陆地棉GhISR43基因、其编码蛋白及其在调控植物耐盐胁迫中的应用

陆地棉ghisr43基因、其编码蛋白及其在调控植物耐盐胁迫中的应用
技术领域
1.本发明涉及从棉花分离的基因及其应用，尤其涉及从陆地棉分离的调控盐胁迫性能的ghisr43基因及其编码蛋白，本发明进一步涉及陆地棉ghisr43基因及其编码蛋白在调控植物耐盐胁迫性能中的应用，属于调控植物耐盐胁迫基因及其应用领域。


背景技术：

2.土壤盐渍化是限制农业生产的全球性非生物胁迫之一,直接影响着作物的正常生长、导致减产,严重威胁着农业生产。据统计，目前世界范围内约有8亿公顷土地(相当于世界总土地面积的6.5％)受到高盐浓度的影响。其中中国盐渍土总面积达9,913
×
104hm2，约占国土面积的10％,主要分布于西北、华北、东北及沿海地区。中国盐碱地绝大部分处于荒芜状态，可作为中国农业生产巨大的后备土地资源，但有效开发利用盐碱地、发展农业生产进展缓慢。
3.棉花(耐盐阈值7.7ds m-1
)是重要的经济作物、也是盐碱地种植的“先锋作物”，较主要的粮食作物如玉米(1.7ds m-1
)、水稻(3.0ds m-1
)和小麦(6.0ds m-1
)等具有更高的耐盐性。挖掘棉花耐盐基因、解析耐盐机制对改良作物耐盐性、发展盐碱地农业生产、保障农业安全意义重大。在不同生长发育时期，棉花的耐盐性具有很大差异。研究表明，种子萌发期和苗期是棉花对盐胁迫最为敏感的时期。盐胁迫下，苗期棉株生长受到抑制、通常地上部会出现茎部变细变软、叶面皱褶等表型。长期、高盐胁迫还会严重影响植株的呼吸、光合作用，阻碍棉花对营养元素的吸收，叶片的氮含量减少。但相对于敏盐品种，耐盐品种的苗期影响较小。因此挖掘耐盐棉花品种苗期耐盐基因、解析耐盐功能在改良作物耐盐性研究中更具理论和应用价值。此外，也对高效利用盐碱地发展农业生产、解决“粮棉争地”矛盾、保障中国农业安全意义重大。
4.作物的耐盐性是非常复杂的性状，杂交育种等常规育种方法在改良作物耐盐性方面进展缓慢，不能满足生产的急切需求。而利用生物技术手段发掘耐盐作物棉花的耐盐基因，探索、解析其耐盐机制，对于培育耐盐作物新品种、科学利用盐碱地发展农业生产具有极其重要的理论价值和应用前景。
5.ghisr43基因(gh_d11g0177)是一个新的、在植物界尚未有功能报道的基因。其基因长度480bp，编码159个氨基酸。目前该基因及其同源基因在植物界尚未有任何功能描述，在ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)也没有保守域等结构信息。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一是提供从棉花中分离的调控植物耐盐胁迫性能的ghisr43基因；
7.本发明的目的之二是提供含有所述调控植物耐盐胁迫的ghisr43基因的表达盒或重组表达载体；
8.本发明的目的之三将所述的调控植物耐盐胁迫的ghisr43基因应用于提高作物耐盐胁迫抗性或培育耐盐胁迫植物品种。
9.本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
10.本发明的一方面是提供了从棉花中分离的调控植物耐盐胁迫的ghisr43基因，其中，所述的ghisr43基因的多核苷酸序列选自(a)-(e)中的任何一种：
11.(a)seq id no.1所示的多核苷酸序列；
12.(b)编码seq id no.2所示氨基酸序列的多核苷酸序列；
13.(c)在严谨杂交条件下能够与(a)或(b)中所述多核苷酸序列进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸序列仍具有调控植物耐盐胁迫的功能；
14.(d)与(a)-(c)任何一种所示的多核苷酸序列至少有80％或以上相似性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列仍具有调控植物耐盐胁迫的功能；优选的，与(a)-(c)任何一种所示的多核苷酸序列至少有85％或以上相似性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列仍具有植物耐盐胁迫的功能；更优选的，与(a)-(c)任何一种所示的多核苷酸序列至少有90％或以上相似性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列仍具有植物耐盐胁迫的功能；最优选的，与(a)-(c)任何一种所示的多核苷酸序列至少有95％或以上相似性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列仍具有植物耐盐胁迫的功能；
15.(e)与(a)-(d)中任何一项所述的多核苷酸序列能够互补的多核苷酸序列。
16.本技术中所述的序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括myers和miller算法、needleman-wunsch全局比对法、smith-waterman局部比对法、pearson和lipman相似性搜索法、karlin和altschul的算法，这对于本领域技术人员来说是公知的。
17.本发明还提供了所述调控植物耐盐胁迫性能的ghisr43基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为seq id no.2所示。
18.本发明的另一方面是进一步提供了含有所述ghisr43基因的表达盒、重组载体或重组宿主细胞；优选的，所述的表达盒、重组载体或重组宿主细胞是重组真核表达盒、重组真核表达载体或重组植物细胞；更优选的，所述重组真核表达盒或重组真核表达载体为重组植物表达盒或重组植物表达载体。
19.本发明的再一方面是提供了一种提高棉花耐盐胁迫的方法，包括：使棉花中ghisr43基因产生突变使ghisr43基因的正常功能产生缺陷；或者干扰ghisr43基因的正常表达或正常功能。
20.所述突变包括在ghisr43基因或其启动子的核苷酸序列上进行一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加。具体地，所述突变可以通过物理诱变、化学诱变、基因编辑的方式获得。物理诱变包括但不限于辐射诱变、太空育种等；化学诱变的方法包括用ems等诱变剂处理所导致的诱变；所述基因编辑的方法包括但不限于zfn、talen和/或crispr/cas等。
21.本领域技术人员知悉，crispr/cas基因编辑系统或基因编辑方法的主要原理是通过一个叫向导rna(guide-rna，grna)的核酸片段在宿主基因组找到要进行基因编辑的位置，也就是靶向dna序列，然后通过cas蛋白对dna进行切割。在本技术中，所述cas蛋白包括但不限于cas9、cas12、cas12a、cas12j、cas12e、cas13和/或cas14等蛋白。
22.所述干扰ghisr43基因或启动子的正常表达或正常的功能可以采用rna干扰技术
(rnai)干扰ghisr43基因或其启动子的正常表达或使其正常功能产生缺陷，rna干扰技术为本领域常规技术，其通过21-23bp的短链双链rna(sirna；smallinterfering rna)或者是长链双链rna(dsrna；double-strand rna)与目的基因表达的mrna同源区进行特异性结合，使mrna降解，达到抑制基因表达的作用。
23.本发明进一步提供了一种降低植物耐盐胁迫的方法，包括：将ghisr43基因在植物中进行过表达得到转基因植物；所得到的转基因植物对于盐胁迫的抗性降低；譬如：将ghisr43基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5
′
端非编码区，ghisr43基因和3
′
非编码区组成；其中，所述的5
′
端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3
′
非编码区可以包含终止子序列、mrna切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。
24.将所述重组植物表达载体转化目标植物，使ghisr43基因在植物中进行过表达。
25.所述的目标植物包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物；更优选的，所述的目标植物包括农作物、蔬菜或观赏植物、果树等，例如，可以是棉花、拟南芥、玉米、水稻、高粱、小麦、大豆、马铃薯、大麦、番茄、菜豆、花生或甘蔗等，最优选为棉花或拟南芥。
26.转化方案以及将所述基因(或多核苷酸)引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述基因(或核苷酸)多引入植物细胞的合适方法包括：通过使用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(weissbach，1998method for plant molecular biology viii，academy press，new york，第411-463页；geiserson和corey，1998，plant molecular biology，2
nd edition)。
27.本发明还提供了一种非作为繁殖材料的植物细胞、组织、器官或产品，所述植物细胞、组织、器官或产品含有本技术所述的调控植物耐盐性能的ghisr43基因或其突变体序列。
28.本发明所提供的ghisr43基因或其突变体等能够调控作物的耐盐胁迫性能，且其他农艺性状无不良影响，在提高植物耐盐胁迫性能或培育耐盐胁迫棉花品种等方面具有应用前景。
29.本发明所涉及到的术语定义
30.除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
31.术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括pna(肽核酸)、在反义技术中所用的dna类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。
32.术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。
33.术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。
34.术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。
35.术语“重组植物表达载体”意指一种或多种用于实现植物转化的dna载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤农杆菌介导转化的。二元载体通常包括：t-dna转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性dna序列等。
36.术语“转化”指将异源性dna序列引入到宿主细胞或有机体的方法。术语“表达”指内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。
附图说明
37.图1为ghisr43亚细胞定位结果；注：bars＝20μm。
38.图2为ghisr43基因沉默重组质粒的获得与鉴定结果；a：目的基因扩增，其中m：dl2000 dna marker；lines1-7：农大棉13号中扩增ghisr43b：ghisr43-ptrv2重组质粒菌液pcr检测，其中m：dl2000 dna marker；lines1-11：重组质粒菌液pcr。
39.图3为ghisr43基因沉默效率的检测结果；a：沉默cla1基因后叶片出现白化；b：real-time实时定量pcr检测ghisr43沉默效率。
40.图4为ghisr43基因在棉花苗期耐盐功能验证结果；a：沉默cla1基因后白化植株；b：vigs沉默ghisr43基因后盐胁迫0h时表型；c：vigs沉默ghisr43基因后盐胁迫5h时表型；注：ck为对照组，gh_d11g0177(ghisr43)为沉默组。
41.图5为转ghisr43基因的拟南芥阳性苗鉴定结果；
42.a为转ghisr43拟南芥阳性苗筛选结果，其中：m：dna marker dl2000；泳道1-泳道6：转ghisr43拟南芥阳性苗筛选；泳道7：35s-pgreen-ghisr43-6ha质粒阳性对照；
43.b为实时荧光定量分析结果，*表示差异在p《0.05水平上具有显著性；
44.c为转ghisr43基因拟南芥western blot结果，其中：m：180kd蛋白质marker；泳道1：野生型；泳道2-泳道7：转ghisr43基因拟南芥western blot结果。
45.图6为转ghisr43基因的拟南芥苗期耐盐性鉴定结果；a：非盐胁迫7天不同株系生长情况；b：150mm nacl胁迫7天后不同株系耐盐性鉴定；wt：野生型；ox：超表达株系；c：非盐胁迫7天不同株系萌发率统计；d：150mm nacl胁迫7天后不同株系萌发率统计。
具体实施方式
46.以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
47.实施例1陆地棉ghisr43基因的发现及在不同耐盐性棉花品种中的差异表达
48.通过在150mm nacl胁迫下，利用itraq技术对三个耐盐品种组(农大棉13号、鄂棉9号和鄂抗棉3号，相对成活苗率分别为56.7％、73.3％和50.9％)和三个盐敏感品种组(晋棉12、鲁棉14和中078，相对成活苗率分别为34.04％、32.95％和33.30％)的三叶期幼苗，进行胁迫处理0h、0.5h和5h后的根组织蛋白组测序，结果显示gh_d11g0177(ghisr43)在胁迫处理0.5h和5h后存在差异表达(表1)。
49.表1盐胁迫下不同耐盐性品种中ghisr43的表达量
[0050][0051]
注：耐盐品种组：a:农大棉13号，b:鄂棉9号，c:鄂抗棉3号；盐敏感品种组：d：晋棉12，e：鲁棉14，f：中078。
[0052]
实施例2陆地棉ghisr43的亚细胞定位
[0053]
1实验方法
[0054]
1.1准备样品
[0055]
将农大棉13号进行棉苗培养，待棉花幼苗长到三叶期时，取根组织。全部根组织在研钵中用液氮充分研磨至粉末状后分装保存在-80℃超低温冰箱备用。
[0056]
1.2rna提取
[0057]
按照天根生化科技(北京)有限公司的多糖多酚植物总rna提取试剂盒(货号dp441)说明书进行操作。
[0058]
1.3cdna的合成
[0059]
利用反转录试剂盒将rna反转录成cdna，具体步骤如下：
[0060]
rna
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μg
[0061]
4x gdna wiper mix
ꢀꢀꢀꢀꢀ
4μl
[0062]
rnase-free ddh2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
to 16μl
[0063]
混匀后42℃反应2min；在以上反应管中再加入4μl 5xhiscriptⅲqrt supermix，混匀后37℃反应15min，85℃反应5s。
[0064]
1.4ghisr43基因全长orf的获得
[0065]
基于陆地棉基因组数据库中得到的ghisr43基因序列设计ghisr43基因全长特异性扩增引物，如表2所示。
[0066]
表2ghisr43基因克隆pcr引物
[0067][0068]
利用农大棉13号根组织rna反转录获得的cdna，扩增ghisr43基因。pcr扩增体系
(20μl)为：cdna 1μl，ghisr43-f 1μl，ghisr43-r1μl，max dna polymerase 10μl，灭菌蒸馏水7μl。扩增步骤为：预变性95℃5min；95℃10s，58℃15s，72℃10s，34个循环；充分延伸72℃7min。用1.2％的琼脂糖凝胶检测扩增结果，根据柱型dna凝胶回收试剂盒(上海生工科技有限公司)的说明对条带大小正确的目的片段进行琼脂糖凝胶回收。将回收条带与pmd18-t载体连接，然后用热激法将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中。
[0069]
1.5ghisr43-35s-pgreen-gfp重组载体的构建
[0070]
构建ghisr43基因的含有35s强启动子，绿色荧光蛋白标签的超表达载体35s-pgreen-gfp并转化农杆菌，待烟草长至4～5片真叶时进行亚细胞定位。50ml烟草介质缓冲液配制包括0.097g mes、0.1016gmgcl2·
h2o和50μl as(100μm)，其余用蒸馏水补齐。具体操作步骤如下：
[0071]
(1)28℃，180rpm培养农杆菌直至od
600
在1.2左右时取出，5000rpm，离心10min；
[0072]
(2)弃上清，用灭菌蒸馏水重悬菌体沉淀2～3次；
[0073]
(3)用缓冲液重悬菌体，调整至od
600
≈1.0，室温静置3h。
[0074]
(4)使用1ml注射器，将(3)中的液体从烟草叶片背面轻轻注射，至液体充满叶片背面，半黑暗培养；
[0075]
(5)培养至少48h，剪取注射后的烟草叶片下表皮，使用共聚焦荧光显微镜(olympus，fv10i)进行观察并拍照保存结果，使用绿色荧光的激发波长为489nm，发射波长为510nm。
[0076]
2.实验结果
[0077]
亚细胞定位结果表明ghisr43定位于细胞膜和细胞质中(图1)。
[0078]
实验例1沉默ghisr43提高棉苗植株的耐盐性实验
[0079]
1实验方法
[0080]
1.1vigs载体构建及农杆菌转化
[0081]
1.1.1ghisr43基因全长orf的获得
[0082]
ghisr43基因的扩增同实施例2中步骤1.4。
[0083]
1.1.2陆地棉vigs载体构建
[0084]
以构建好的ghisr43-pmd18-t载体为模板，用带有酶切位点ecorⅰ、bamhi的ghisr43基因特异性引物进行扩增(表3)：
[0085]
表3ghisr43基因vigs引物
[0086][0087]
经过琼脂糖凝胶电泳、凝胶回收后获得目的片段，测序正确后将ptrv2空载体、ghisr43-pmd18-t载体同时进行双酶切，将目的基因与ptrv2载体进行连接，将构建好的重组载体通过冻融法转入农杆菌感受态细胞gv3101。
[0088]
1.1.3棉苗培养
[0089]
(1)将农大棉13号种子用浓硫酸脱绒，用清水冲洗干净后晾干，均匀摆放在装有800g干石英砂的发芽盒中，用250g干石英砂覆盖于种子表面，然后均匀浇入蒸馏水250ml，
加盖保湿，置于28℃、12h光照/12h黑暗条件的恒温恒湿培养室中培养，期间不再对其进行任何处理。
[0090]
(2)沙培6-7天后，选取棉壳脱落、子叶平整展开且长势相同的幼苗，使用1/2hoagland营养液进行水培养，置于28℃、12h光照、12h黑暗条件的恒温恒湿培养室中培养。
[0091]
(3)水培1-2天后，待棉苗两片子叶完全展开但未长出第一片真叶时开始注射农杆菌菌液。
[0092]
1.1.4vigs菌液注射
[0093]
vigs菌液培养方法和棉苗注射方法：分别将ghisr43-ptrv2、ptrv192、ptrv2和cla1-ptrv2质粒的农杆菌菌液进行活化，然后将5ml菌液加入到100ml lb液体培养基中，其中含有kan，100mg/l；rif，50mg/l；2-吗啉乙磺酸(2-4-morpholino ethanesulfonic acid，mes)10mmol/l；乙酰丁香酮(acetosyringone，as)20μmol/l，28℃，180rpm震荡过夜培养，培养至菌液od600值达到0.8-1.2时将菌液在5000rpm转速下离心10min，弃上清，并用灭菌的蒸馏水清洗2遍，5000rpm转速下离心10min，弃上清后用缓冲液(mgcl2，10mmol/l；mes，10mmol/l；as，200μmol/l)重悬菌体，使od600值在1.2-1.5之间，室温静置3h。将ghisr43-ptrv2、ptrv2空载体和cla1-ptrv2的缓冲液与ptrv192按照1:1的体积比均匀混合后进行棉苗注射。
[0094]
当棉花幼苗长到三叶期(约16天)时，利用150mmol/l的nacl盐溶液进行盐胁迫处理，分别在胁迫后0h、0.5h和5h三个时间点对棉花根、茎、叶进行取样，在液氮中冷冻后将其放入-80℃保存。
[0095]
1.1.5供试样品rna提取
[0096]
rna提取同实施例2中的步骤1.2。
[0097]
1.1.6cdna的合成
[0098]
使用大连宝生物科技有限公司的primescripttm1st strand cdna synthesis kit(6110a)dna反转录试剂盒进行cdna的合成。
[0099]
1.1.7荧光定量pcr
[0100]
对差异表达的ghisr43基因进行实时定量real-time pcr引物设计，以ghhis3基因作为内参(表4)。使用罗氏lightcycler96实时荧光定量pcr仪进行定量pcr，反应体系为cdna模板1μl，正反向游引物各0.6μl(10μmol/l)，2
×
sybr mix 10μl和灭菌蒸馏水7.8μl。反应程序为95℃30s；95℃5s，56℃20s，72℃30s，40个循环；95℃5s，60℃60s，95℃1s，37℃30s。五次生物学检测重复并计算沉默效率。
[0101]
表4实时定量pcr引物
[0102][0103]
2实验结果
[0104]
2.1vigs重组载体构建
[0105]
盐胁迫5h后，在农大棉13号的cdna中扩增到带有ecori和bamhi酶切位点的ghisr43(图2a)。将扩增得到的目的片段进行测序及与目的基因cds库比对，结果基因序列与目标序列一致，用于vigs载体的构建。将目的基因ghisr43分别与vigs载体ptrv2同时用
ecori和bamhi两种酶进行双酶切、连接，进而获得重组载体ghisr43-ptrv2。重组质粒转化到大肠杆菌后分别经菌液pcr鉴定(图2b)，与预期基因片段大小一致，证明vigs重组质粒构建成功。进一步转化农杆菌感受态gv3101后进行棉花vigs基因沉默试验。
[0106]
2.2ghisr43基因沉默效率检测
[0107]
注射菌液一周后，clai对照植株的真叶出现白化现象(图3a)，选取沉默和对照植株各五棵，提取叶片rna进行real-time实时定量pcr检测ghisr43基因的沉默效率(图3b)，结果表明ghisr43基因被沉默，沉默效率达82.208％，可以对ghisr43基因的苗期耐盐功能进行研究。
[0108]
2.3沉默ghisr43提高棉苗植株的耐盐性
[0109]
待注射vigs菌液的棉苗第三片真叶展平时，对ghisr43-vigs、对照棉苗分别同时进行150mmol/l nacl胁迫处理，记录胁迫0h时沉默组与对照组表型变化(图4b)。在盐胁迫5h时，对照组较沉默ghisr43基因的棉苗茎杆发生明显倒伏(图4c)，出现了明显的棉花苗期盐胁迫反应症状。表明ghisr43在棉花苗期盐胁迫反应中发挥功能，沉默ghisr43基因提高了棉苗对盐胁迫的耐受性。
[0110]
实验例2超表达ghisr43降低拟南芥苗期耐盐性实验
[0111]
1实验方法
[0112]
1.1 35s-pgreen-6ha-ghisr43重组载体的拟南芥遗传转化
[0113]
1.1.1试验材料及培养
[0114]
植物材料：野生型拟南芥播种在32孔育苗盘中并在23℃(光照16小时，黑暗8小时)生长。
[0115]
1.1.2拟南芥遗传转化
[0116]
构建表达载体35s-pgreen-6ha-ghisr43，待拟南芥抽薹开花后进行拟南芥遗传转化，采用沾花法转化拟南芥：
[0117]
(1)复苏农杆菌
[0118]
取-80℃保存的农杆菌菌液于50ml离心管中，10ml lb培养基+10μl卡那霉素+5μl利福平，28℃，180rpm培养过夜。
[0119]
(2)扩大培养
[0120]
在150ml三角瓶中加入50ml带有抗生素的lb，加入500μl的活化的菌液，于28℃，180rpm的摇床里培养。
[0121]
(3)菌液浓度测定
[0122]
将农杆菌摇到od
600
到1.2左右，离心并用灭菌水洗涤2次，加入50ml蔗糖缓冲液并加入7μl表面活化剂。
[0123]
(4)沾花
[0124]
侵染时间为30s，侵染结束后，暗培养24h。一周后再侵染一次。定期浇灌营养液，分多次进行收获成熟的荚果，即为t0代种子。
[0125]
1.1.3拟南芥阳性植株筛选
[0126]
收获t0代转基因拟南芥种子，播种t0代种子，约一周左右，喷施除草剂basta(浓度为0.15％)，培养3天，正常生长的为阳性植株，将阳性苗取拇指大小的叶片进行dna提取，pcr进一步鉴定阳性苗(图5a)，测序结果正确。将阳性植株进行单株收种(t1代)。在32孔育
苗盘中播种阳性系后代种子，培养一周左右喷施除草剂，并单株收t2代种子。每个株系(ox)选择8个单株进行播种，育苗盘中每个孔播种16粒种子播种4个孔，培养一周左右喷施除草剂，观察拟南芥喷施除草剂之后的生存率，将没有死亡的单株(未分离出a)进行取样、rna提取检测基因表达量，收获t3代纯系植株种子。
[0127]
1.1.4转35s-pgreen-6ha-ghisr43的拟南芥鉴定
[0128]
(1)ctab法提取dna。
[0129]
(2)检测引物：
[0130]
引物序列
[0131]
ghisr43-f:gaattcatggctacccacaataacaaca
[0132]
ghisr43-r:ggatcctcaatcatcactttttttgtcc
[0133]
mix：2xes taq mastermix(dye)
[0134]
marker:dl2000 dna marker
[0135]
(3)pcr扩增体系：
[0136][0137]
pcr程序
[0138][0139]
电泳检测
[0140]
凝胶配置：
[0141]
琼脂糖
ꢀꢀꢀꢀꢀ
0.48g
[0142]
1xtae
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
40ml
[0143]
电泳15min。
[0144]
1.1.5转35s-pgreen-6ha-ghisr43拟南芥rt-pcr和western blot检测
[0145]
(1)rna提取同实施例2中的步骤1.2，rt-pcr检测同实验例1中的步骤1.1.7。引物序列如表5：
[0146]
表5转35s-pgreen-6ha-ghisr43拟南芥实时定量引物
[0147][0148]
(2)western blot检测方法：
[0149]
1)12％分离胶的制备
[0150]
架好胶板(使用1mm的玻璃板)，配制12％分离胶(表6)：制胶用4ml，配制6ml。
[0151]
表6分离胶配制
[0152][0153]
用移液器将制备好的分离胶打入玻璃板的缝隙中，最后用ddh2o封住上层放置分离胶变干。
[0154]
2)5％浓缩胶制备
[0155]
等待40min后待分离胶与水有明显分层现象后，把水从缝隙中倒出，并用吸水纸吸干缝隙中的水分，配制5％浓缩胶。制胶用2ml，配制3ml。
[0156]
表7浓缩胶配制
[0157][0158]
将浓缩胶用移液器缓慢加入到玻璃板的缝隙中，此时注意不要产生气泡，加好分离胶后立即插入梳子等待40min让分离胶凝固。
[0159]
3)样品制备与电泳
[0160]
将转ghisr43拟南芥和野生型拟南芥取样并液氮研磨至粉末状，添加适量的植物蛋白提取液(康为世纪生物科技有限公司；货号：cw0885)震荡混匀后置于冰上30min，结束后12000rpm，4℃离心10min，取适量上清液加入sds-page上样缓冲液(康为世纪生物科技有限公司；货号：cw0027)于100℃沸水中20min进行蛋白质变性。待胶凝固后进行点样，点样完成后80v恒压电泳至溴酚蓝跑过浓缩胶，换120v恒压电泳至结束(溴酚蓝指示带至胶板底层或刚刚出胶)。
[0161]
4)western blot
[0162]
(a)将电泳结束的凝胶放置于大小相同的硝酸纤维素膜上，并用转膜夹固定置于转膜电泳槽中，30v恒压电泳2h。
[0163]
(b)将转膜结束的硝酸纤维素膜置于5％的牛奶(2.5g脱脂奶粉+50ml水；货号：lp0031b)中于37℃摇床50rpm封闭1h。
[0164]
(c)将封闭好的硝酸纤维素膜置于一抗溶液(10ml脱脂奶粉+5μl一抗(博鳌龙；货号b1023)37℃摇床50rpm结合2h。
[0165]
(d)将结合好的硝酸纤维素膜置于洗膜缓冲液中(100ml pbs(索莱宝；货号：p1020)+500μl tween-20(索莱宝；货号：t8220)室温洗涤3次，每次15min。
[0166]
(e)将洗涤好的硝酸纤维素膜置于二抗溶液(10ml pbs+2μl二抗(博鳌龙；货号：bf03001x)37℃摇床50rpm结合2h。
[0167]
(f)洗膜同步骤(4)
[0168]
(g)照胶
[0169]
根据上海雅酶生物医药科技有限公司omni-ecltm基础型化学发光检测试剂盒货号：sq202)进行发光检测并拍照。
[0170]
(3)ghisr43基因表达产物检测结果
[0171]
进一步对t3代转ghisr43基因拟南芥株系进行rna和蛋白质提取，进行qrt-pcr(图5b)和western blot(图5c)检测，结果显示ghisr43基因已经成功转入拟南芥并稳定表达，根据qrt-pcr和western blot结果进一步筛择ox1、ox2和ox4三个转ghisr43基因拟南芥阳性株系进行后续盐胁迫试验。
[0172]
1.2转基因拟南芥种子的种植以及成苗率测定
[0173]
1.2.1材料
[0174]
转基因拟南芥t3代种子、野生型拟南芥种子、ms培养基粉末、琼脂粉、氯化钠、一次性培养皿、70％酒精、30％次氯酸钠、2.0ml离心管、离心机、超净工作台。
[0175]
1.2.2种植方法
[0176]
随机选取3个转ghisr43基因超表达拟南芥t3代株系(ox1、ox2和ox4)，将阳性株系种子和野生型拟南芥种子经表面(70％乙醇，30秒；无菌水冲洗4次)和深层(30﹪次氯酸钠，10分钟；无菌水3次)消毒后，播于含150mm nacl和不含nacl的1/2ms固体培养基上，每个区域37粒拟南芥种子，播种结束后4℃放置72h，然后转入22℃培养。统计不同株系的种子萌发、成苗情况并记录数据，一周后进行数据分析，5次重复。
[0177]
1.2.3分析与作图方法
[0178]
采用origin 2021软件进行数据分析与作图，显著性分析采用单因素方差分析。
[0179]
2实验结果
[0180]
实验结果显示，转基因拟南芥株系和野生型拟南芥株系在不含有氯化钠的培养基上的萌发、成苗率没有显著差异，pr(》f)＝0.55(图6a，图6c)。而在含有150mm nacl的培养基，转基因拟南芥株系的萌发率显著低于野生型拟南芥株系(图6b，图6d)，组间差异显著性分析获得pr(》f)＝7.06*10-8
，表明在盐胁迫下过表达ghisr43基因能降低拟南芥的耐盐性。

技术特征：
1.从棉花中分离的调控植物耐盐胁迫性能的ghisr43基因，其特征在于，所述的ghisr43基因的多核苷酸序列选自(a)-(e)中的任何一种：(a)seq id no.1所示的多核苷酸序列；(b)编码seq id no.2所示氨基酸序列的多核苷酸序列；(c)在严谨杂交条件下能够与(a)或(b)中所述多核苷酸序列进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸序列仍具有调控植物耐盐胁迫的功能；(d)与(a)-(c)任何一种所示的多核苷酸序列至少有80％或以上相似性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列仍具有调控植物耐盐胁迫的功能；优选的，与(a)-(c)任何一种所示的多核苷酸序列至少有85％或以上相似性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列仍具有调控植物耐盐胁迫的功能；更优选的，与(a)-(c)任何一种所示的多核苷酸序列至少有90％或以上相似性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列仍具有植物耐盐胁迫的功能；最优选的，与(a)-(c)任何一种所示的多核苷酸序列至少有95％或以上相似性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列仍具有植物耐盐胁迫的功能；(e)与(a)-(d)中任何一项所述的多核苷酸序列能够互补的多核苷酸序列。2.权利要求1所述的ghisr43基因所编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为seq id no.2所示。3.含有权利要求1所述ghisr43基因的表达盒、重组表达载体或重组宿主细胞。4.根据权利要求3所述的表达盒、重组表达载体或重组宿主细胞，其特征在于，所述的表达盒、重组表达载体或重组宿主细胞是重组真核表达盒、重组真核表达载体或重组植物细胞；优选的，所述重组真核表达盒或重组真核表达载体为重组植物表达盒或重组植物表达载体。5.权利要求1所述的ghisr43基因在调控植物耐盐胁迫性能中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的调控植物耐盐胁迫性能是提高棉花耐盐胁迫抗性，包括：使棉花中ghisr43基因产生突变使ghisr43基因的正常功能产生缺陷；或者干扰棉花中ghisr43基因的正常表达或正常功能。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的调控植物耐盐胁迫性能是降低植物耐盐胁迫抗性，包括：将ghisr43基因在植物中进行过表达得到转基因植物；所得到的转基因植物对于盐胁迫的抗性降低。8.权利要求2所述的蛋白在调控植物耐盐胁迫性能中的应用。9.权利要求3所述的表达盒、重组表达载体或重组宿主细胞在调控植物耐盐胁迫性能中的应用。10.根据权利要求7-9任何一项所述的应用，其特征在于，所述的植物包括单子叶植物或双子叶植物；优选的，所述的植物是棉花或拟南芥。

技术总结
本发明公开了陆地棉GhISR43基因、其编码蛋白及其在调控植物耐盐胁迫中的应用。本发明提供了从棉花中分离的调控植物耐盐胁迫性能的GhISR43基因，其多核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明提供了含有所述基因的表达盒、重组表达载体或重组宿主细胞。本发明还提供了所述GhISR43基因在调控植物耐盐胁迫性能中的应用，包括：通过使棉花中GhISR43基因产生突变使该基因的正常功能产生缺陷或者干扰棉花中GhISR43基因的正常表达或正常功能提高棉花耐盐胁迫性能；或者将GhISR43基因在植物中过表达得到转基因植物降低植物耐盐胁迫性能。达得到转基因植物降低植物耐盐胁迫性能。达得到转基因植物降低植物耐盐胁迫性能。


技术研发人员：李志坤 田嘉豪 魏警坤
受保护的技术使用者：河北农业大学
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/7/7