一种昆虫病原线虫共生菌及其代谢产物的应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种昆虫病原线虫共生菌及其代谢产物的应用。


背景技术：

2.昆虫病原线虫共生菌是寄生于昆虫病原线虫肠道内的一类细菌，夜蛾斯氏线虫共生菌是其中的一种，属于致病杆菌。夜蛾斯氏线虫共生菌与夜蛾斯氏线虫互惠共生，存在于昆虫病原线虫3龄侵染期幼虫的肠道中，以线虫为载体侵入昆虫并被释放到昆虫血腔内进行大量繁殖，随后产生毒素和抑菌物质，使昆虫患败血症死亡，同时产生抗生素，能有效抑制其他杂菌的二次侵染。
3.共生菌在代谢过程中能产生多种抑菌物质，以防止来自肠道和土壤中的微生物对虫尸的二次感染，保证线虫的生长和繁殖。且该抑菌物质除了能广泛抑制细菌、真菌和酵母菌外，对昆虫还有毒杀的作用。
4.在现有技术中，对昆虫病原线虫的研究较多，但对共生菌的研究比较薄弱，对其代谢产物活性成分的研究也较少，而不同菌种或菌株的共生菌产生的活性成分差异较大，因此对具有较高防效昆虫病原线虫的共生菌代谢产物及其抑菌活性研究是其进行产业化开发的基础，也是为提取工艺的研究提供理论的基础。


技术实现要素：

5.基于上述技术问题，本发明提供一种昆虫病原线虫共生菌及其代谢产物的应用，本发明利用大孔树脂吸附法获取菌株发酵液的粗提物，该粗提物对多种植物病原真菌有较强的抑菌活性，其中，该发酵液原液对大豆孢囊线虫病灌根处理的防治效果达61.47％。
6.其具体技术方案为：
7.一种昆虫病原线虫共生菌菌株，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2017年12月25日，保藏编号为cgmcc no.15122，经过生物学测定其为伯氏致病杆菌(xenorhabdus bovienii)。
8.一种昆虫病原线虫共生菌的应用，利用侵染期昆虫病原线虫感染大蜡螟幼虫，从死亡后的大蜡螟幼虫体内分离共生菌，并制备共生菌发酵液。
9.一种共生菌发酵液的应用，提取共生菌发酵液中的粗提物，并检测出粗提物的主要组成成分为三萜类化合物，戊酸代谢物，戊霉素，羟基喹啉，氨基酸类。
10.在上述技术方案中，通过液相色谱和质谱连用对共生菌发酵液中的粗提物进行检测。
11.在上述技术方案中，共生菌发酵液在大豆孢囊线虫病上的应用。
12.一种共生菌株发酵液的制备方法，包括如下步骤：
13.s1：通过将培养皿底部铺一层滤纸，再将10头大蜡螟幼虫放在培养皿滤纸上，加入1-2ml线虫悬液，将线虫悬液滴到大蜡螟体表及滤纸上，侵染大蜡螟，盖好培养皿盖，将培养
皿置于22-25℃，d24:l0的恒温箱内培养24h；
14.s2：将感染致死的大蜡螟幼虫放入70％的酒精内消毒5-10s后，取出大蜡螟，将剪刀通过酒精灯火焰消毒后，剪掉大蜡螟第2-3对腹足，从而收集血淋巴，并将血淋巴滴在ntba培养基上，再利用涂布棒在培养基上进行血淋巴涂布，完成涂布后将ntba培养基置于23-25℃，d24:l0的恒温箱内培养3-4天；
15.s3：培养3-4天后，利用接种环挑取培养基上蓝绿色，圆形且边缘有白色晕圈的菌落并涂于载玻片上，然后用品红进行染色，染色完成后盖好盖玻片并在盖玻片上滴加凡士林油或香柏油，并在油镜下观察是否为杆状；
16.s4：观察完毕后，利用消毒后的接种环挑取培养基上的菌落，并将其转接至试管斜面培养基上，再将消毒后的无菌棉塞塞入试管内，并将其置于23-25℃，d24:l0的恒温箱内培养3-4天；
17.s5：将培养3-4天后的试管取出，利用接种环挑取斜面菌落，将其转接到750ml圆底三角瓶内，且该圆底三角瓶内存有100ml共生菌培养液，将接种后的圆底三角瓶用无菌棉塞塞好，并置于摇床上，使其在23-25℃的环境下发酵两天，使发酵液为均匀的橙黄色。
18.一种共生菌发酵液粗提物的提取方法，包括如下步骤：
19.s1：配制分装lb液体培养基至20ml的试管中，每个试管5ml，且灭菌后静置冷却，再挑取nbta培养基中的sf18-91蓝绿色单菌落接种至冷却到室温的lb液体培养基中，再将装有lb液体培养基的试管置于180r/min、25℃的振荡培养箱中培养12h，作为一级种子发酵液；
20.s2：配制lb液体培养基分装至250ml三角瓶中，每个三角瓶50ml，且灭菌冷却后作为二级种子培养基，并将其置于180r/min、25℃的振荡培养箱中培养12h，作为二级种子发酵液。
21.s3：配制lb液体培养基分装至2l的三角瓶中，每瓶400ml，并加入20g大孔树脂，且灭菌后冷却作为发酵培养基，并将二级种子发酵液接种至发酵培养基中，再次以180r/min、25℃的振荡培养箱中培养2天；
22.s4：过滤收集大孔树脂，并使用蒸馏水清洗，去除大孔树脂表面残留的含有菌体的发酵液，使用烘干器将大孔树脂低温烘干48h，且干燥后的树脂放入塞好棉球的分液漏斗中，并加入甲醇浸泡，再盖上瓶塞摇晃分液漏斗后静置，直至大孔树脂完全沉淀，重复4-6次后收集甲醇浸提液，再次加入甲醇多次洗脱；
23.s5：合并收集到的浸提液并用旋转蒸发仪浓缩至干燥，将浓缩好的提取物用蒸馏水、甲醇1：1混合，直至完全溶解，再将溶液转移至分液漏斗中并加入等体积的二氯甲烷，使水、甲醇、二氯甲烷三种溶剂的比例为1:1:2，且总体积为800ml，再震荡摇匀后静置直至分层，重复三次，收集位于下层的二氯甲烷组分，再用旋转旋转蒸发仪浓缩至干燥，反复萃取多次，最后合并收集到的粗提物浸膏。
24.在上述技术方案中，共生菌sf的发酵培养基配方为nacl0.3％、啤酒酵母0.7％、干鸡蛋粉6.3％、玉米油4.9％、大豆粉11.5％、氨纶海绵13.4％、水62.9％。
25.本发明的一种昆虫病原线虫共生菌及其代谢产物的应用，与现有技术相比，有益效果为：
26.本发明利用大孔树脂吸附法获取菌株发酵液的粗提物，通过液相色谱和质谱连用
测定菌株发酵液粗提物主要组成成分为三萜类化合物，戊酸代谢物，戊霉素，羟基喹啉，氨基酸类。在上述几种化合物中48小时发酵液处理中8-羟基喹啉的含量最高，且具有较强的抑菌效果。
27.本发明根据实验结果表明，菌株的发酵代谢产物发酵液粗提物对多种植物病原真菌有较强的抑菌活性，其中，该发酵液原液对大豆孢囊线虫病灌根处理的防治效果达61.47％，由此可知该发酵液原液的防治效果好于其他几种药剂处理。
附图说明
28.图1为本发明的sf发酵液处理大豆孢囊检测出少量二龄线虫的特征图；
29.图2为本发明的sf发酵液处理孢囊后30天孢囊未孵化的特征图；
30.图3为本发明的清水对照处理后30天孢囊已孵化的特征图；
31.图4为本发明的清水对照处理大豆孢囊线检测出大量二龄幼虫的特征图；
32.图5为本发明的sf菌株的系统发育进化图。
33.图6为本发明的菌株在ntba培养基上的菌落的特征图
34.图7为本发明的菌株代谢产物对镰刀菌的抑制的特征图；
35.图8为本发明的显微镜下菌株的特征图。
具体实施方式
36.下面结合具体实施案例和附图1-8对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
37.实施例1：
38.本发明通过菌株16sdna测序，比对分析夜蛾斯氏线虫steinernema feltiae srp共生菌，简称sf-srp，为致病杆菌属细菌。
39.一种昆虫病原线虫共生菌菌株，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2017年12月25日，保藏编号为cgmcc no.15122，经过生物学测定其为伯氏致病杆菌(xenorhabdus bovienii)。
40.一种昆虫病原线虫共生菌的应用，利用侵染期昆虫病原线虫感染大蜡螟幼虫，从死亡后的大蜡螟幼虫体内分离共生菌，并制备共生菌发酵液。
41.一种共生菌发酵液的应用，提取共生菌发酵液中的粗提物，并检测出粗提物的主要组成成分为三萜类化合物，戊酸代谢物，戊霉素，羟基喹啉，氨基酸类。
42.其中，8-羟基喹啉是一种农药中间体，有较强的抑菌效果。
43.在本发明的实施例中，通过液相色谱和质谱连用对共生菌发酵液中的粗提物进行检测。
44.具体地，本发明所用的液质联用系统由沃特世acquityi-classplus超高效液相串联沃特世xevog2-xsqtof高分辨质谱仪组成，所使用色谱柱为购自沃特世的acquityuplchsst3色谱柱。
45.正离子模式：流动相a：0.1％甲酸水溶液；流动相b：0.1％甲酸乙腈。
46.负离子模式：流动相a：0.1％甲酸水溶液；流动相b：0.1％甲酸乙腈。
47.其中，进样体积为1ul。
48.具体地，液相色谱梯度参数如表1所示。
49.时间(min)流速(μl/min)a％b％0.04009820.2540098210.040029813.040029813.1400982
50.表1
51.具体地，具体代谢产物组成成分如表2、表3所示。
[0052][0053]
表2
[0054][0055]
表3
[0056]
由表2和表3可知，代谢产物的主要组成成分为三萜类化合物，戊酸代谢物，戊霉素，羟基喹啉，氨基酸类。
[0057]
在本发明的实施例中，共生菌发酵液在大豆孢囊线虫病上的应用。
[0058]
具体地，共生菌代谢产物发酵液粗提物对多种植物病原真菌有较强的抑菌活性，本发明通过温室盆栽试验，测定了共生菌发酵液对大豆孢囊线虫病灌根处理的防治效果达61.47％，与市面上其他杀线虫剂相比，防治效果更高。
[0059]
具体地，对大豆孢囊的防治效果如下图所示。
[0060]
处理名称平均孢囊数(个)防效％126％多福克34.570.91235％多福克14.2559.163鱼蛋白17.2550.564srp
·
18-91菌株发酵液6.9761.475200亿多粘类芽孢杆菌18.5146.9563.2％阿维菌素11.8146.467淡紫拟青霉可湿性粉剂13.2946.058
…
空白对照34.89
[0061]
由该实验数据可知，共生菌发酵液对大豆孢囊线虫的防治效果，在7种常见药剂中防治效果最高，具有开发低毒高效防治大豆孢囊线虫病生防制剂的开发前景。
[0062]
实施例2：
[0063]
一种共生菌株发酵液的制备方法，包括如下步骤：
[0064]
s1：通过将培养皿底部铺一层滤纸，再将10头大蜡螟幼虫放在培养皿滤纸上，加入1-2ml线虫悬液，将线虫悬液滴到大蜡螟体表及滤纸上，侵染大蜡螟，盖好培养皿盖，将培养皿置于22-25℃，d24:l0的恒温箱内培养24h；
[0065]
s2：将感染致死的大蜡螟幼虫放入70％的酒精内消毒5-10s后，取出大蜡螟，将剪
刀通过酒精灯火焰消毒后，剪掉大蜡螟第2-3对腹足，从而收集血淋巴，并将血淋巴滴在ntba培养基上，再利用涂布棒在培养基上进行血淋巴涂布，完成涂布后将ntba培养基置于23-25℃，d24:l0的恒温箱内培养3-4天；
[0066]
s3：培养3-4天后，利用接种环挑取培养基上的菌落并涂于载玻片上，然后用品红进行染色，染色完成后盖好盖玻片并在盖玻片上滴加凡士林油或香柏油，并在油镜下观察是否为杆状；
[0067]
s4：观察完毕后，利用消毒后的接种环挑取培养基上的菌落，并将其转接至试管斜面培养基上，再将消毒后的无菌棉塞塞入试管内，并将其置于23-25℃，d24:l0的恒温箱内培养3-4天；
[0068]
s5：将培养3-4天后的试管取出，利用接种环挑取斜面菌落，将其转接到750ml圆底三角瓶内，且该圆底三角瓶内存有100ml共生菌培养液，将接种后的圆底三角瓶用无菌棉塞塞好，并置于摇床上，使其在23-25℃的环境下发酵两天，使发酵液为均匀的橙黄色。
[0069]
实施例3：
[0070]
一种共生菌发酵液粗提物的提取方法，包括如下步骤：
[0071]
s1：配制分装lb培养至20ml的试管中，每个试管5ml，且灭菌后静置冷却，再挑取nbta培养基中的sf18-91蓝绿色单菌落接种至冷却到室温的lb液体培养基中，再将装有lb液体培养基的试管置于180r/min、25℃的振荡培养箱中培养12h，作为一级种子发酵液；
[0072]
s2：配制lb液体培养基分装至250ml三角瓶中，每个三角瓶50ml，且灭菌冷却后作为二级种子培养基，并将其置于180r/min、25℃的振荡培养箱中培养12h，作为二级种子发酵液。
[0073]
s3：配制lb液体培养基分装至2l的三角瓶中，每瓶400ml，并加入20g大孔树脂，且灭菌后冷却作为发酵培养基，并将二级种子发酵液接种至发酵培养基中，再次以180r/min、25℃的振荡培养箱中培养2天；
[0074]
s4：过滤收集大孔树脂，并使用蒸馏水清洗，去除大孔树脂表面残留的含有菌体的发酵液，使用烘干器将大孔树脂低温烘干48h，且干燥后的树脂放入塞好棉球的分液漏斗中，并加入甲醇浸泡，再盖上瓶塞摇晃分液漏斗后静置，直至大孔树脂完全沉淀，且重复多次后收集甲醇浸提液，再次加入甲醇多次洗脱；
[0075]
s5：合并收集到的浸提液并用旋转蒸发仪浓缩至干燥，将浓缩好的提取物用蒸馏水、甲醇1：1混合，直至完全溶解，再将溶液转移至分液漏斗中并加入等体积的二氯甲烷，使水、甲醇、二氯甲烷三种溶剂的比例为1:1:2，且总体积为800ml，再震荡摇匀后静置直至分层，重复三次，收集位于下层的二氯甲烷组分，再用旋转旋转蒸发仪浓缩至干燥，反复萃取多次，最后合并收集到的粗提物浸膏。
[0076]
在本发明的实施例中，培养基为nacl0.3％、啤酒酵母0.7％、干鸡蛋粉6.3％、玉米油4.9％、大豆粉11.5％、氨纶海绵13.4％、水62.9％。
[0077]
实施例4：
[0078]
在本发明的实施例中，结合实施例2和实施例3，利用侵染期昆虫病原线虫感染大蜡螟幼虫，侵染24h后从死亡的大蜡螟幼虫体内分离共生菌，首先取一滴死亡大蜡螟淋巴滴入细菌分离ntba培养基上，在23℃下培养72h后，挑取单菌落，在显微镜下进行鉴定，然后转接于斜面细菌繁殖培养基上，在23℃下培养48h后，挑取斜面试管内的单菌落接种到盛有发
酵液的三角瓶中，在23℃、160rpm震荡培养48h后，取得原种菌液，然后将原种菌液接入含有线虫及共生菌公用培养基的繁殖袋内，在23℃下进行生产繁殖，48h后将上述过程繁殖的原种线虫接入繁殖袋内继续培养，10天后从培养基内分离线虫，同时进行质量检测与计数，确定每批次的质量与数量后进行产品包装与保存。
[0079]
在本发明的描述中，术语“多个”则指两个或两个以上，除非另有明确的限定，术语“上”、“下”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制；术语“连接”、“安装”、“固定”等均应做广义理解，例如，“连接”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0080]
在本发明的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本发明中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0081]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种昆虫病原线虫共生菌菌株，其特征在于，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2017年12月25日，保藏编号为cgmcc no.15122。2.一种昆虫病原线虫共生菌的应用，其特征在于，利用侵染期昆虫病原线虫感染大蜡螟幼虫，从死亡后的大蜡螟幼虫体内分离共生菌，并制备共生菌发酵液。3.一种共生菌发酵液的应用，其特征在于，提取共生菌发酵液中的粗提物，并检测出粗提物的主要组成成分为三萜类化合物，戊酸代谢物，戊霉素，羟基喹啉，氨基酸类。4.根据权利要求3所述的一种共生菌发酵液的应用，其特征在于，通过液相色谱和质谱连用对共生菌发酵液中的粗提物进行检测。5.根据权利要求3所述的共生菌发酵液在大豆孢囊线虫病上的应用。6.一种共生菌株发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：s1：通过将培养皿底部铺一层滤纸，再将10头大蜡螟幼虫放在培养皿滤纸上，加入1-2ml线虫悬液，将线虫悬液滴到大蜡螟体表及滤纸上，侵染大蜡螟，盖好培养皿盖，将培养皿置于22-25℃，d24:l0的恒温箱内培养24h；s2：将感染致死的大蜡螟幼虫放入70%的酒精内消毒5-10s后，取出大蜡螟，将剪刀通过酒精灯火焰消毒后，剪掉大蜡螟第2-3对腹足，从而收集血淋巴，并将血淋巴滴在ntba培养基上，再利用涂布棒在培养基上进行血淋巴涂布，完成涂布后将ntba培养基置于23-25℃，d24:l0的恒温箱内培养3-4天；s3：培养3-4天后，利用接种环挑取培养基上蓝绿色，圆形且边缘有白色晕圈的菌落并涂于载玻片上，然后用品红进行染色，染色完成后盖好盖玻片并在盖玻片上滴加凡士林油或香柏油，并在油镜下观察是否为杆状；s4：观察完毕后，利用消毒后的接种环挑取培养基上蓝绿色的菌落，并将其转接至试管斜面培养基上，再将消毒后的无菌棉塞塞入试管内，并将其置于23-25℃，d24:l0的恒温箱内培养3-4天；s5：将培养3-4天后的试管取出，利用接种环挑取斜面菌落，将其转接到750ml圆底三角瓶内，且该圆底三角瓶内存有100ml共生菌培养液，将接种后的圆底三角瓶用无菌棉塞塞好，并置于摇床上，使其在23-25℃的环境下发酵两天，使发酵液为均匀的橙黄色。7.一种共生菌发酵液粗提物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：s1：配制分装lb液体培养至20ml的试管中，每个试管5ml，且灭菌后静置冷却，再挑取nbta培养基中的sf18-91蓝绿色单菌落接种至冷却到室温的lb液体培养基中，再将装有lb液体培养基的试管置于180r/min、25℃的振荡培养箱中培养12h，作为一级种子发酵液；s2：配制lb液体培养基分装至250ml三角瓶中，每个三角瓶50ml，且灭菌冷却后作为二级种子培养基，并将其置于180r/min、25℃的振荡培养箱中培养12h，作为二级种子发酵液；s3：配制lb液体培养基分装至2l的三角瓶中，每瓶400ml，并加入20g大孔树脂，且灭菌后冷却作为发酵培养基，并将二级种子发酵液接种至发酵培养基中，再次以180r/min、25℃的振荡培养箱中培养2天；s4：过滤收集大孔树脂，并使用蒸馏水清洗，去除大孔树脂表面残留的含有菌体的发酵液，使用烘干器将大孔树脂低温烘干48h，且干燥后的树脂放入塞好棉球的分液漏斗中，并加入甲醇浸泡，再盖上瓶塞摇晃分液漏斗后静置，直至大孔树脂完全沉淀，且重复4-6次后收集甲醇浸提液，再次加入甲醇多次洗脱；
s5：合并收集到的浸提液并用旋转蒸发仪浓缩至干燥，将浓缩好的提取物用蒸馏水、甲醇1：1混合，直至完全溶解，再将溶液转移至分液漏斗中并加入等体积的二氯甲烷，使水、甲醇、二氯甲烷三种溶剂的比例为1:1:2，且总体积为800ml，再震荡摇匀后静置直至分层，重复三次，收集位于下层的二氯甲烷组分，再用旋转旋转蒸发仪浓缩至干燥，反复萃取多次，最后合并收集到的粗提物浸膏。8.根据权利要求7所述的一种共生菌株发酵液的制备方法，其特征在于，共生菌sf的发酵培养基配方为nacl0.3%、啤酒酵母0.7%、干鸡蛋粉6.3%、玉米油4.9%、大豆粉11.5%、氨纶海绵13.4%、水62.9%。

技术总结
本发明提供了一种昆虫病原线虫共生菌及其代谢产物的应用，所属生物技术领域，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2017年12月25日，保藏编号为CGMCC NO.15122；利用侵染期昆虫病原线虫感染大蜡螟幼虫，从死亡后的大蜡螟幼虫体内分离共生菌，并制备共生菌发酵液；提取共生菌发酵液中的粗提物，检测出粗提物的主要组成成分为三萜类化合物，戊酸代谢物，戊霉素，羟基喹啉，氨基酸类。本发明利用大孔树脂吸附法获取菌株发酵液的粗提物，该粗提物对多种植物病原真菌有较强的抑菌活性，其中，该发酵液原液对大豆孢囊线虫病灌根处理的防治效果达61.47%。大豆孢囊线虫病灌根处理的防治效果达61.47%。大豆孢囊线虫病灌根处理的防治效果达61.47%。


技术研发人员：张金花 李茂海 苏兰淇 田成丽 刘晓梅 李莉 丁岩 张伟 张强 李建平
受保护的技术使用者：吉林省农业科学院
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/10/15