一种大片吸虫BMP单克隆抗体及其制备方法与应用

一种大片吸虫bmp单克隆抗体及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种大片吸虫bmp单克隆抗体及其制备方法与应用。


背景技术：

2.大片吸虫病是一种人兽共患寄生虫病，由大片吸虫(fasciola gigantica，fg)引起，能严重危害反刍动物继而造成巨大经济损失。目前没有防控该病的可持续方法，主要靠使用三氯苯达唑，但残留于肉奶等食品中的危害和不断增加的耐药性都需要寻找其他有效的防控战术。
3.转化生长因子β(tgf-β)大量分布于脊椎动物和无脊椎动物，是一组多肽形式的转化生长因子，具有参与调节各种生命活动，如胚胎及细胞分化、发育及免疫调节等功能。并且tgf-β对寄生虫的发育都具有一定程度的影响，这将为寄生虫的控制及诊断提供一个方向。
4.骨形态发生蛋白(bmps)属于tgf-β家族，是一种可以调节哺乳动物及后生动物发育的多功能细胞因子。在血吸虫中也存在bmp蛋白同源物，该蛋白定位于曼氏血吸虫(smbmp)的生殖器官中，以及在日本血吸虫(sjbmp)的不同发育时期的表达量不同，在幼虫和虫卵的表达高于其他时期，敲除该蛋白会导致寄生虫的繁殖力下降，表明其对虫体发育具有一定的影响，提示bmp可能参与如幼虫的生长、卵母细胞的发育和卵的成熟等。bmp分泌到大片吸虫排泄-分泌产物(excretory-secretoryproduct,esp)，对免疫细胞具有一定的调节作用，该蛋白与宿主免疫调节的功能相关。
5.而fgbmp可能发挥与sjbmp类似的作用，以及宿主和tgf-β通路之间的免疫调节需要多个配体进行参与，但如今缺少对fgbmp的研究。因此对于fgbmp的研究有助于我们了解tgf-β通路与宿主之间的相互作用以及在寄生虫中如何发挥免疫调节。所以，提供的抗fgbmp蛋白单克隆抗体为进一步了解研究fgbmp在大片吸虫寄生阶段的虫体中的发挥的功能，以及其在与宿主相互作用中的免疫调节作用，将有助于挖掘新的疫苗候选分子，是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种大片吸虫bmp单克隆抗体及其制备方法与应用。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种大片吸虫bmp单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
9.s1：rfgbmp蛋白免疫小鼠；所述rfgbmp蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示；
10.s2：阳性杂交瘤细胞株的构建与筛选；
11.s3：单克隆抗体的制备与纯化。
12.优选的，s1具体为用rfgbmp蛋白对小鼠免疫4次，每次每只rfgbmp蛋白的免疫剂量为50μg；在第3次免疫以及第4次免疫之后的第7d，对小鼠尾静脉进行采血分离血清，用间接
elisa法检测抗体滴度；当第4次免疫的抗体滴度≥105时，对小鼠进行冲击免疫，冲击免疫剂量为50μg/只。
13.优选的，s2具体为利用聚乙二醇诱导细胞融合法，以peg1500为媒介将获得的小鼠sp2/0细胞和脾细胞进行融合并做elisa检测，筛选阳性杂交瘤细胞。
14.优选的，sp2/0细胞和脾细胞的比例为1:5。
15.优选的，s3具体为将处于对数增长期的单克隆细胞调整细胞密度为8*105个/ml，注入小鼠腹腔；当小鼠精神欠佳且腹部明显隆起时，抽取腹水，7000rpm，离心10min，收集上清进行纯化；将小鼠腹水上清用0.02mpb稀释后，用0.22μm无菌过滤器过滤，流速减慢为0.6ml/min，用0.02m pb进行洗脱杂带直到无蛋白流出为止，用0.1mph3.0甘氨酸进行抗体洗脱并且收集，饱和碳酸钠调节洗脱产物ph至中性，再用pbs进行透析，收集得单克隆抗体。
16.本发明的另一目的是，提供上述制备方法制备的大片吸虫bmp单克隆抗体。
17.本发明的另一目的是，提供一种大片吸虫bmp单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建方法，包括以下步骤：
18.s1：rfgbmp蛋白免疫小鼠；所述rfgbmp蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示；
19.s2：阳性杂交瘤细胞株的构建与筛选；
20.s3：对阳性杂交瘤细胞进行亚型鉴定，取阳性亚克隆杂交瘤细胞进行建株保存，即得所述大片吸虫bmp单克隆抗体杂交瘤细胞株。
21.本发明的另一目的是，提供一种大片吸虫bmp单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株命名为4a14f10，属于igg2b型。
22.本发明的另一目的是，提供上述杂交瘤细胞株分泌的大片吸虫bmp单克隆抗体。
23.本发明的另一目的是，提供上述大片吸虫bmp单克隆抗体在探究bmp基因与大片吸虫功能性分析中的应用。
24.有益效果：
25.利用本发明方法共筛选出效价较高的细胞株10株，细胞上清经验证后，有4株细胞株效果较好，对这4株细胞进行亚克隆筛选，共获得3株阳性细胞株，分别命名为4a14f10、4a24e6及2g61h5，经亚型鉴定结果显示均为单一亚型。最后选取效果最好的细胞株4a14f10进行制备腹水和抗体纯化，经鉴定该株抗体为igg2b型，并且该抗体与rfgbmp重组蛋白、大片吸虫虫体蛋白以及fgesp可以进行特异性识别。
26.对单克隆抗体进行梯度稀释，酶标二抗稀释度为1:10000；1％的明胶进行封闭；显色的时间为15min用来反映抗体的效价和灵敏度，结果4a14f10以1μg/ml浓度包被效果最好；并且该抗体与rfgbmp重组蛋白、大片吸虫虫体蛋白以及fgesp可以进行特异性识别。本发明成功制备抗rfgbmp单克隆抗体，验证了单抗的特异性的同时，也对抗体的稀释比例做了推荐，有利于进一步研究fgbmp在大片吸虫寄生阶段的虫体中的发挥的功能，以及其在与宿主相互作用中的免疫调节作用。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据
提供的附图获得其他的附图。
28.图1为单克隆抗体纯化鉴定图；
29.图2为单克隆抗体特异性检测结果，其中1泳道为rfgbmp，2泳道为大片吸虫虫体蛋白，3泳道为fgesp；
30.图3为单克隆抗体敏感性检测结果。
具体实施方式
31.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.本发明涉及的生物材料：
33.6-8周龄的balb/c雌鼠(spf级)，购自广西医科大学；
34.sp 2/0细胞株由广西大学动物科技学院动物寄生虫疾病与免疫学实验室，液氮保存；
35.大片形吸虫：采自广西地区某养殖厂。
36.本发明涉及的主要试剂及仪器：
37.peg购自美国merck公司；dmem基础培养基购自invitrogen生命技术有限公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；hat、ht培养基、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均购自美国sigma-aldrich；青链霉素混合液(双抗)购北京索莱宝科技有限公司；单克隆抗体鉴定试剂盒购自southernbiotech公司；protein g纯化介质购自武汉汇研生物科技有限公司；小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒购自武汉三鹰生物技术有限公司；特超敏ecl化学发光试剂盒购自碧云天生物技术公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠igg(h+l)酶标二抗购自美国杰克逊免疫研究公司。
38.倒置显微镜购自日本尼康仪器有限公司；超净工作台购自苏净设备有限公司；二氧化碳培养箱购自thermo fisher scientific公司；恒温培养箱：上海跃进医疗器械公司；高速冷冻离心机购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司；双稳定时电泳仪购自bio-rad公司。
39.实施例1
40.1.rfgbmp蛋白免疫小鼠
41.每隔两周用原核表达并且已复性完全的rfgbmp蛋白(氨基酸序列见seq id no：1)分别对6只小鼠进行免疫，一共免疫4次；在第3次免疫以及第4此免疫之后的7d，对小鼠尾静脉进行采血分离血清，用间接elisa法检测抗体滴度；当第4次免疫的抗体滴度达到要求时，对小鼠进行冲击免疫，以便获得更高的抗体滴度，免疫具体步骤见表1。
42.rfgbmp蛋白：
43.yeetkpfsvkktnnrekceqkhrriqeilhsgsvpaewklrtrrhiplprrcvraisdgwklqglpassfdyqsennpvnfrnmvhepkysfrskgfmenrgetyesrsvssssptdgfhysrtdkslntdeylestcqrrdlvidfdvvgwagwviapqaynarycrgqcpfplsthynttnhavllqlvhlldaarisgpccvpnqlssqsllyhkqngdvvlrvyqdmvvescacr，seq id no：1。
44.表1小鼠免疫程序
[0045][0046]
本实施例四免7d后对小鼠采血，血清经间接elisa法检测，显示6只小鼠的抗体滴度均大于105，可以进行细胞融合。
[0047]
2.阳性杂交瘤细胞株的构建与筛选
[0048]
取出冻存于液氮中的sp 2/0进行复苏培养使其处于生长期，提前1d提取小鼠腹腔的巨噬细胞来培养饲养层细胞以及无菌解剖小鼠取出脾脏，研磨脾脏获得脾细胞。在无菌的50ml离心管中，加入细胞数为1：5的脾细胞和sp 2/0细胞，用rpmi-1640基础培养基补足20ml，进行充分混合均匀。1000rpm离心10min，弃上清，将离心管置于手心上，轻拍使细胞沉淀松散均匀用hat培养基重悬。取1ml的peg 1500和30ml rpmi-1640基础培养基的在37℃水浴锅内进行提前预热，将预热的peg 1500沿着离心管壁缓慢滴加到细胞沉淀中，一边滴加一边转动离心管。在90s的时间内，控制滴加速度，以先慢后快的滴加速度，往离心管中加入已预热的rpmi-1640基础培养基，使peg终止作用，在37℃，5％co2进行培养10min。1500rpm离心5min，弃上清，用10ml的hat培养基及饲养层细胞，轻轻重悬细胞，用hat培养基补至100m。在96孔细胞培养板中，100μl/孔，置于37℃、5％co2培养箱中培养。
[0049]
在细胞融合培养的第5d，用hat培养基进行半量换液，观察细胞融合状态。融合状态正常时，在第10d，用ht培养基将细胞全换液，第14d用20％完全培养基培养。注意杂交瘤细胞的细胞集落状态，当细胞集落明显时，选取其细胞孔上清，进行间接elisa检测，将抗体阳性高的细胞培养孔进行亚克隆。利用有限稀释法进行亚克隆培养，培养稳定分泌的阳性细胞株，并对其扩大培养以及冻存。
[0050]
结果显示，本实施例细胞融合效果良好，间接elisa法检测细胞上清，共筛选出效价较高的细胞株10株，经验证后，选取其中4株细胞经亚克隆，获得3株效果较好的阳性细胞株，分别为4a14f10、4a24e6及2g61h5，见表2；阳性杂交瘤细胞株传代培养后，细胞上清检测阳性值良好且趋势稳定，可进行后续实验，见表3。
[0051]
表2连续亚克隆后杂交瘤分泌抗体稳定性
[0052][0053]
表3连续传代后杂交瘤分泌抗体稳定性
[0054][0055]
3.单克隆的亚型鉴定
[0056]
利用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂在室温平衡30min，其中的酶标板预包被了针对小鼠igg1，igg2a，igg2b，igg2c，igg3，igm等特异性抗体。对杂交瘤细胞上清用1
×
pbst以1:100稀释，50μl/孔，再将1
×
羊抗鼠igm+igg-hrp加入样品孔中，50μl/孔。轻轻混匀，室温孵育1h。1
×
pbst洗3次，每次5min。拍干后，以100μl/孔加入显色液。室温避光显色10-20min。每孔加入终止液，100μl/孔。通过酶标仪读取od
450nm
,od值最高孔对应的即为相应亚型，见表4。
[0057]
表4单克隆抗体的亚型鉴定
[0058][0059]
结果显示，4a14f10及4a24e6两株抗体亚型均为igg2b型，2g61h5为igg1。
[0060]
4.腹水的制备与纯化
[0061]
准备balb/c小鼠。提前7d，向每只小鼠腹腔内注射500μl的无菌液体石蜡以及复苏单克隆细胞使其处于对数增长期，7d后，收集单克隆细胞进行细胞计数，并且调整细胞密度为8
×
105个/ml；将细胞用无菌注射器注入小鼠腹腔，每天轻柔小鼠腹部，防止结节形成，观察腹部状态。当小鼠精神欠佳且腹部明显隆起时，用注射器抽取腹水，7000rpm，离心10min，
收集上清进行分装，冻存于-80℃备用，对腹水进行间接elisa检测，确定效价。
[0062]
5.单克隆抗体的纯化
[0063]
首先对纯化的proteing柱进行预处理：先用10倍柱的双蒸水冲洗4-6遍，流速为1ml/min，再用10倍柱的0.02m pb+0.3mnacl冲洗4-6遍，流速同上。第二步进行样品上样：采集的小鼠腹水用0.02mpb稀释后，用0.22μm无菌过滤器过滤，流速减慢为0.6ml/min。用0.02m pb进行洗脱杂带直到无蛋白流出为止。用0.1m ph3.0甘氨酸进行抗体洗脱并且收集，饱和碳酸钠调节洗脱产物ph至中性。再用pbs进行透析收集单克隆抗体(参见附图1)。层析柱洗涤用双蒸水冲洗层析柱至中性再用20％乙醇进行4℃封存。
[0064]
如附图1所示，本实施例所得单克隆抗体重链在50ku，轻链在27ku。
[0065]
6.单克隆抗体特异性鉴定
[0066]
采用western-blot对抗rfgbmp单克隆抗体特异性进行验证，主要对rfgbmp蛋白，大片吸虫全虫蛋白以及fgesp进行sds-page电泳。一抗为rfgbmp杂交瘤细胞上清，二抗为兔抗鼠-igg酶标二抗(参见附图2)。
[0067]
结果显示，单克隆抗体可与重组蛋白、虫体蛋白及天然fgesp抗原反应。
[0068]
7.敏感性验证
[0069]
将rfgbmp进行梯度稀释，pbs作为阴性对照。通过间接elisa检测方法计算各浓度下的od
450nm
，得出最低抗原检测浓度，验证该方法敏感性。
[0070]
分别用1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml依次倍比稀释至0ng/ml，共13个稀释浓度梯度的单抗包被96孔酶标板，最大od值所对应条件为最佳检测条件，结果(参见附图3)所示，当一抗稀释至0.498ng/ml时，仍能被检测到。
[0071]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0072]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种大片吸虫bmp单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：rfgbmp蛋白免疫小鼠；所述rfgbmp蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示；s2：阳性杂交瘤细胞株的构建与筛选；s3：单克隆抗体的制备与纯化。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，s1具体为用rfgbmp蛋白对小鼠免疫4次，每次每只rfgbmp蛋白的免疫剂量为50μg；在第3次免疫以及第4次免疫之后的第7d，对小鼠尾静脉进行采血分离血清，用间接elisa法检测抗体滴度；当第4次免疫的抗体滴度≥105时，对小鼠进行冲击免疫，冲击免疫剂量为50μg/只。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，s2具体为利用聚乙二醇诱导细胞融合法，以peg1500为媒介将获得的小鼠sp2/0细胞和脾细胞进行融合并做elisa检测，筛选阳性杂交瘤细胞。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，sp2/0细胞和脾细胞的比例为1:5。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，s3具体为将处于对数增长期的单克隆细胞调整细胞密度为8*105个/ml，注入小鼠腹腔；当小鼠精神欠佳且腹部明显隆起时，抽取腹水，7000rpm，离心10min，收集上清进行纯化；将小鼠腹水上清用0.02mpb稀释后，用0.22μm无菌过滤器过滤，流速减慢为0.6ml/min，用0.02mpb进行洗脱杂带直到无蛋白流出为止，用0.1mph3.0甘氨酸进行抗体洗脱并且收集，饱和碳酸钠调节洗脱产物ph至中性，再用pbs进行透析，收集得单克隆抗体。6.权利要求1-6任一所述制备方法制备的大片吸虫bmp单克隆抗体。7.一种大片吸虫bmp单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：rfgbmp蛋白免疫小鼠；所述rfgbmp蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示；s2：阳性杂交瘤细胞株的构建与筛选；s3：对阳性杂交瘤细胞进行亚型鉴定，取阳性亚克隆杂交瘤细胞进行建株保存，即得所述大片吸虫bmp单克隆抗体杂交瘤细胞株。8.一种大片吸虫bmp单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株命名为4a14f10，属于igg2b型。9.权利要求8所述杂交瘤细胞株分泌的大片吸虫bmp单克隆抗体。10.权利要求9所述大片吸虫bmp单克隆抗体在探究bmp基因与大片吸虫功能性分析中的应用。

技术总结
本发明公开了一种大片吸虫BMP单克隆抗体及其制备方法与应用，涉及生物技术领域。所述大片吸虫BMP单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：S1：rFgBMP蛋白免疫小鼠；所述rFgBMP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；S2：阳性杂交瘤细胞株的构建与筛选；S3：单克隆抗体的制备与纯化。本发明构建的大片吸虫BMP单克隆抗体杂交瘤细胞株4A14F10进行制备腹水和抗体纯化，经鉴定该株抗体为IgG2b型，并且该抗体与rFgBMP重组蛋白、大片吸虫虫体蛋白以及FgESP可以进行特异性识别。可以进行特异性识别。可以进行特异性识别。


技术研发人员：邸文达 江雪莲
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/10/15