术后肝脏中脂肪酸氧化相关蛋白表达
[0173]
狄氏副拟杆菌对小鼠部分肝切除术后肝脏中脂肪酸氧化相关蛋白的影响如图5所示；图5中的a为脂肪酸氧化相关蛋白表达检测结果；图5中的b为蛋白表达的定量结果(n＝3)；数据表示为平均值
±
标准差；与vehicle组相比，*p《0.05，**p《0.01。由图5可知，相比于vehicle组，狄氏副拟杆菌显著上调部分肝切除术后pparα、cpt1α、hmgcs2、hmgcl及bdh1蛋白水平，表明狄氏副拟杆菌上调部分肝切除术后小鼠肝脏中脂肪酸氧化和β-羟基丁酸生成相关蛋白表达。
[0174]
(3)狄氏副拟杆菌增加部分肝切除术后肝脏中β-羟基丁酸含量
[0175]
狄氏副拟杆菌(p.distasonis)对小鼠部分肝切除术后肝脏中β-羟基丁酸(bhb)含量的影响结果如图6所示，由图6可知，vehicle组肝脏中β-羟基丁酸含量在phx术后1d和2d
显著增加，在术后5d，β-羟基丁酸含量基本恢复至初始水平。在部分肝切除术后2d，与vehicle组相比，给予狄氏副拟杆菌显著增加小鼠β-羟基丁酸在肝脏(0.54
±
0.05mm对比1.04
±
0.19mm)中含量。
[0176]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.狄氏副拟杆菌在制备促进肝脏再生的产品中的应用。2.狄氏副拟杆菌在制备促进肝脏细胞增殖的产品中的应用。3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，狄氏副拟杆菌通过促进脂肪酸氧化促进肝脏细胞增殖。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，狄氏副拟杆菌通过促进脂肪酸氧化生成代谢物β-羟基丁酸促进肝脏细胞增殖。5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述肝脏为部分肝切除术后的肝脏。6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，肝切除部分不超过原肝脏体积的2/3。7.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述产品包括狄氏副拟杆菌及其药学上可接受的载体。8.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述产品包括药物和保健品。9.一种促进肝脏再生的药物，其特征在于，所述药物中含有狄氏副拟杆菌。10.根据权利要求9所述药物，其特征在于，所述药物中还含有狄氏副拟杆菌药学上可接受的载体。

技术总结
本发明公开了狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis，P.distasonis)在制备促进肝脏再生的产品中的应用。本发明发现，在部分肝切除手术后，狄氏副拟杆菌可以通过促进肝组织脂肪酸氧化生成代谢物β-羟基丁酸(β-hydroxybutyric acid，BHB)的产生，加速肝细胞增殖，进而促进肝脏再生和肝重恢复，可将狄氏副拟杆菌用于制备促进肝脏再生的产品。本发明公开了狄氏副拟杆菌在促肝再生方面的新应用，有助于用于提高肝移植和部分肝切除术后肝脏再生能力的药物的开发。后肝脏再生能力的药物的开发。后肝脏再生能力的药物的开发。


技术研发人员：毕惠嫦 郭曼岚 江晓雯 杨潇 陈鹏
受保护的技术使用者：南方医科大学
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/10/15