一种基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片及方法与流程

1.本发明属于生物芯片领域，具体涉及一种基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片及方法。


背景技术：

2.癌症作为常见病正严重威胁着我国乃至全球居民的健康。循环肿瘤细胞(ctcs)是一类由癌变部位释放并进入血液中的癌细胞，其在癌症的早期诊断、个体化及肿瘤转移机制研究等方面的作用正逐渐被发现和认可，但由于血液中的ctcs含量极少，对其分选极具挑战。微流控芯片作为一种微型化、高通量、集成化平台，在ctcs研究中彰显了独特的优势，相关报道也越来越多。随着研究的深入，微流控芯片技术不再局限于基于模型样品的方法学开发，而是更注重于能否用于临床实际样品中ctcs的检测，但目前未见该角度的综述报道。
3.可参考现有公开号为cn110653012a的中国专利，其公开了一种循环肿瘤细胞分选、富集及检测用多级微流控芯片装置，包括下基片和上基片，下基片顶部设置有样本箱，样本箱右侧设置有第一分离机构，第一分离机构右侧设置有第二分离机构，第二分离机构与第一分离机构之间设置有混合箱，第二分离机构右侧设置有富集机构，本发明，通过设置第一分离机构，可以将粒径较小的白细胞和红细胞裂解残留碎片分离进入废液箱内，通过设置第二分离机构，可以实现对白细胞的分离，通过设置滤框，可以对样本进行再一次的分离。
4.再如现有公开号为cn113755300a的中国专利，其公开了一种微流控细胞分选芯片，其特征在于，包括：第一分选通道，在所述第一分选通道的延伸方向上，所述第一分选通道依次与一第一细胞进样口及一第一细胞出样口连通；第二分选通道，在所述第二分选通道的延伸方向上，所述第二分选通道依次与一液体进样口及所述第一细胞出样口连通；第一连接通道，两端分别与所述第一分选通道的管壁及所述第二分选通道的管壁连通，所述第一连接通道相对位于所述第一细胞进样口及所述第一细胞出样口之间；第一液体驱动装置，设于所述第一分选通道的管壁上，所述第一液体驱动装置对准所述第一连接通道，用于将流经所述第一液体驱动装置的细胞推送至所述第一连接通道；分选细胞输送管道，在所述分选细胞输送管道的延伸方向上，所述分选细胞输送管道依次与所述液体进样口及一第二细胞出样口连通；第二连接通道，所述第二连接通道的一端与所述第二分选通道的管壁连通，另一端与所述分选细胞输送管道的管壁直接连通或间接连通；第二液体驱动装置，设于所述第二分选通道的管壁上，所述第二液体驱动装置对准所述第二连接通道，用于将流经所述第二液体驱动装置的细胞推送至所述第二连接通道。
5.上述的两个专利分别存在着一些优点，但是都存在着一些缺点，如：细胞不易被抗体接触，不易被捕捉。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片及方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.一种基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片，包括芯片板，所述芯片板设置有鱼骨结构，所述鱼骨结构中固定有捕获癌细胞的微通道，所述微通道中固定有抗体，所述抗体与细胞表面抗原特异性结合将ctcs捕获并保留在芯片内,其他细胞随缓冲液流出芯片。
9.较佳的，所述ctcs捕获抗体有人上皮细胞黏附分子epcam和白细胞共同抗原cd45。
10.本发明还提供了一种基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片的分选方法，其特征在于：采用亲和性分选方式进行癌细胞分选，所述亲和性分选包括两种捕获方式，包括阳性分选法和阴性分选法，所述阳性分选法是直接特异性地捕获目标细胞；所述阴性分选法是捕获并弃除非目标细胞。
11.较佳的，所述基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片包括第一功能部分和第二功能部分。
12.较佳的，所述第一功能部分是在芯片顶部嵌入锯齿状结构,使样品呈涡旋式流经芯片顶部,当样品流经芯片内部时,顶部的锯齿形结构诱导水平流动的液体沿锯齿垂直流动,增加ctcs与硅纳米粒子衬底之间的接触频率。
13.较佳的，所述第二功能部分是在芯片底部设置涂覆抗epcam的硅纳米柱结构。
14.较佳的，所述基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片中集成了基因组分析模块、转录分析模块和蛋白质组分析模块,所述基因组分析模块、转录分析模块和蛋白质组分析模块用于获得捕获细胞准确的分子信息。
15.较佳的，所述基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片内壁中设置了埃洛石纳米管，所述埃洛石纳米管上固定有e-选择素和抗epcam，所述e-选择素捕获快速移动的ctcs，所述抗-epcam可以特异性的捕获ctcs。
16.通过采用上述技术方案，纳米管既可以保证分选效率,又可提高分选速度(1-4ml/h),这是因为纳米管涂层增加了捕获表面积,使能结合到微通道中的捕获抗体大大增加，纳米管由通道壁延伸到通道内部液体层,该结构使得结合在其上的e-选择素的结合位点充分暴露在样品溶液中,增大了捕获ctcs的概率、纳米管能够抑制白细胞在微通道内壁的黏附,提高了ctcs的捕获纯度。
17.较佳的，在采用亲和性分选方式进行癌细胞分选时，将磁性材料引入到微流控芯片ctcs分选中,将可与细胞表面抗原发生免疫反应的抗体结合到磁性材料上，将其置于样品溶液中，随后引入到微流控芯片中,施加外界磁场,捕获了ctcs细胞的磁性材料可被固定于微流控芯片中并与其他细胞分离撤去外界磁场后,将捕获细胞从微流控芯片中释放出来。
18.通过采用上述技术方案，鱼骨结构中固定有捕获癌细胞的epcam,鱼骨结构可将液体的流动状态从层流转变为涡流,从而使细胞更容易与捕获抗体接触。该芯片易于操作,通过集成多条微通道至芯片中形成平行阵列,分选速度可达1ml/h,捕获的循环肿瘤细胞还可用于其他检测或细胞培养。stott利用鱼骨芯片对15例男性前列腺病症患者外周血进行分
选试验,结果显示该芯片在14例血样中成功捕获到了ctcs。此芯片还被用于36例转移性前列腺癌症患者血样中ctcs的检测,成功检出了23例,并通过基因测序成功检测到了捕获细胞裂解液中的tmprss2erg嵌合转录产物。此外,在癌症患者血液分选过程中,作者在芯片中观察到了细胞群，这可能与癌症的转移过程相关，而在模拟样品(即癌细胞与正常血液的混合样品)分析中未见此类现象报道,这进步表明模拟样品与真实样品存在一定的差异。
19.综上所述，本发明主要具有以下有益效果：
20.本芯片更容易捕捉细胞，实现细胞分选；由于鱼骨结构中固定有捕获癌细胞的epcam,鱼骨结构可将液体的流动状态从层流转变为涡流从而使细胞更容易与捕获抗体接触。该芯片易于操作,通过集成多条微通道至芯片中形成平行阵列,分选速度可达1ml/h,捕获的循环肿瘤细胞还可用于其他检测或细胞培养.stott利用鱼骨芯片对15例男性前列腺癌症患者外周血进行分选试验,结果显示该芯片在14例血样中成功捕获到了ctcs。此芯片还被用于36例转移性前列腺癌症患者血样中ctcs的检测，成功检出了23例，并通过基因测序成功检测到了捕获细胞裂解液中的tmprss2-erg嵌合转录产物。
附图说明
21.图1为本发明的系统框图。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.参考图1，本发明提供一种技术方案：一种基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片，包括芯片板，所述芯片板设置有鱼骨结构，所述鱼骨结构中固定有捕获癌细胞的微通道，所述微通道中固定有抗体，所述抗体与细胞表面抗原特异性结合将ctcs捕获并保留在芯片内,其他细胞随缓冲液流出芯片。
24.其中，所述ctcs捕获抗体有人上皮细胞黏附分子epcam和白细胞共同抗原cd45。
25.其中，本芯片更容易捕捉细胞，实现细胞分选；由于鱼骨结构中固定有捕获癌细胞的epcam,鱼骨结构可将液体的流动状态从层流转变为涡流从而使细胞更容易与捕获抗体接触。该芯片易于操作,通过集成多条微通道至芯片中形成平行阵列,分选速度可达1ml/h,捕获的循环肿瘤细胞还可用于其他检测或细胞培养.stott利用鱼骨芯片对15例男性前列腺癌症患者外周血进行分选试验,结果显示该芯片在14例血样中成功捕获到了ctcs。此芯片还被用于36例转移性前列腺癌症患者血样中ctcs的检测，成功检出了23例，并通过基因测序成功检测到了捕获细胞裂解液中的tmprss2-erg嵌合转录产物。
26.本实施例还提供了一种基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片的分选方法，其特征在于：采用亲和性分选方式进行癌细胞分选，所述亲和性分选包括两种捕获方式，包括阳性分选法和阴性分选法，所述阳性分选法是直接特异性地捕获目标细胞；所述阴性分选法是捕获并弃除非目标细胞。
27.其中，所述基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片包括第一功能部分和第二
功能部分。
28.其中，所述第一功能部分是在芯片顶部嵌入锯齿状结构,使样品呈涡旋式流经芯片顶部,当样品流经芯片内部时,顶部的锯齿形结构诱导水平流动的液体沿锯齿垂直流动,增加ctcs与硅纳米粒子衬底之间的接触频率。将分析结果与cellsearch的分析结果对比,发现:芯片处理1ml样品时的捕获量与用美国食品药品监督管理局唯一认证的cellsearch机构的方法处理7.5ml样品所获得的捕获量相当,该结果证明了该芯片有更高的捕获效率。
29.其中，所述第二功能部分是在芯片底部设置涂覆抗epcam的硅纳米柱结构。该系统测试了40例前列腺癌症患者和12例健康志愿者的血样,其中,患者血液中ctcs的检出含量为1-99个ctcs/ml,健康人血液中循环上皮细胞(circulating epithelial cells,cecs)的检出合量为0-2个cecs/ml,分选速度为0.5-1ml/h,证明nanovelcro芯片有强大的ctcs捕获效率,可以有效避免celsearch方法对大部分晚期前列腺癌症患者样品假阴性的问题。鉴于捕获的细胞均保有细胞活性，如果芯片集成其他检测技术,如基因组、转录和蛋白质组分析模块,则可获得捕获细胞准确的分子信息。
30.其中，所述基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片中集成了基因组分析模块、转录分析模块和蛋白质组分析模块,所述基因组分析模块、转录分析模块和蛋白质组分析模块用于获得捕获细胞准确的分子信息。
31.其中，所述基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片内壁中设置了埃洛石纳米管，所述埃洛石纳米管上固定有e-选择素和抗epcam，所述e-选择素捕获快速移动的ctcs，所述抗-epcam可以特异性的捕获ctcs。纳米管既可以保证分选效率,又可提高分选速度(1-4ml/h),这是因为:1)纳米管涂层增加了捕获表面积,使能结合到微通道中的捕获抗体大大增加；2)纳米管由通道壁延伸到通道内部液体层,该结构使得结合在其上的e-选择素的结合位点充分暴露在样品溶液中,增大了捕获ctcs的概率:3)纳米管能够抑制白细胞在微通道内壁的黏附[18],提高了ctcs的捕获纯度。
[0032]
其中，在采用亲和性分选方式进行癌细胞分选时，将磁性材料引入到微流控芯片ctcs分选中,将可与细胞表面抗原发生免疫反应的抗体结合到磁性材料上，将其置于样品溶液中，随后引入到微流控芯片中,施加外界磁场,捕获了ctcs细胞的磁性材料可被固定于微流控芯片中并与其他细胞分离撤去外界磁场后,将捕获细胞从微流控芯片中释放出来。
[0033]
其中，鱼骨结构中固定有捕获癌细胞的epcam,鱼骨结构可将液体的流动状态从层流转变为涡流,从而使细胞更容易与捕获抗体接触。该芯片易于操作,通过集成多条微通道至芯片中形成平行阵列,分选速度可达1ml/h,捕获的循环肿瘤细胞还可用于其他检测或细胞培养。stott利用鱼骨芯片对15例男性前列腺病症患者外周血进行分选试验,结果显示该芯片在14例血样中成功捕获到了ctcs。此芯片还被用于36例转移性前列腺癌症患者血样中ctcs的检测,成功检出了23例,并通过基因测序成功检测到了捕获细胞裂解液中的tmprss2erg嵌合转录产物。此外,在癌症患者血液分选过程中,作者在芯片中观察到了细胞群，这可能与癌症的转移过程相关，而在模拟样品(即癌细胞与正常血液的混合样品)分析中未见此类现象报道,这进步表明模拟样品与真实样品存在一定的差异。
[0034]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.一种基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片，其特征在于：包括芯片板，所述芯片板设置有鱼骨结构，所述鱼骨结构中固定有捕获癌细胞的微通道，所述微通道中固定有抗体，所述抗体与细胞表面抗原特异性结合将ctcs捕获并保留在芯片内,其他细胞随缓冲液流出芯片。2.根据权利要求1所述的一种基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片及方法，其特征在于：所述ctcs捕获抗体有人上皮细胞黏附分子epcam和白细胞共同抗原cd45。3.一种应用权利要求1-2中的基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片的方法，其特征在于：采用亲和性分选方式进行癌细胞分选，所述亲和性分选包括两种捕获方式，包括阳性分选法和阴性分选法，所述阳性分选法是直接特异性地捕获目标细胞；所述阴性分选法是捕获并弃除非目标细胞。4.根据权利要求3所述的一种基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选方法，其特征在于：所述基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片包括第一功能部分和第二功能部分。5.根据权利要求4所述的一种基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选方法，其特征在于：所述第一功能部分是在芯片顶部嵌入锯齿状结构,使样品呈涡旋式流经芯片顶部,当样品流经芯片内部时,顶部的锯齿形结构诱导水平流动的液体沿锯齿垂直流动,增加ctcs与硅纳米粒子衬底之间的接触频率。6.根据权利要求4所述的一种基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选方法，其特征在于：所述第二功能部分是在芯片底部设置涂覆抗epcam的硅纳米柱结构。7.根据权利要求3所述的一种基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片及方法，其特征在于：所述基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片中集成了基因组分析模块、转录分析模块和蛋白质组分析模块,所述基因组分析模块、转录分析模块和蛋白质组分析模块用于获得捕获细胞准确的分子信息。8.根据权利要求3所述的一种基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选方法，其特征在于：所述基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片内壁中设置了埃洛石纳米管，所述埃洛石纳米管上固定有e-选择素和抗epcam，所述e-选择素捕获快速移动的ctcs，所述抗-epcam可以特异性的捕获ctcs。9.根据权利要求3所述的一种基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选方法，其特征在于：在采用亲和性分选方式进行癌细胞分选时，将磁性材料引入到微流控芯片ctcs分选中,将可与细胞表面抗原发生免疫反应的抗体结合到磁性材料上，将其置于样品溶液中，随后引入到微流控芯片中,施加外界磁场,捕获了ctcs细胞的磁性材料可被固定于微流控芯片中并与其他细胞分离撤去外界磁场后,将捕获细胞从微流控芯片中释放出来。

技术总结
本发明公开了一种基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片及方法，基于声表面波的循环肿瘤细胞多级分选芯片，包括芯片板，所述芯片板设置有鱼骨结构，所述鱼骨结构中固定有捕获癌细胞的微通道，所述微通道中固定有抗体，所述抗体与细胞表面抗原特异性结合将CTCs捕获并保留在芯片内,其他细胞随缓冲液流出芯片。所述CTCs捕获抗体有人上皮细胞黏附分子EpCAM和白细胞共同抗原CD45。本芯片更容易捕捉细胞，更易实现细胞分选。更易实现细胞分选。更易实现细胞分选。


技术研发人员：钱金贵
受保护的技术使用者：苏州桦声康医疗科技有限公司
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/10/15