一种硫酸软骨素锌及其制备方法与应用

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种硫酸软骨素锌及其制备方法与应用。


背景技术：

2.许多科学研究已证明肿瘤、癌症、痴呆、高血压、糖尿病等许多疾病都与自由基及活性氧有关。硫酸软骨素，具有抑制脂质过氧化等抗氧化作用，且其神经保护特性也与其抗氧化及抗炎活性有关。
3.锌属于人体中的一种微量物质，其作用包括提高免疫力，保持味觉平衡，保证胃肠道的营养菌群处于正常状态，维护视力，保持肝脏的代谢功能等。
4.硫酸软骨素与锌的结合，其合成和性质之前未有报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种硫酸软骨素锌及其制备方法与应用。
6.本发明提供了一种硫酸软骨素锌，其结构式如式ⅰ所示：
[0007][0008]
式ⅰ中，r1为so3或h；r2为so3或h；r3为so3或h；x为1～5的整数，n为2～100的整数。
[0009]
本发明还提供了一种上述硫酸软骨素锌的制备方法，包括如下步骤：1)动物软骨脱脂后与水混合，粉碎成浆；
[0010]
2)将步骤1)得到的浆加碱调节ph后，加热，然后加入碱性蛋白酶进行第一次酶解；
[0011]
3)将所述第一次酶解后的体系与木瓜蛋白酶混合，进行第二次酶解；
[0012]
4)将所述第二次酶解后的体系加酸调节ph后与胃蛋白酶混合，进行第三次酶解；
[0013]
5)对所述第三次酶解后的体系进行酶灭活处理，然后离心后取上清液，将所述上清液通过超滤膜过滤处理，取透过液；
[0014]
6)将所述透过液与氧化锌或氢氧化锌混合进行反应，即得到所述硫酸软骨素锌。
[0015]
上述的制备方法中，所述动物软骨选自猪软骨、牛软骨、鲨鱼软骨、鸡软骨、鸭软骨、乌贼软骨、鲟鱼软骨、鳗鱼软骨、鳐鱼软骨和魟鱼软骨中的至少一种；
[0016]
所述脱脂后的动物软骨与所述水的质量可为1：3～10；具体可为1：3。
[0017]
本发明中，所述脱脂后的动物软骨具体为采用正己烷进行脱脂处理的动物软骨。
[0018]
上述的制备方法中，所述氧化锌或氢氧化锌的粒径为纳米级；
[0019]
所述氧化锌或氢氧化锌的粒径可为20～100nm；具体可为50nm。
[0020]
上述的制备方法步骤2)中，所述加碱调节ph至8.5～9.5，所述加热的温度至40～60℃；具体可为加碳酸钠调ph至8.8或9.0，加热至50℃、60℃；
[0021]
所述碱性蛋白酶的加入量可为100u/ml～10000u/ml；具体可为300u/ml、500u/ml碱性蛋白酶；
[0022]
所述第一次酶解在搅拌条件下进行，所述第一次酶解的温度可为40～60℃，时间可为2～6小时；具体可为50℃搅拌酶解4小时或60℃搅拌酶解2小时。
[0023]
上述的制备方法步骤3)中，所述木瓜蛋白酶的加入量可为50u/ml～5000u/ml；具体可为100u/ml、200u/ml木瓜蛋白酶；
[0024]
所述第二次酶解在搅拌条件下进行，所述第二次酶解的温度可为40～60℃，时间可为2～4小时；具体可为50℃或60℃搅拌酶解2小时。
[0025]
上述的制备方法步骤4)中，所述加酸调节ph至2.0～4.0，所述加热的温度至40～60℃；具体可为浓盐酸调ph至3.0，加热至50℃；
[0026]
所述胃蛋白酶的加入量可为50u/ml～5000u/ml；具体可为50u/ml、100u/ml胃蛋白酶；
[0027]
所述第三次酶解在搅拌条件下进行，所述第三次酶解的温度为30～45℃，时间可为2～4小时；具体可为35℃搅拌酶解3或4小时。
[0028]
上述的制备方法步骤5)中，所述酶灭活处理条件如下：升温至95～100℃，95～100℃保持20～40分钟后降温至20～35℃；具体可为升温至98℃或100℃，保持20分钟或30分钟后降温至25℃或30℃；
[0029]
所述离心的速率可为2000～5000转/min，时间可为20～30分钟；具体可为4000转/min离心30分钟；
[0030]
所述上清液超滤膜过滤处理的操作如下：用截留分子量可为5000～10000道尔顿的超滤膜过滤，取截留液加10～20倍体积的去离子水后再用截留分子量为100000道尔顿的超滤膜过滤；具体可为用截留分子量可为5000道尔顿的超滤膜过滤，取截留液加20倍体积的去离子水后再用截留分子量为100000道尔顿的超滤膜过滤。
[0031]
上述的制备方法步骤6)中，所述反应的条件如下：升温至60～100℃，反应4～6小时；具体可为升温至70℃，反应5小时；
[0032]
所述反应的后处理如下：反应后的体系经2000～5000转/min离心2～30分钟(具体可为5000转/min离心20分钟)，取上清液减压蒸馏浓缩至原体积的1/20～1/30(具体可为1/20)，冻却结晶后即得到所述硫酸软骨素锌。
[0033]
本发明中，上述方法制备得到的所述硫酸软骨素锌纯度超过99.0％。
[0034]
本发明所述硫酸软骨素锌应用于制备医药、食品或化妆品中。
[0035]
本发明中，所述医药、食品或化妆品具有抗氧化功能。
[0036]
本发明通过硫酸软骨素与锌的结合，得到硫酸软骨素锌，能提高硫酸软骨素的抗氧化活性，进而提高其抗肿瘤、糖尿病等效果。
[0037]
本发明具有如下有益效果：
[0038]
1、通过本方法制备的硫酸软骨素锌具有硫酸软骨素和锌的双重功效，同时还可提高硫酸软骨素的抗氧化能力，降低锌的细胞毒性。
[0039]
2、由于硫酸软骨素分子量大，含有酸性的硫酸基和碱性的氨基，化学性质活泼，用通常的锌盐制备方法合成硫酸软骨素锌容易引入杂质(如氯化锌、硫酸锌或者碳酸锌容易引入不容易去除的阴离子)或者达不到纯度要求(如常规的氧化锌、氢氧化锌等)；而本发明
硫酸软骨素锌纯度超过99.0％，纯度高，能降低锌的细胞毒性，能应用于医药、食品、化妆品等领域。
附图说明
[0040]
图1为硫酸软骨素锌对成纤维细胞毒性的影响。
[0041]
图2为硫酸软骨素锌超氧自由基清楚能力测定结果。
具体实施方式
[0042]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0043]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0044]
下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
[0045]
本发明提供的硫酸软骨素锌，其结构式如式ⅰ所示：
[0046][0047][0048]
式ⅰ中，r1为so3或h；r2为so3或h；r3为so3或h；x为1～5的整数，n为2～100的整数。
[0049]
实施例1：硫酸软骨素锌的制备1
[0050]
取烘干后的鲟鱼软骨100克，粉碎后加入300毫升正己烷，室温(25℃)搅拌2小时，过滤后取滤饼加300克去离子水，粉碎成浆，然后加碳酸钠调ph至9.0，加热至50℃，加入300u/ml碱性蛋白酶，搅拌酶解4小时，然后加入200u/ml木瓜蛋白酶，搅拌酶解2小时，然后加浓盐酸调ph至3.0，降温至35℃，加入100u/ml胃蛋白酶，搅拌酶解3小时，然后升温至98℃，保持30分钟后降温至30℃，4000转/min离心30分钟，取上清液用截留分子量为5000道尔顿的超滤膜过滤，截留液加20倍体积的去离子水后再用截留分子量为100000道尔顿的超滤膜过滤，取透过液加入新制的50nm氢氧化锌，升温至70℃，反应5小时，然后5000转/min离心20分钟，取上清液减压蒸馏浓缩至原体积的1/20，冻干后得到白色粉末状硫酸软骨素锌5.0克，锌含量0.97％。
[0051]
实施例2：硫酸软骨素锌的制备2
[0052]
取烘干后的鲟鱼软骨100克，粉碎后加入300毫升正己烷，室温搅拌2小时，过滤后取滤饼加500克去离子水，粉碎成浆，加氢氧化钠调ph至8.8，加热至60℃，加入500u/ml碱性蛋白酶，搅拌酶解2小时，然后加入100u/ml木瓜蛋白酶，搅拌酶解2小时，然后加柠檬酸调ph至3.2，降温至35℃，加入50u/ml胃蛋白酶，搅拌酶解4小时，然后升温至100℃，保持20分钟后降温至25℃，5000转/min离心25分钟，取上清液用截留分子量为5000道尔顿的超滤膜过滤，截留液加20倍体积的去离子水后再用截留分子量为100000道尔顿的超滤膜过滤，取透过液加入新制的50纳米氧化锌，升温至80℃，反应4小时，然后4000转/min离心30分钟，取上清液减压浓缩至原体积的1/30，冻干后得到白色粉末状硫酸软骨素锌4.8克。
[0053]
实施例3：硫酸软骨素锌的含量的测定
[0054]
准确称取约2.3g(准确至0.0001g)硫酸软骨素锌，加适量蒸馏水溶解后转移至100ml容量瓶中定容，移取25.00ml溶液于250ml锥形瓶中，加10ml氨-氯化铵缓冲液(ph＝10.0)、4滴铬黑t指示剂，用edta标准溶液(0.05mol
·
l-1
)滴定至溶液自紫红色刚好转变为纯蓝色为止，记录所用edta标准溶液的体积(ml)。平行测定三次，按下式计算硫酸软骨素锌的含量。
[0055][0056]
按照上述公式计算，本发明实施例1中制备得到的硫酸软骨素锌中，锌含量0.97％；
[0057]
本发明实施例2中制备得到的硫酸软骨素锌中，锌含量1.05％。
[0058]
实施例4：硫酸软骨素锌的细胞毒性
[0059]
将成纤维细胞接种于96孔板，1
×
104个/孔，每组4个重复，用rpmi-1640完全培养基培养24小时。然后将硫酸软骨素锌(实施例1制备得到)溶解于rpmi-1640完全培养基，经0.22μm滤膜过滤除菌后稀释浓度为100μg/ml的混合培养液，置换去除原培养液，继续培养24小时。后通过cck-8检测试剂盒检测得到各实验组od值。不加硫酸软骨素锌作为空白对照组。浓度为100μg/ml的硫酸软骨素锌混合培养对成纤维细胞毒性的影响如图1所示，由图1中结果可知，硫酸软骨素锌混合液在浓度为100μg/ml时对成纤维细胞没有毒性作用。
[0060]
实施例5：硫酸软骨素锌的抗氧化活性
[0061]
1ml浓度分别为1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml的硫酸软骨素或硫酸软骨素锌溶液加入2.4ml ph 8.2tris-hcl缓冲溶液，混匀后加入0.3ml 8mmol/l邻苯三酚，迅速摇匀，倒入比色皿，在325nm每隔30s测定一次吸光值，线性范围内每分钟吸光值的增加值即为邻苯三酚的自氧化速率(a1)。以去离子水作空白对照，5min时数值计算样品的超氧阴离子自由基清除力。按下式计算：
[0062]
超氧阴离子自由基清除率(％)＝(a
0-a
325
)/a0×
100％
[0063]
a0：去离子水吸光值；a
325
：样品的吸光值
[0064]
结果见图2所示，由图2中结果可知，相同浓度情况下，硫酸软骨素锌的超氧自由基清除率高于硫酸软骨素，具有更强的抗氧化效果。

技术特征：
1.一种硫酸软骨素锌，其结构式如式ⅰ所示：式ⅰ中，r1为so3或h；r2为so3或h；r3为so3或h；x为1～5的整数，n为2～100的整数。2.一种权利要求1所述硫酸软骨素锌的制备方法，包括如下步骤：1)动物软骨脱脂后与水混合，粉碎成浆；2)将步骤1)得到的浆加碱调节ph后，加热，然后加入碱性蛋白酶进行第一次酶解；3)将所述第一次酶解后的体系与木瓜蛋白酶混合，进行第二次酶解；4)将所述第二次酶解后的体系加酸调节ph后与胃蛋白酶混合，进行第三次酶解；5)对所述第三次酶解后的体系进行酶灭活处理，然后离心后取上清液，将所述上清液通过超滤膜过滤处理，取透过液；6)将所述透过液与氧化锌或氢氧化锌混合进行反应，即得到所述硫酸软骨素锌。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述动物软骨选自猪软骨、牛软骨、鲨鱼软骨、鸡软骨、鸭软骨、乌贼软骨、鲟鱼软骨、鳗鱼软骨、鳐鱼软骨和魟鱼软骨中的至少一种；所述脱脂后的动物软骨与所述水的质量为1：3～10。4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述氧化锌或氢氧化锌的粒径为纳米级；所述氧化锌或氢氧化锌的粒径为20～100nm。5.根据权利要求2-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述加碱调节ph至8.5～9.5，所述加热的温度至40～60℃；所述碱性蛋白酶的加入量为100u/ml～10000u/ml；所述第一次酶解在搅拌条件下进行，所述第一次酶解的温度为40～60℃，时间为2～6小时。6.根据权利要求2-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述木瓜蛋白酶的加入量为50u/ml～5000u/ml；所述第二次酶解在搅拌条件下进行，所述第二次酶解的温度为40～60℃，时间为2～4小时。7.根据权利要求2-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中，所述加酸调节ph至2.0～4.0，所述加热的温度至30～45℃；所述胃蛋白酶的加入量为50u/ml～5000u/ml；所述第三次酶解在搅拌条件下进行，所述第三次酶解的温度为30～45℃，时间为2～4小时。8.根据权利要求2-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中，所述酶灭活处理条件如下：升温至95～100℃，95～100℃保持20～40分钟后降温至20～35℃；
所述离心的速率为2000～5000转/min，时间可为20～30分钟；所述上清液超滤膜过滤处理的操作如下：用截留分子量为5000～10000道尔顿的超滤膜过滤，取截留液加10～20倍体积的去离子水后再用截留分子量为100000道尔顿的超滤膜过滤。9.根据权利要求2-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤6)中，所述反应的条件如下：升温至60～100℃，反应4～6小时；所述反应的后处理如下：反应后的体系经2000～5000转/min离心2～30分钟，取上清液减压蒸馏浓缩至原体积的1/20～1/30，冻却结晶后即得到所述硫酸软骨素锌。10.权利要求1所述硫酸软骨素锌在制备医药、食品或化妆品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种硫酸软骨素锌及其制备方法与应用。本发明硫酸软骨素锌，其结构式如式Ⅰ所示，式Ⅰ中，R1为SO3或H；R2为SO3或H；R3为SO3或H；x为1～5的整数，n为2～100的整数。本发明制备方法包括如下步骤：动物软骨脱脂后与水混合，粉碎成浆；加碱调节pH后，加热，然后依次加入碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解，加酸调节pH后加入胃蛋白酶酶解；酶解后的体系进行酶灭活处理，然后离心后取上清液，将上清液通过超滤膜过滤处理，取透过液；将透过液与氧化锌或氢氧化锌混合进行反应，即得到硫酸软骨素锌。本发明方法制备的硫酸软骨素锌具有硫酸软骨素和锌的双重功效，同时还可提高硫酸软骨素的抗氧化能力，降低锌的细胞毒性。降低锌的细胞毒性。降低锌的细胞毒性。


技术研发人员：陈超 陆文超
受保护的技术使用者：清华大学
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/10/15