一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统及其方法与流程

1.本发明涉及琼脂糖凝胶电泳技术领域，尤其是涉及一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统及其方法。


背景技术：

2.琼脂糖凝胶电泳作为核酸等生物大分子的可靠分离技术之一，广泛用于生物化学、分子生物学、医学诊断等领域。质粒提取验证、pcr扩增和基因测序中核酸纯度、浓度、片段大小等信息可以通过dna和rna的凝胶电泳分离获得。生物医药领域的发展对平板琼脂糖凝胶电泳核酸检测的高通量、高稳定性、易用性和易分析性提出了越来越高的要求，尤其是对凝胶结果实现在线定量分析可以加速推进整个生化分析流程，缩短分离分析周期，提高研发效率。
3.第一、传统的琼脂糖凝胶电泳采用水平式电泳槽，实现不同片段核酸的分离、鉴定和纯化，通常需要经过凝胶制备、点样、电泳和结果分析四个步骤，整个实验过程分离、步骤繁多，容易导致实验条件和电泳过程参数存在差异，难以满足电泳分离结果的重复性和精确性。
4.第二、现有的琼脂糖凝胶电泳在线观测技术存在灵敏度低的问题，目前已有核酸琼脂糖凝胶电泳实现电泳观测(专利号：cn 1766581 a，cn211402238u，cn 203249894 u)，但是成像方式通常透射式成像，光源放置在凝胶下方，这将导致一方面对电泳槽的材料要求透光性好，另一方面对滤波片的滤波性能要求高。当激发光源光谱与荧光光谱有重叠时，会导致背景干扰增加、信噪比增大，降低检测灵敏度。
5.第三、琼脂糖凝胶电泳结果精确定量存在难度，对于核酸凝胶电泳通常需要得到核酸纯度、浓度和片段大小等信息。同一个核酸条带随着电泳时间的增加，迁移距离增大，条带展宽也增大，当多条核酸条带信号比值差异较大，尤其是存在背景信号干扰时，低信号强度计算容易出现误差、无法准确定量。
6.这些多因素的干扰极大的降低了凝胶电泳条带的定量分析的可行性，甚至导致电泳结果无法实现定量分析。电泳装置和成像检测一体化发展成为必然趋势。但是，简单的把电泳装置和成像装置集成，可能会引入一些非预期问题，如成像面不均匀、存在偏转等，不能对电泳过程中所涉及参数精准可控，基于成像实现可靠定量分析难度较大。因此，有必要针对琼脂糖凝胶电泳实时检测系统开展深入研究和探讨。


技术实现要素：

7.本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统及其方法，电泳装置与光学成像装置一体化、实验过程流程化，实现琼脂糖凝胶电泳在线监测和定量分析，通过电泳装置和光学成像装置匹配性集成，实现凝胶电泳过程中操作统一化，增加电泳和成像过程参数的确定化，实现琼脂糖凝胶电泳结果准确成像，并实现条带的定量分析。为了实现凝胶电泳条带实时检测和准确定量分析，面光源对凝胶面的均匀
照射是基础，同时，均匀光照下的专用电泳槽只产生低背景，实现凝胶中条带准确、灵敏检测。
8.本发明的目的通过以下技术方案实现：
9.本发明的第一个目的是提供一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统，所述系统包括底座、支撑杆、光学成像装置和电泳装置；所述底座和支撑杆及侧板(侧板与支撑杆为一体)构成封闭盒体(遮光盒)，所述光学成像装置和电泳装置安装在盒体内；所述光学成像装置包括光源固定件、相机固定件、相机、镜头、可调光源；所述电泳装置包括专用电泳槽和精密移动平台；所述精密移动平台安装在底座上；所述专用电泳槽放置在精密移动平台上；所述光源固定件安装在专用电泳槽的侧上方，可调光源安装在光源固定件上；所述相机固定件安装在可调光源上方，相机上安装镜头。
10.进一步地，所述系统还包括电泳电源接头；所述专用电泳槽上电极与电泳电源接头连接，电源电源接头与电泳电源直接连接。
11.进一步地，所述底座上设有轨道，所述精密移动平台安装在轨道上；所述精密移动平台通过伺服电机控制沿轨道定向移动。
12.进一步地，所述伺服电机与丝杆传动连接，通过丝杆实现精密移动平台沿轨道定向移动。
13.进一步地，所述精密移动平台通过伺服电机控制，通过调控精密移动平台移动专用电泳槽进出封闭的遮光盒，移出盒体时用于放置凝胶、添加缓冲液及上样，移入盒体后在密闭环境下进行电泳和成像；精密移动平台中心轴对准可调光源和镜头中心位置，确保专用电泳槽居中放置在可调光源中间、且与相机中心位置对齐，确保成像面图像结果均匀。
14.进一步地，所述相机直接与电脑相连，以此实现在线成像检测、分析。
15.进一步地，所述可调光源和相机的镜头前均设置滤光片，以减少激发光光源光谱和荧光染料光谱之间的重叠区，同时降低干扰背景、提高检测灵敏度。
16.进一步地，所述可调光源为led光源，光照角度可以根据需求调节，满足大尺寸平面凝胶均匀照射，实现凝胶内荧光标记的核酸条带均匀激发。
17.进一步地，所述led光源为面光源；所述led光源成对放置在专用电泳槽的侧上方，两个光源之间的间距不小于专用电泳槽宽度，所述led光源在专用电泳槽上方保持一定高度。
18.进一步地，所述可调光源为led阵列面光源，光源前放置了均匀滤光片，滤光片截止荧光染料的发射波长(可以选择短通滤波片只透过荧光染料的激发波长的光)，减少背景杂光，降低背景提高信噪比；光源前方放置均光板确保光源发射均匀；光源为长条形均匀光源，光源长度超过凝胶照射面的长度，光源入射角度设置参考成像结果适时调整，确保凝胶区域光照均匀。
19.进一步地，所述相机居中放置在可调光源中心位置，相机连接的镜头最底端高于可调光源一定距离；镜头前放置滤光片，只通过荧光染料发射波长的光，滤掉杂光可以降低背景。
20.进一步地，所述专用电泳槽由黑色吸光、绝缘耐腐蚀材料(低反光不透明材料)制作；所述专用电泳槽包括凝胶区域和非凝胶区域；所述专用电泳槽上覆盖特制上盖用于遮挡专用电泳槽内非凝胶区域。
21.优选地，所述专用电泳槽可以是黑色聚碳酸酯(pc)，也可以是透明聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)表面涂敷黑色吸光、耐腐蚀的涂料，其他满足条件的材料和处理方法也可以。
22.进一步地，所述专用电泳槽表面要求有一定的粗糙度，确保在光照下保持较低的背景光，设计的所述专用电泳槽尺寸最大可容纳12
×
16cm的凝胶。
23.进一步地，所述特制上盖用黑色吸光材料制作，可以；凝胶固定在专用电泳槽中心位置，确保凝胶区域完整曝露在光源下，特制上盖形状可以变化、不影响凝胶上样操作，减少非凝胶区的背景干扰。
24.优选地，所述特制上盖用黑色pc或pmma等高分子材料制作。
25.本发明的第二个目的是提供一种上述水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统的方法，采用上述系统实现凝胶电泳条带实时检测和准确定量分析，该方法包括如下步骤：
26.步骤一、利用模具制作空白凝胶，凝胶固化后放入专用电泳槽，加入适量电泳缓冲液，盖上电泳槽上盖，并在上样孔加入样本溶液；
27.步骤二、控制伺服电机，移动精密移动平台，将专用电泳槽移动到最合适成像位置，关闭盒体，设定电泳电压和时间，开始电泳，设定光源曝光时间、拍照时间步长等参数，电泳过程中相机按照给定时间步长拍摄电泳照片，或者根据需要实时观测电泳过程；
28.步骤三、根据记录保存的电泳图片，选择目标区域，比对分析凝胶中分离条带，获取核酸电泳过程中条带随时间变化参数，得到核酸条带相对浓度、峰宽、峰面积和强度等信息。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几个方面：
30.1)本发明提出的一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统及其方法，通过测光源激发，凝胶内荧光染色电泳条带发射光透过镜头到传感器，电泳过程中可实时记录凝胶中条带状态。
31.2)本发明提出的一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统及其方法，根据记录的凝胶中条带时序变化，可以跟踪条带迁移，基于记录的时序条带进一步的对分离核酸条带快速分析。
32.3)本发明提出的一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统及其方法，本发明可以基于荧光染色核酸电泳，对样本进行快速分离分析，适合考察电泳条带电泳过程变化，为生物、医药、农业等领域核酸检测提供快速分离分析系统和基于在线成像系统的条带分析方法。
附图说明
33.图1为实施例中的水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统的剖视结构示意图。
34.图2为实施例中制备的水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统的运行时电泳槽、测光源和相机中心对齐放置。
35.图3为不同成像方式和本发明电泳结果对比。
36.图4为本发明运行时相机记录相同时间步长下凝胶内分离核酸条带分布位置(a)和核酸条带转换为电泳谱图后结果(b)。
37.图5为本发明根据相机记录相同时间步长下电泳条带转化后电泳谱图进一步分析得到5个核酸条带的峰面积(a)、峰值(b)、峰位置(c)和半峰宽(d)随分离时间的变化。
38.图中：
39.1底座、2支撑杆、3电泳电源接头、4光源固定件、5相机固定件、6相机、7镜头、8可调光源、9专用电泳槽、10精密移动平台。
具体实施方式
40.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但绝不是对本发明的限制。本技术方案中如未明确说明的制备手段、材料、结构或组成配比等特征，均视为现有技术中公开的常见技术特征。
41.一种平板琼脂糖凝胶电泳检测分析系统，主要包括：用于支撑的底座、支撑杆、电泳电源接头、光源固定件、相机固定件、相机、镜头、可调光源、专用电泳槽和精密移动平台；所用光学成像系统采用侧光源成对放置，光照角度可以根据需求调节，满足大尺寸平面凝胶均匀照射，实现凝胶内荧光标记的核酸条带均匀激发，光源和相机前面均设置了滤光片减少背景光，相机直接连接电脑实时成像和分析。专用荧光成像的琼脂糖凝胶电泳槽，采用低反光不透明材料同时增加表面粗糙度，减少背景反光提高检测灵敏度，满足琼脂糖凝胶高灵敏成像，电泳电源接头连接电源进行电泳。电泳槽放置在精密移动平台上，通过伺服电机控制电泳槽前、后移动实现凝胶成像准确定位。基于上述装置，可以实现凝胶电泳条带随时间的变化分析。
42.实施例1
43.如图1所示，本发明一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统，包括用于支撑的底座1、支撑杆2、光学成像装置和电泳装置；底座1和支撑杆2和侧板共同构成封闭空腔盒体，光学成像装置和电泳装置安装在盒体内；光学成像装置和电泳装置安装在盒体内；光学成像装置包括光源固定件4、相机固定件5、相机6、镜头7、可调光源8；电泳装置包括专用电泳槽9和精密移动平台10；精密移动平台10安装在底座1上，专用电泳槽9放置在精密移动平台10上，并且可以随精密移动平台10一起移动；光源固定件4安装在底座1上，光源固定件4高于电泳槽9一定距离；可调光源8安装在光源固定件4上，安装后的可调光源8可以90度旋转确保光源能够均匀照射到凝胶；相机固定件5安装在底座1上，相机6安装在相机固定件5上，镜头7连接在相机6上；安装后镜头7的最低端要高于可调光源8一定距离。
44.可调光源8和镜头7前都设置了滤光片，用于降低背景提高检测灵敏度。
45.可调光源8为led阵列面光源，光源前放置了均匀滤光片，滤光片截止荧光染料的发射波长可以选择短通滤波片只透过荧光染料的激发波长的光，减少背景杂光，降低背景提高信噪比；光源前方放置均光板确保光源发射均匀；光源为长条形均匀光源，光源长度超过凝胶照射面的长度，光源入射角度设置参考成像结果适时调整旋转角度，确保凝胶区域光照均匀；光源成对放置在专用电泳槽9的侧上方，两个光源之间的间距不小于专用电泳槽9宽度，光源在专用电泳槽9上方保持一定高度。
46.如图2所示，在工作条件下，可以调节精密移动平台10移动专用电泳槽9到设定位置，此时，专用电泳槽9与侧上方对称放置的可调光源8居中对齐，同时，镜头7处于凝胶成像面的中心位置；工作条件下整个腔体为封闭状态。
47.本发明相机6直接连接电脑，可以实时观测、采集电泳过程中荧光核酸条带图像并进行分析。
48.本发明电泳电源接头3直接与电泳电源连接，为凝胶电泳提供分离电压。
49.本发明专用电泳槽9通过金属电极与电泳电源接头3只有在工作位置才会连接；专用电泳槽9内放置凝胶的区域兼容商业化制胶工具尺寸；制作专用电泳槽9所用材料为不透明黑色材料，并且光照面做进一步粗糙处理来降低反光。
50.本发明通过相机6连接的电脑可以实时观测荧光染色的核酸条带，也可以直接基于给定时间步长后记录荧光核酸电泳条带。
51.本发明基于记录的荧光核酸电泳条带图转化为电泳谱图后，可以得到条带的峰面积、峰值、峰位置和半峰宽等一系列参数；其他条件确定的情况下，根据电泳谱图可以实现定量分析。
52.本发明的一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统的方法为：
53.(1)用精密移动平台10移出专用电泳槽9，放入按要求制作空白凝胶，加注适量电泳缓冲液后进行电泳，上样荧光染色核酸，用精密移动平台10将专用电泳槽9移到工作位置，此时整个盒体封闭。
54.(2)电泳开启前，设定光学成像参数并拍摄一张图片作为背景图；电泳开启后，按照设定的时间步长，相机6自动捕获不同时间的荧光染色核酸电泳分离图片(如图3)，整个电泳过程可以随时在电脑上看到。
55.(3)根据记录的荧光染色核酸电泳图片转换为不同时间的电泳谱图，根据谱图计算对应条带峰面积、峰值、峰位置和半峰宽(如图4、图5)。
56.(4)根据计算结果开展后续分析，通过追踪参量随时间变化情况进一步计算核酸纯度、浓度、片段大小等信息。
57.上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统，其特征在于，所述系统包括底座(1)、支撑杆(2)、光学成像装置和电泳装置；所述底座(1)和支撑杆(2)构成封闭盒体，所述光学成像装置和电泳装置安装在盒体内；所述光学成像装置包括光源固定件(4)、相机固定件(5)、相机(6)、镜头(7)、可调光源(8)；所述电泳装置包括专用电泳槽(9)和精密移动平台(10)；所述精密移动平台(10)安装在底座(1)上；所述专用电泳槽(9)放置在精密移动平台(10)上；所述光源固定件(4)安装在专用电泳槽(9)的侧上方，可调光源(8)安装在光源固定件(5)上；所述相机固定件(5)安装在可调光源(8)上方，相机(6)上安装镜头(7)。2.根据权利要求1所述一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统，其特征在于，所述系统还包括电泳电源接头(3)；所述专用电泳槽(9)上电极与电泳电源接头(3)连接，电源电源接头(3)与电泳电源直接连接。3.根据权利要求1所述一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统，其特征在于，所述底座(1)上设有轨道，所述精密移动平台(10)安装在轨道上。4.根据权利要求1所述一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统，其特征在于，所述相机(6)直接与电脑相连，以此实现在线成像检测、分析。5.根据权利要求1所述一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统，其特征在于，所述可调光源(8)和相机(6)的镜头前均设置滤光片，以减少激发光光源光谱和荧光染料光谱之间的重叠区，同时降低干扰背景、提高检测灵敏度。6.根据权利要求1所述一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统，其特征在于，所述可调光源(8)为led光源。7.根据权利要求6所述一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统，其特征在于，所述led光源为面光源；所述led光源成对放置在专用电泳槽(9)的侧上方，两个光源之间的间距不小于专用电泳槽(9)宽度，所述led光源在专用电泳槽(9)上方保持一定高度。8.根据权利要求1所述一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统，其特征在于，所述专用电泳槽(9)的材料为黑色吸光、绝缘耐腐蚀材料；所述专用电泳槽(9)包括凝胶区域和非凝胶区域；所述专用电泳槽(9)上覆盖特制上盖用于遮挡专用电泳槽(9)内非凝胶区域。9.根据权利要求8所述一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统，其特征在于，所述特制上盖的材料为黑色吸光材料；凝胶固定在专用电泳槽(9)中心位置，确保凝胶区域完整曝露在光源下。10.一种如权利要求1-9中任一项所述的水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：步骤一、利用模具制作空白凝胶，凝胶固化后放入专用电泳槽(9)，加入适量电泳缓冲
液，并在上样孔加入样本溶液；步骤二、移动精密移动平台(10)，将专用电泳槽(9)移动到最合适成像位置，关闭盒体，设定电泳电压和时间，开始电泳，设定光源曝光时间、拍照时间步长等参数，电泳过程中相机(6)按照给定时间步长拍摄电泳照片，或者根据需要实时观测电泳过程；步骤三、根据记录保存的电泳图片，选择目标区域，比对分析凝胶中分离条带，获取核酸电泳过程中条带随时间变化参数，得到核酸条带相对浓度、峰宽、峰面积和强度。

技术总结
本发明涉及一种水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统及其方法，所述水平琼脂糖凝胶电泳检测分析系统包括：用于支撑的底座、支撑杆、电泳电源接头、光源固定件、相机固定件、相机、镜头、可调光源、专用电泳槽和精密移动平台；所用光学成像系统采用侧光源成对放置，光照角度可以根据需求调节，满足大尺寸平面凝胶均匀照射，实现凝胶内荧光标记的核酸条带均匀激发，光源和相机前面均设置了滤光片减少背景光，相机直接连接电脑实时成像和分析。与现有技术相比，本发明的系统可以实现凝胶电泳条带随时间的变化分析，具有快速分离、在线监测、成像和分析、高稳定性和高通量等优点。高稳定性和高通量等优点。高稳定性和高通量等优点。


技术研发人员：曹成喜 张强 喻长杰 吴建光 刘小平 梁俊
受保护的技术使用者：达碧清生物科技（苏州）有限公司
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/10/15