一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法与流程

1.本公开涉及微生物菌剂技术领域，具体涉及一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法。


背景技术：

2.柑橘溃疡病是由地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种引起，对柑橘产业造成了很大经济损失。
3.柑橘溃疡病的发生是以老叶上病斑为传染源，当温度和空气湿度适宜时溢出，通过风雨、昆虫传播，经寄主的气孔和伤口感染柑橘幼嫩组织。因此，常规防治溃疡病的措施主要是以防治虫害，及时清园，剪除病枝病叶的方式减轻或者预防溃疡病的发生和蔓延，该方法成本高，效果无保障。药剂防治普遍采用铜制剂，其可降低累积在新叶上的菌源并减轻后续的感染，但铜制剂具有以下缺点：（1）降低了土壤和根际细菌的多样性，病原菌耐药性越来越强；（2）增加了土壤重金属污染；（3）果面光洁发亮，诱集螨类害虫，刺激螨类害虫大爆发；（4）果实铜元素超标，引发肝损伤等。
4.微生物农药是生物防治的重要组成部分，具有选择性强，对人、畜、农作物和自然环境安全，不易产生抗药性等特点，因此得到了广泛研究；目前市场上已经有较为成熟的微生物农药产品，例如苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等，但是在将微生物农药用于柑橘溃疡病的防治时，存在起效慢、产品稳定性差、产品保质期短的缺点，将微生物农药加工成可湿粉剂时，加入的分散剂、润湿剂、稳定剂会对微生物农药的起效时间产生影响，而且可湿粉剂的悬浮率较低，虽然可以通过加大分散剂用量提高悬浮率，但是分散剂加入量过大，会影响微生物可湿粉剂的润湿性，还会进一步延长微生物可湿粉剂的起效时间，因此，研发一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，能够在实现起效快、产品稳定性高、产品保质期长的同时，提高枯草芽孢杆菌可湿粉剂的悬浮率、润湿性，是目前急需解决的技术问题。


技术实现要素：

5.本发明提供一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，能够在实现起效快、产品稳定性高、产品保质期长的同时，提高枯草芽孢杆菌可湿粉剂的悬浮率、润湿性。
6.为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，由以下步骤组成：菌种活化、一级种子液制备、二级种子液制备、发酵培养、真空喷雾干燥、干粉包覆、混合。
7.所述菌种活化的方法为，将保存的枯草芽孢杆菌菌株接种于lb固体培养基上，于32-34℃下培养30-32h；挑取单菌落转接到lb斜面培养基上，于34-36℃培养18-20h，用无菌水清洗培养基表面菌体，得到接种液；所述枯草芽孢杆菌的分类命名为：枯草芽孢杆菌bacillus subtilis，保藏于中国
微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月26日，保藏编号为cgmcc no.24778，在专利公开号为cn115927034a，专利名称为一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌、菌剂及其应用的专利中已被公开；所述一级种子液制备的方法为，按照体积百分比为8-10%的接种量向lb种子培养基中接入接种液，控制转速为210-230rpm，温度为32-34℃，摇床培养18-20h后，得到一级种子液；所述二级种子液制备的方法为，按照体积百分比2-4%的接种量向种子培养基中接入一级种子液，控制通气量为1-1.2v／v
·
min，搅拌速度为220-240rpm，培养时间为18-20h，培养结束得到二级种子液；所述种子培养基的组成，按重量份计，由以下组成：2-2.5份葡萄糖，1.5-1.8份蛋白胨，0.8-1份酵母粉，0.6-0.8份牛肉膏，0.5-0.6份氯化钠，93.3-94.6份去离子水；所述发酵培养的方法为，按照体积百分比为8-10%的接种量向发酵培养基中接入二级种子液，控制通气量为1-1.2v／v
·
min，搅拌速度为220-240rpm，培养时间为28-30h，得到菌株发酵液；所述发酵培养基的组成，按重量份计，由以下组成：5-6份葡萄糖，1.5-2份蛋白胨，0.06-0.08份酵母粉，0.2-0.4份蛋白胨，1-1.2份豆粕粉，0.03-0.05份硫酸镁，0.03-0.05份硫酸锰，0.04-0.06份麦芽糊精，90.22-92.18份去离子水；所述真空喷雾干燥的方法为，将菌株发酵液进行真空喷雾干燥，控制真空喷雾干燥的真空度为0.06-0.07mpa，进风温度为110-115℃，出风温度为60-65℃，真空喷雾干燥结束得到干粉；所述干粉的芽孢率为92.7-93.4%，发酵液活菌数为2.7
×
10
10-2.9
×
10
10
cfu/ml；所述干粉包覆的方法为，将干粉与包覆剂加入球磨机中，控制球磨机的球料比为10-15:1，球磨转速为300-350rpm，球磨温度为25-30℃，球磨时间为20-25min，球磨结束得到包覆后的干粉；所述干粉包覆中，干粉与包覆剂的重量比为1:1.3-1.5；所述包覆剂的组成，按重量份计，由以下组成：10-12份硅藻土，6-7份预糊化淀粉，2-3份羟丙基甲基纤维素，1-2份阳离子聚丙烯酰胺，0.1-0.2份铝酸酯偶联剂dl-411；所述阳离子聚丙烯酰胺的分子量为300-400万，离子度为10-20%。
8.所述混合的方法为，将包覆后的干粉、膨润土、白炭黑、聚乙烯吡咯烷酮、六偏磷酸钠、二丁基萘磺酸钠、微囊化颗粒、扩散剂nnf混合均匀后得到初级可湿粉剂；所述混合中，包覆后的干粉、改性膨润土、改性白炭黑、聚乙烯吡咯烷酮、六偏磷酸钠、二丁基萘磺酸钠、微囊化颗粒、扩散剂nnf的重量比为25-30:10-12:13-16:3-5:2-3:2-4:3-4:0.4-0.6；所述微囊化颗粒的制备方法为：将海藻多糖、海藻酸钠、十二烷基苯磺酸钠、去离子水混合后加热至40-45℃后进行搅拌，控制搅拌速度为200-250rpm，搅拌时间为10-12min，然后加入环糊精、羧甲基纤维素钠、乙二胺四乙酸二钠，继续搅拌20-25min后进行高压均质，控制高压均质的压力为40-50mpa，次数为3-5次，每次高压均质的时间为10-12min，高压均质结束得到微囊化颗粒液，将微囊化颗粒液进行喷雾干燥，控制喷雾干燥时的进风温度为130-140℃，出风温度为50-60℃，喷雾干燥结束得到微囊化颗粒；
所述微囊化颗粒的制备中，海藻多糖、海藻酸钠、十二烷基苯磺酸钠、去离子水、环糊精、羧甲基纤维素钠、乙二胺四乙酸二钠的重量比为30-35:20-25:15-18:110-120:25-30:20-23:3-5。
9.与现有技术相比，本发明的有益效果为：（1）本发明制备的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂，悬浮率高，润湿性好，悬浮率为91.98-92.52s，润湿时间为37
″
6-38
″
7；（2）本发明制备的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂，产品稳定性高，热贮（54
±
2℃，14天）后悬浮率为91.63-92.24%，热贮（54
±
2℃，14天）后润湿时间为40
″
1-40
″
3，常温（23
±
2℃）贮存1个月后悬浮率为91.87-92.49%，常温（23
±
2℃）贮存1个月后润湿时间为37
″
8-38
″
8，常温（23
±
2℃）贮存6个月后悬浮率为91.84-92.45%，常温（23
±
2℃）贮存6个月后润湿时间为38
″
5-39
″
6，常温（23
±
2℃）贮存12个月后悬浮率为91.67-92.33%，常温（23
±
2℃）贮存6个月后润湿时间为41
″
2-42
″
1；（3）本发明制备的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂，起效快，对柑橘溃疡病的防治效果好，在柑橘溃疡病发病初期进行第一次施药，第一次施药结束7天后进行第二次施药，每次施药时枯草芽孢杆菌可湿粉剂用量为0.5g/株，第二次施药后3d的防治效果为69.15-70.17%，第二次施药后7d的防治效果为73.27-74.71%，第二次施药后14d的防治效果为78.84-80.36%，第二次施药后21d的防治效果为81.87-82.11%，第二次施药后28d的防治效果为81.65-82.71%；（4）本发明制备的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂，产品保质期长，在常温（23
±
2℃）下贮存12个月后，在柑橘溃疡病发病初期进行第一次施药，第一次施药结束7天后进行第二次施药，每次施药时枯草芽孢杆菌可湿粉剂用量为0.5g/株，第二次施药后3d的防治效果为69.15-69.30%，第二次施药后7d的防治效果为73.39-73.86%，第二次施药后14d的防治效果为79.74-80.37%，第二次施药后21d的防治效果为81.79-82.10%，第二次施药后28d的防治效果为82.00-82.41%。
具体实施方式
10.为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现说明本发明的具体实施方式。
11.实施例1一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，具体为：1.菌种活化：将保存的枯草芽孢杆菌菌株接种于lb固体培养基上，于32℃下培养30h；挑取单菌落转接到lb斜面培养基上，于34℃培养18h，用无菌水清洗培养基表面菌体，得到接种液；所述枯草芽孢杆菌的分类命名为：枯草芽孢杆菌bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月26日，保藏编号为cgmcc no.24778，在专利公开号为cn115927034a，专利名称为一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌、菌剂及其应用的专利中已被公开；2.一级种子液制备：按照体积百分比为8%的接种量向lb种子培养基中接入接种液，控制转速为210rpm，温度为32℃，摇床培养18h后，得到一级种子液；
3.二级种子液制备：按照体积百分比2%的接种量向种子培养基中接入一级种子液，控制通气量为1v／v
·
min，搅拌速度为220rpm，培养时间为18h，培养结束得到二级种子液；所述种子培养基的组成，按重量份计，由以下组成：2份葡萄糖，1.5份蛋白胨，0.8份酵母粉，0.6份牛肉膏，0.5份氯化钠，93.3份去离子水；4.发酵培养：按照体积百分比为8%的接种量向发酵培养基中接入二级种子液，控制通气量为1v／v
·
min，搅拌速度为220rpm，培养时间为28h，得到菌株发酵液；所述发酵培养基的组成，按重量份计，由以下组成：5份葡萄糖，1.5份蛋白胨，0.06份酵母粉，0.2份蛋白胨，1份豆粕粉，0.03份硫酸镁，0.03份硫酸锰，0.04份麦芽糊精，90.22份去离子水；5.真空喷雾干燥：将菌株发酵液进行真空喷雾干燥，控制真空喷雾干燥的真空度为0.06mpa，进风温度为110℃，出风温度为60℃，真空喷雾干燥结束得到干粉；所述干粉的芽孢率为92.7%，发酵液活菌数为2.7
×
10
10
cfu/ml；6.干粉包覆：将干粉与包覆剂加入球磨机中，控制球磨机的球料比为10:1，球磨转速为300rpm，球磨温度为25℃，球磨时间为20min，球磨结束得到包覆后的干粉；所述干粉包覆中，干粉与包覆剂的重量比为1:1.3；所述包覆剂的组成，按重量份计，由以下组成：10份硅藻土，6份预糊化淀粉，2份羟丙基甲基纤维素，1份阳离子聚丙烯酰胺，0.1份铝酸酯偶联剂dl-411；所述阳离子聚丙烯酰胺的分子量为300万，离子度为10%；7.混合：将包覆后的干粉、膨润土、白炭黑、聚乙烯吡咯烷酮、六偏磷酸钠、二丁基萘磺酸钠、微囊化颗粒、扩散剂nnf混合均匀后得到初级可湿粉剂；包覆后的干粉、改性膨润土、改性白炭黑、聚乙烯吡咯烷酮、六偏磷酸钠、二丁基萘磺酸钠、微囊化颗粒、扩散剂nnf的重量比为25:10:13:3:2:2:3:0.4；所述微囊化颗粒的制备方法为：将海藻多糖、海藻酸钠、十二烷基苯磺酸钠、去离子水混合后加热至40℃后进行搅拌，控制搅拌速度为200rpm，搅拌时间为10min，然后加入环糊精、羧甲基纤维素钠、乙二胺四乙酸二钠，继续搅拌20min后进行高压均质，控制高压均质的压力为40mpa，次数为3次，每次高压均质的时间为10min，高压均质结束得到微囊化颗粒液，将微囊化颗粒液进行喷雾干燥，控制喷雾干燥时的进风温度为130℃，出风温度为50℃，喷雾干燥结束得到微囊化颗粒；海藻多糖、海藻酸钠、十二烷基苯磺酸钠、去离子水、环糊精、羧甲基纤维素钠、乙二胺四乙酸二钠的重量比为30:20:15:110:25:20:3。
12.实施例2一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，具体为：1.菌种活化：将保存的枯草芽孢杆菌菌株接种于lb固体培养基上，于33℃下培养31h；挑取单菌落转接到lb斜面培养基上，于35℃培养19h，用无菌水清洗培养基表面菌体，得到接种液；所述枯草芽孢杆菌的分类命名为：枯草芽孢杆菌bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月26日，保藏编号为cgmcc no.24778，在专利公开号为cn115927034a，专
利名称为一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌、菌剂及其应用的专利中已被公开；2.一级种子液制备：按照体积百分比为9%的接种量向lb种子培养基中接入接种液，控制转速为220rpm，温度为33℃，摇床培养19h后，得到一级种子液；3.二级种子液制备：按照体积百分比3%的接种量向种子培养基中接入一级种子液，控制通气量为1.1v／v
·
min，搅拌速度为230rpm，培养时间为19h，培养结束得到二级种子液；所述种子培养基的组成，按重量份计，由以下组成：2.2份葡萄糖，1.6份蛋白胨，0.9份酵母粉，0.7份牛肉膏，0.5份氯化钠，94份去离子水；4.发酵培养：按照体积百分比为9%的接种量向发酵培养基中接入二级种子液，控制通气量为1.1v／v
·
min，搅拌速度为230rpm，培养时间为29h，得到菌株发酵液；所述发酵培养基的组成，按重量份计，由以下组成：5.5份葡萄糖，1.8份蛋白胨，0.07份酵母粉，0.3份蛋白胨，1.1份豆粕粉，0.04份硫酸镁，0.04份硫酸锰，0.05份麦芽糊精，91份去离子水。
13.5.真空喷雾干燥：将菌株发酵液进行真空喷雾干燥，控制真空喷雾干燥的真空度为0.06mpa，进风温度为112℃，出风温度为62℃，真空喷雾干燥结束得到干粉；所述干粉的芽孢率为93%，发酵液活菌数为2.8
×
10
10
cfu/ml；6.干粉包覆：将干粉与包覆剂加入球磨机中，控制球磨机的球料比为12:1，球磨转速为320rpm，球磨温度为28℃，球磨时间为22min，球磨结束得到包覆后的干粉；干粉与包覆剂的重量比为1:1.4；所述包覆剂的组成，按重量份计，由以下组成：11份硅藻土，6.5份预糊化淀粉，2.5份羟丙基甲基纤维素，1.5份阳离子聚丙烯酰胺，0.2份铝酸酯偶联剂dl-411；所述阳离子聚丙烯酰胺的分子量为400万，离子度为15%；7.混合：将包覆后的干粉、膨润土、白炭黑、聚乙烯吡咯烷酮、六偏磷酸钠、二丁基萘磺酸钠、微囊化颗粒、扩散剂nnf混合均匀后得到初级可湿粉剂；包覆后的干粉、改性膨润土、改性白炭黑、聚乙烯吡咯烷酮、六偏磷酸钠、二丁基萘磺酸钠、微囊化颗粒、扩散剂nnf的重量比为28:11:14:4:2.5:3:3.5:0.5；所述微囊化颗粒的制备方法为：将海藻多糖、海藻酸钠、十二烷基苯磺酸钠、去离子水混合后加热至42℃后进行搅拌，控制搅拌速度为220rpm，搅拌时间为11min，然后加入环糊精、羧甲基纤维素钠、乙二胺四乙酸二钠，继续搅拌22min后进行高压均质，控制高压均质的压力为45mpa，次数为4次，每次高压均质的时间为11min，高压均质结束得到微囊化颗粒液，将微囊化颗粒液进行喷雾干燥，控制喷雾干燥时的进风温度为135℃，出风温度为55℃，喷雾干燥结束得到微囊化颗粒；海藻多糖、海藻酸钠、十二烷基苯磺酸钠、去离子水、环糊精、羧甲基纤维素钠、乙二胺四乙酸二钠的重量比为32:22:16:115:28:22:4。
14.实施例3一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，具体为：1.菌种活化：将保存的枯草芽孢杆菌菌株接种于lb固体培养基上，于34℃下培养32h；挑取单菌落转接到lb斜面培养基上，于36℃培养20h，用无菌水清洗培养基表面菌体，得到接种液；
所述枯草芽孢杆菌的分类命名为：枯草芽孢杆菌bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月26日，保藏编号为cgmcc no.24778，在专利公开号为cn115927034a，专利名称为一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌、菌剂及其应用的专利中已被公开；2.一级种子液制备：按照体积百分比为10%的接种量向lb种子培养基中接入接种液，控制转速为230rpm，温度为34℃，摇床培养20h后，得到一级种子液；3.二级种子液制备：按照体积百分比2-4%的接种量向种子培养基中接入一级种子液，控制通气量为1.2v／v
·
min，搅拌速度为240rpm，培养时间为20h，培养结束得到二级种子液；所述种子培养基的组成，按重量份计，由以下组成：2.5份葡萄糖，1.8份蛋白胨，1份酵母粉，0.8份牛肉膏，0.6份氯化钠，94.6份去离子水；4.发酵培养：按照体积百分比为10%的接种量向发酵培养基中接入二级种子液，控制通气量为1.2v／v
·
min，搅拌速度为240rpm，培养时间为30h，得到菌株发酵液；所述发酵培养基的组成，按重量份计，由以下组成：6份葡萄糖，2份蛋白胨，0.08份酵母粉，0.4份蛋白胨，1.2份豆粕粉，0.05份硫酸镁，0.05份硫酸锰，0.06份麦芽糊精，92.18份去离子水；5.真空喷雾干燥的方法为，将菌株发酵液进行真空喷雾干燥，控制真空喷雾干燥的真空度为0.07mpa，进风温度为115℃，出风温度为65℃，真空喷雾干燥结束得到干粉；所述干粉的芽孢率为93.4%，发酵液活菌数为2.9
×
10
10
cfu/ml；6.干粉包覆：将干粉与包覆剂加入球磨机中，控制球磨机的球料比为15:1，球磨转速为350rpm，球磨温度为30℃，球磨时间为25min，球磨结束得到包覆后的干粉；干粉与包覆剂的重量比为1:1.5；所述包覆剂的组成，按重量份计，由以下组成：12份硅藻土，7份预糊化淀粉，3份羟丙基甲基纤维素，2份阳离子聚丙烯酰胺，0.2份铝酸酯偶联剂dl-411；所述阳离子聚丙烯酰胺的分子量为400万，离子度为20%；7.混合：将包覆后的干粉、膨润土、白炭黑、聚乙烯吡咯烷酮、六偏磷酸钠、二丁基萘磺酸钠、微囊化颗粒、扩散剂nnf混合均匀后得到初级可湿粉剂；包覆后的干粉、改性膨润土、改性白炭黑、聚乙烯吡咯烷酮、六偏磷酸钠、二丁基萘磺酸钠、微囊化颗粒、扩散剂nnf的重量比为30:12:16:5:3:4:4:0.6；所述微囊化颗粒的制备方法为：将海藻多糖、海藻酸钠、十二烷基苯磺酸钠、去离子水混合后加热至45℃后进行搅拌，控制搅拌速度为250rpm，搅拌时间为12min，然后加入环糊精、羧甲基纤维素钠、乙二胺四乙酸二钠，继续搅拌25min后进行高压均质，控制高压均质的压力为50mpa，次数为5次，每次高压均质的时间为12min，高压均质结束得到微囊化颗粒液，将微囊化颗粒液进行喷雾干燥，控制喷雾干燥时的进风温度为140℃，出风温度为60℃，喷雾干燥结束得到微囊化颗粒；海藻多糖、海藻酸钠、十二烷基苯磺酸钠、去离子水、环糊精、羧甲基纤维素钠、乙二胺四乙酸二钠的重量比为35:25:18:120:30:23:5。
15.对比例1采用实施例1所述的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，其不
同之处在于：省略第6步干粉包覆，即直接将第5步制备的干粉直接用于第7步一次混合。
16.对比例2采用实施例1所述的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，其不同之处在于：第7步二次混合步骤中省略微囊化颗粒的加入。
17.试验例1对实施例1-3和对比例1-2制备的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的质量指标进行测试，测试结果如下所示:
18.由上述结果可以看出，实施例1-3、对比例1制备的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的悬浮率、润湿性、产品稳定性好，对比例2制备的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的悬浮率、润湿性、产品稳定性差，说明在二次混合步骤中加入微囊化颗粒能够提高枯草芽孢杆菌可湿粉剂的悬浮率、润湿性、产品稳定性。
19.试验例2在广西南宁市武鸣区仙湖镇那溪村选取在低洼、潮湿、密闭、管理粗放的历年溃疡病发较重的6个果园用于试验，分别标为1-6号果园，保证每个果园中的柑橘树的树种、树龄、长势及水肥管理等条件一致，每个果园随机选择50棵柑橘树作为试验柑橘树。
20.分别将实施例1-3和对比例1-2制备的枯草芽孢杆菌可湿粉剂稀释成1000倍液，然后分别对1-5号果园中的试验柑橘树进行喷施处理，同时作为空白对照组，不对第6号果园中的试验柑橘树喷施任何农药。在柑橘溃疡病发病初期进行第一次施药，第一次施药结束7天后进行第二次施药，每次施药时枯草芽孢杆菌可湿粉剂用量为0.5g/株。
21.分别于施药前和第二次施药后3d，7d，14d，21d和28d调查防治效果，每株按东，西，南，北，中五点取样，每点调查10个果及两个叶梢上的全部叶片，记录总叶(果)数，各级病叶(果)数，叶(果)危害等级，并计算病情指数和防治效果，记录和计算方式及计算结果如下：叶(果)危害分级方法：0级：无病；1级：每个叶(果)有病斑1-5个；3级：每个叶(果)有病斑6-10个；5级：每个叶(果)有病斑11-15个；7级：每个叶(果)有病斑16-20个；9级：每个叶(果)有病斑21个以上；病情指数＝{[∑(各级病果数
×
相应级数值)]/调查总果数
×
9}
×
100；防治效果(%)＝[1-(空白对照组药前病情指数
×
喷施处理后病情指数)/(空白对照组药后病情指数
×
喷施处理前病情指数)]
×
100；
[0022]
由上述结果可以看出，实施例1-3和对比例2制备的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的起效快，对比例1制备的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的起效慢，说明本发明通对干粉进行包覆，不仅不会影响枯草芽孢杆菌的释放，还能够起到固定和促进释放的作用。
[0023]
试验例3在广西南宁市武鸣区仙湖镇那溪村选取在低洼、潮湿、密闭、管理粗放的历年溃疡病发较重的6个果园用于试验，分别标为1-6号果园，保证每个果园中的柑橘树的树种、树龄、长势及水肥管理等条件一致，每个果园随机选择50棵柑橘树作为试验柑橘树。
[0024]
分别将实施例1-3和对比例1-2制备的枯草芽孢杆菌可湿粉剂在常温（23
±
2℃）下贮存12个月后再稀释成1000倍液，然后分别对1-5号果园中的试验柑橘树进行喷施处理，同时作为空白对照组，不对第6号果园中的试验柑橘树喷施任何农药。在柑橘溃疡病发病初期进行第一次施药，第一次施药结束7天后进行第二次施药，每次施药时枯草芽孢杆菌可湿粉剂用量为0.5g/株。
[0025]
分别于施药前和第二次施药后3d，7d，14d，21d和28d调查防治效果，每株按东，西，南，北，中五点取样，每点调查10个果及两个叶梢上的全部叶片，记录总叶(果)数，各级病叶(果)数，叶(果)危害等级，并计算病情指数和防治效果，记录和计算方式及计算结果如下：叶(果)危害分级方法：0级：无病；1级：每个叶(果)有病斑1-5个；3级：每个叶(果)有病斑6-10个；5级：每个叶(果)有病斑11-15个；7级：每个叶(果)有病斑16-20个；9级：每个
叶(果)有病斑21个以上；病情指数＝{[∑(各级病果数
×
相应级数值)]/调查总果数
×
9}
×
100；防治效果(%)＝[1-(空白对照组药前病情指数
×
喷施处理后病情指数)/(空白对照组药后病情指数
×
喷施处理前病情指数)]
×
100；
[0026]
由上述结果可以看出，实施例1-3制备的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的产品保质期长，在常温下贮存12个月后仍然能够起到较好的防治柑橘溃疡病的效果，而对比例1和对比例2制备的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的防治效果与试验例2相比，下降较大，结合试验例1的结果，也说明了虽然对比例1在常温下贮存12个月后润湿时间和悬浮率不大，但是枯草芽孢杆菌的菌活性下降比较大；因此，通过在二次混合步骤中加入微囊化颗粒和对干粉进行包覆均能够延长制备的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的保质期。
[0027]
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
[0028]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：菌种活化、一级种子液制备、二级种子液制备、发酵培养、真空喷雾干燥、干粉包覆、混合；所述干粉包覆的方法为，将干粉与包覆剂加入球磨机中进行球磨，球磨结束得到包覆后的干粉；所述包覆剂的组成，按重量份计，由以下组成：10-12份硅藻土，6-7份预糊化淀粉，2-3份羟丙基甲基纤维素，1-2份阳离子聚丙烯酰胺，0.1-0.2份铝酸酯偶联剂dl-411；所述混合的方法为，将包覆后的干粉、膨润土、白炭黑、聚乙烯吡咯烷酮、六偏磷酸钠、二丁基萘磺酸钠、微囊化颗粒、扩散剂nnf混合均匀后得到初级可湿粉剂；所述微囊化颗粒的制备方法为：将海藻多糖、海藻酸钠、十二烷基苯磺酸钠、去离子水混合后加热至40-45℃后进行搅拌，然后加入环糊精、羧甲基纤维素钠、乙二胺四乙酸二钠，继续搅拌后进行高压均质，高压均质结束得到微囊化颗粒液，将微囊化颗粒液进行喷雾干燥，喷雾干燥结束得到微囊化颗粒；所述枯草芽孢杆菌的分类命名为：枯草芽孢杆菌bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月26日，保藏编号为cgmcc no.24778。2.根据权利要求1所述的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，其特征在于，所述菌种活化的方法为，将保存的枯草芽孢杆菌菌株接种于lb固体培养基上，于32-34℃下培养30-32h；挑取单菌落转接到lb斜面培养基上，于34-36℃培养18-20h，用无菌水清洗培养基表面菌体，得到接种液。3.根据权利要求1所述的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，其特征在于，所述一级种子液制备的方法为，按照体积百分比为8-10%的接种量向lb种子培养基中接入接种液，控制转速为210-230rpm，温度为32-34℃，摇床培养18-20h后，得到一级种子液。4.根据权利要求1所述的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，其特征在于，所述二级种子液制备的方法为，按照体积百分比2-4%的接种量向种子培养基中接入一级种子液，控制通气量为1-1.2v／v
·
min，搅拌速度为220-240rpm，培养时间为18-20h，培养结束得到二级种子液；所述种子培养基的组成，按重量份计，由以下组成：2-2.5份葡萄糖，1.5-1.8份蛋白胨，0.8-1份酵母粉，0.6-0.8份牛肉膏，0.5-0.6份氯化钠，93.3-94.6份去离子水。5.根据权利要求1所述的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的方法为，按照体积百分比为8-10%的接种量向发酵培养基中接入二级种子液，控制通气量为1-1.2v／v
·
min，搅拌速度为220-240rpm，培养时间为28-30h，得到菌株发酵液；所述发酵培养基的组成，按重量份计，由以下组成：5-6份葡萄糖，1.5-2份蛋白胨，0.06-0.08份酵母粉，0.2-0.4份蛋白胨，1-1.2份豆粕粉，0.03-0.05份硫酸镁，0.03-0.05份硫酸锰，0.04-0.06份麦芽糊精，90.22-92.18份去离子水。6.根据权利要求1所述的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，其特征在于，所述真空喷雾干燥的方法为，将菌株发酵液进行真空喷雾干燥，真空喷雾干燥结束
得到干粉；所述真空喷雾干燥中，真空喷雾干燥时的真空度为0.06-0.07mpa，进风温度为110-115℃，出风温度为60-65℃。7.根据权利要求1所述的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，其特征在于，所述干粉包覆中，控制球磨时的球料比为10-15:1，球磨转速为300-350rpm，球磨温度为25-30℃，球磨时间为20-25min；所述干粉包覆中，干粉与包覆剂的重量比为1:1.3-1.5；所述阳离子聚丙烯酰胺的分子量为300-400万，离子度为10-20%。8.根据权利要求1所述的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，其特征在于，所述混合中，包覆后的干粉、改性膨润土、改性白炭黑、聚乙烯吡咯烷酮、六偏磷酸钠、二丁基萘磺酸钠、微囊化颗粒、扩散剂nnf的重量比为25-30:10-12:13-16:3-5:2-3:2-4:3-4:0.4-0.6。9.根据权利要求8所述的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，其特征在于，所述微囊化颗粒的制备中，高压均质时的压力为40-50mpa，次数为3-5次，每次高压均质的时间为10-12min；喷雾干燥时的进风温度为130-140℃，出风温度为50-60℃。10.根据权利要求9所述的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，其特征在于，所述微囊化颗粒的制备中，海藻多糖、海藻酸钠、十二烷基苯磺酸钠、去离子水、环糊精、羧甲基纤维素钠、乙二胺四乙酸二钠的重量比为30-35:20-25:15-18:110-120:25-30:20-23:3-5。

技术总结
本发明公开了一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，属于微生物菌剂技术领域，所述制备方法由以下步骤组成：菌种活化、一级种子液制备、二级种子液制备、发酵培养、真空喷雾干燥、干粉包覆、混合；所述干粉包覆的方法为，将干粉与包覆剂加入球磨机中进行球磨，球磨结束得到包覆后的干粉；所述包覆剂的组成，按重量份计，由以下组成：10-12份硅藻土，6-7份预糊化淀粉，2-3份羟丙基甲基纤维素，1-2份阳离子聚丙烯酰胺，0.1-0.2份铝酸酯偶联剂DL-411；本发明能够在实现起效快、产品稳定性高、产品保质期长的同时，提高枯草芽孢杆菌可湿粉剂的悬浮率、润湿性。润湿性。


技术研发人员：郭中信 李达 王茂超 郭婧 田雪玉 李超
受保护的技术使用者：山东京青农业科技有限公司
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/7/7