一种包含IL-12和抗CD20抗体的融合蛋白及其应用的制作方法

一种包含il-12和抗cd20抗体的融合蛋白及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种包含il-12或其变体和抗cd20抗体的新型融合蛋白，以及包含所述融合蛋白的用于治疗癌症的药物组合物。


背景技术：

2.白细胞介素-12(il-12)是一种具有代表性的炎性细胞因子，在有效诱导细胞免疫应答中起着至关重要的作用。il-12是一种异二聚体蛋白，其包含通过二硫键连接的40kda(p40)和35kda(p35)亚基，由活化的巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和活化的b淋巴细胞产生。il-12可增强辅助性t细胞1(t-helper 1cell)的免疫，增加细胞t淋巴细胞的细胞毒性，并抑制血管生成。一般来说，il-12激活t细胞和nk细胞中ifn-γ的产生。
3.il-12的局部表达使肿瘤细胞对t细胞介导的细胞毒性敏感，导致肿瘤生长抑制和体液免疫的建立。然而，il-12临床应用的缺点是，给药后可能发生全身性的细胞因子相关的毒性。这些临床结果表明，il-12作为治疗癌症的单一药物的局限性。
4.此外，cd20是一种疏水跨膜蛋白，分子量约为35kda，其位于未成熟b(pre-b)淋巴细胞和成熟b淋巴细胞上，并且在b细胞非霍奇金淋巴瘤(nhl)中的表达超过90％。然而，在造血干细胞、正常浆细胞或其他正常组织中并没有发现cd20。利妥昔单抗是一种针对人cd20抗原的抗体，已用于治疗患有b细胞非霍奇金淋巴瘤的患者，该抗体在美国专利第5776456号中被称为“c2b8”。尽管c2b8等抗体取得了成功，但仍然需要具有改进特性的抗cd20抗体。


技术实现要素：

5.技术问题
6.因此，本发明人已经研究开发出一种具有抗癌作用的新型融合蛋白。结果，本发明人发现包含il-12和抗cd20抗体的融合蛋白提高了抗癌活性，同时降低全身性毒性，从而完成了本发明。
7.问题的解决方案
8.在本发明的一个方面，提供了一种融合蛋白，其包括包含il-12或其变体的第一单体；和包含特异性结合cd20的抗原结合位点的第二单体。
9.在本发明的另一方面，提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含所述融合蛋白作为活性成分。
10.在本发明的另一方面，提供了一种编码所述第一单体的多核苷酸。
11.在本发明的另一方面，提供了一种编码所述第二单体的多核苷酸。
12.在本发明的另一方面，提供了一种包含所述多核苷酸的载体。
13.在本发明的另一方面，提供了一种引入了所述载体的转化细胞。
14.在本发明的另一方面，提供了一种产生融合蛋白的方法，其包括：i)培养所述转化细胞；和ii)回收包含所述第一单体和所述第二单体的融合蛋白。
15.在本发明的又一方面，提供了一种治疗或预防癌症的方法，其包括向受试者施用一种融合蛋白，所述融合蛋白包括包含il-12或其变体的第一单体，和包含特异性结合cd20的抗原结合位点的第二单体。
16.在本发明的又一方面，提供了一种融合蛋白在治疗癌症中的应用，所述融合蛋白包括包含il-12或其变体的第一单体和包含特异性结合cd20的抗原结合位点的第二单体。
17.在本发明的又一方面，提供了一种融合蛋白在制备用于治疗癌症的药物中的应用，所述融合蛋白包括包含il-12或其变体的第一单体和包含特异性结合cd20的抗原结合位点的第二单体。
18.发明效果
19.包含il-12和特异性结合cd20的抗原结合位点的融合蛋白可通过il-12表现出抗癌作用。此外，还发现，当抗cd20抗体在一种抗体中实施时，il-12在肿瘤中特异性积累，从而降低全身性毒性并表现出肿瘤特异性抗癌作用。也就是说，通过靶向肿瘤中高特异性表达的cd20将il-12特异性定位到肿瘤部位，从而有效地治疗癌症。
附图说明
20.图1示出了根据一个实施方案，通过sds-page鉴定t2.01、t2.02、t2.03、t2.04、t2.05、t2.06和t2.07而获得的结果。
21.图2示出了根据一个实施方案，通过sds-page鉴定t2.08、t2.09、t2.10、t2.11、t2.12和t2.13而获得的结果。
22.图3示出了根据一个实施方案，通过sds-page鉴定t2.14、t2.15、t2.16、t2.17和利妥昔单抗而获得的结果。
23.图4示出了根据一个实施方案，通过sds-page鉴定t2.01m、t2.02m、t2.03m、t2.04m、t2.05m、t2.06m和t2.07m而获得的结果。
24.图5示出了根据一个实施方案，通过sds-page鉴定t2.08m、t2.09m、t2.10m、t2.11m、t2.12m和t2.13m而获得的结果。
25.图6示出了根据一个实施方案，通过sds-page鉴定t2.15m、t2.16m、t2.17m和18b12而获得的结果。
26.图7示出了通过表面等离子体共振分析方法显示t2.01和t2.02与重组人cd20(rhcd20)的结合亲和力的图。
27.图8示出了通过流式细胞术显示利妥昔单抗、t2.01和t2.02与raji细胞、ramos细胞和jurkat细胞的结合亲和力的图。
28.图9示出了通过流式细胞术显示18b12、t2.01m和t2.02m与a20细胞的结合亲和力的图。
29.图10示出了通过酶联免疫吸附测定显示利妥昔单抗、t2.01和t2.02与il-12受体β1的结合亲和力的图。
30.图11示出了通过adcc报告基因分析显示利妥昔单抗、t2.01、t2.02和t2.12的抗体依赖性细胞毒性的图。
31.图12示出了通过hekblue报告细胞中的吸光度检测t2.01m、t2.02m、t2.03m和18b12的il-12活性而获得的结果的图。
32.图13示出了通过人t细胞的信号传导能力显示t2.01、t2.02和t2.17的il-12活性的图。
33.图14示出了通过利妥昔单抗、t2.01、t2.02和t2.03测量人t细胞分泌细胞因子ifn-γ的能力而获得的结果的图。
34.图15示出了通过酶联免疫吸附测定显示利妥昔单抗、t2.01和t2.02在混合淋巴细胞反应时分泌ifn-γ的能力的图。
35.图16示出了在植入a20细胞的小鼠模型中用每种浓度t2.01m、t2.02m和化疗治疗后，测量每只小鼠肿瘤大小变化的蜘蛛图。
36.图17示出了在植入a20细胞的小鼠模型中用t2.01m、t2.02m和化疗治疗后，通过测量肿瘤大小变化而获得的结果的图。
37.图18示出了通过测量小鼠重量而获得的结果的图，以确定在植入a20细胞的小鼠模型中用t2.01m、t2.02m和化疗治疗后的副作用。
38.图19示出了在植入a20细胞的小鼠模型中用t2.01m、t2.02m和化疗治疗后，通过测量第9天从小鼠收获的肿瘤组织重量而获得的结果的图。
39.图20示出了通过流式细胞术在植入a20细胞的小鼠模型中用t2.01m、t2.02m和化疗治疗后，从第9天收获的肿瘤组织中分离免疫细胞后肿瘤中免疫细胞分布的图。
40.图21示出了通过植入a20细胞和4t1细胞到小鼠中构建肿瘤再激发模型后a20肿瘤大小变化的图，其中通过t2.02m治疗在植入a20细胞的小鼠模型中实现了完全缓解。
41.图22示出了通过植入a20细胞和4t1细胞到小鼠中构建肿瘤再激发模型后4t1肿瘤大小变化的图，其中通过t2.02m治疗在植入a20细胞的小鼠模型中实现了完全缓解。
42.图23示出了通过测量小鼠重量而获得的结果的图，以确定植入a20细胞和4t1细胞到小鼠中构建肿瘤再激发模型后的副作用，其中通过t2.02m治疗在植入a20细胞的小鼠模型中实现了完全缓解。
43.图24示出了在植入a20细胞的小鼠模型中用t2.02m或18b12治疗后测量肿瘤大小变化而获得的结果的图。
44.图25示出了在植入a20细胞的小鼠模型中用t2.02m或t2.13m治疗后测量肿瘤大小变化而获得的结果的图。
45.图26示出了在植入a20细胞的小鼠模型中用t2.02m或18b12和t2.13m组合治疗后测量肿瘤大小变化而获得的结果的图。
46.图27示出了在植入a20细胞的小鼠模型中用t2.01m、t2.02m或t2.03m治疗后测量肿瘤大小变化而获得的结果的图。
47.图28示出了通过测量小鼠重量而获得的结果的图，以确定在植入a20细胞的小鼠模型中用t2.01m、t2.02m或t2.03m治疗后的副作用。
48.图29示出了通过表面等离子体共振分析方法显示t2.04、t2.05、t2.06和t2.07与重组人cd20的结合亲和力的图。
49.图30示出了通过表面等离子体共振分析方法显示t2.08、t2.09、t2.10和t2.11与重组人cd20的结合亲和力的图。
50.图31示出了抗cd20/il-12融合蛋白(左起第一个；图中左臂为抗cd20单体，右臂为包含单链il-12的单体)、具有双可变结构域的抗cd20/il-12融合蛋白(第二个)、与cd20特
异性单链可变片段(scfv)结合的抗cd20/il-12双特异性抗体(第三个和第四个)以及il-12与fc的c末端结合的抗cd20/il-12融合蛋白(第五个)的示意图。
51.图32示出了cd20特异性fab/cd20特异性单链可变片段(scfv)和il-12融合蛋白(左)、包含cd20特异性fab和il-12的融合蛋白二聚体(中)以及包含cd20特异性单链可变片段(scfv)和il-12的融合蛋白二聚体(右)的示意图。
52.实施本发明的方式
53.包含il-12和抗cd20抗体的融合蛋白
54.在本发明的一个方面，提供了一种融合蛋白，其包含il-12或其变体和特异性结合cd20的抗原结合位点。具体地，融合蛋白可包含免疫球蛋白fc区。然后，il-12或其变体可以是具有低肝素结合能力的变体。
55.在一个实施方案中，提供了一种融合蛋白，其包括包含il-12或其变体的第一单体，和包含特异性结合cd20的抗原结合位点的第二单体。
56.在另一个实施方案中，提供了一种融合蛋白二聚体，其包含il-12或其变体和特异性结合cd20的抗原结合位点。
57.il-12或其变体
58.如本文所用，术语“il-12”是由分别由两个独立基因il-12a和il-12b编码的p35和p40亚基组成的异二聚体细胞因子。il-12由抗原呈递细胞(如巨噬细胞)产生，并与活化的t细胞和nk细胞的细胞表面上的受体结合。il-12促进t细胞和nk细胞的增殖，并增强t细胞、nk细胞和巨噬细胞的细胞毒性作用。此外，il-12诱导ifn-γ，tnf-α和gm-csf的产生，并诱导th1细胞的活化。另一方面，il-12与il-12受体结合，il-12受体是由il-12rβ1和il-12rβ2形成的异二聚体受体。
59.如本文所用，术语il-12的“变体”包括具有与野生型il-12蛋白相同或相似功能的氨基酸序列。具体地，构成il-12的p35和p40亚基的氨基酸序列与野生型相比可以具有取代、插入或删除。
60.il-12或其变体可包括il-12a(p35)或其变体，以及il-12b(p40)或其变体。
61.此外，il-12或其变体可包括一种结构，其中il-12a或其变体、il-12b或其变体由肽接头结合。
62.在一个实施方案中，il-12或其变体可以是包含以下结构式(i)或(ii)的融合蛋白：
63.n'-y-[接头(1)]o-z-c'(i)
[0064]
n'-z-[接头(1)]o-y-c'(ii)
[0065]
在结构式(i)和(ii)中，
[0066]
n'可以是融合蛋白的n末端，
[0067]
c'可以是融合蛋白的c末端，
[0068]
y可以是il-12a或其变体，
[0069]
z可以是il-12b或其变体，
[0070]
接头(1)可以是肽接头，并且
[0071]
o可以是0或1。
[0072]
il-12或其变体的一个实施方案可以是il-12b或其变体、肽接头和il-12a或其变
体在n末端依次连接的结构。此外，il-12或其变体的一个实施方案可以是il-12a或其变体、肽接头和il-12b或其变体在n末端依次连接的结构。
[0073]
如本文所用，术语“il-12a”是il-12的35kda亚基(p35)，其通过二硫键与il-12的40kda亚基(p40)结合以产生活性细胞因子。
[0074]
il-12a的氨基酸序列可以是genbank索引号aak84425(关于小鼠p35的氨基酸序列，参见genbank索引号aaa39292)中描述的序列。此外，il-12a(p35)基因是编码il-12a亚基的序列，并且可以是与genbank索引号af404773(有关小鼠序列，参见genbank索引号m86672)描述的序列中的编码序列(cds)相对应的核苷酸序列。
[0075]
如本文所用，术语il-12a的“变体”包括具有与野生型il-12a蛋白相同或相似功能的氨基酸序列。具体地，这意味着与野生型相比，il-12a的氨基酸序列具有取代、插入或删除。具体地，il-12a变体可以是il-12a的片段，并且可以具有删除seq id no:138的第1至第22个氨基酸的氨基酸序列。更具体地，il-12a的变体可以具有seq id no:125的氨基酸序列。
[0076]
此外，在本发明的一个实施方案中使用的il-12a可以是作为人il-12a的seq id no:125的氨基酸序列。在一个实施方案中，小鼠il-12a可以是seq id no:132的氨基酸序列。
[0077]
如本文所用，术语“il-12b”是指il-12的40kda亚基(p40)，其通过二硫键与il-12的35kda亚基(p35)结合形成il-12，并且还与il-23的亚基p19结合形成il-23。另一方面，il-12b也被称为自然杀伤细胞刺激因子2。
[0078]“il-12b”的氨基酸序列可以是genbank索引号aad56386(关于小鼠p40的氨基酸序列，参见genbank索引号aaa39296)中描述的氨基酸序列。此外，il-12b(p40)基因是编码il-12b亚基的序列，并且可以是与genbank索引号af180563(关于小鼠序列，参见genbank索引号m86671)中描述的序列的编码序列(cds)相对应的核苷酸序列。
[0079]
此外，在本发明一个实施方案中使用的il-12b可以是人il-12b，并且具体地，il-12b可以是seq id no:124的氨基酸序列。在一个实施方案中，小鼠il-12b可以具有seq id no:131的氨基酸序列。
[0080]
如本文所用，术语il-12b的“变体”包括具有与野生型il-12b蛋白相同或相似功能的氨基酸序列。具体地，这意味着与野生型相比，il-12b的氨基酸序列具有取代、插入或删除。
[0081]
具体地，il-12b变体可以是删除seq id no:137的第1至第22个氨基酸的变体。更具体地，il-12b变体可以是在seq id no:124的序列中1至8个氨基酸被取代的变体。此外，il-12b变体可以是删除seq id no:139的第1至第22个氨基酸的变体。更具体地，il-12b变体可以是在seq id no:131的序列中最多1至8个氨基酸被取代的变体。
[0082]
il-12b(p40)的变体可以是参与肝素结合il-12的氨基酸被取代的变体。
[0083]
在一个实施方案中，il-12b(p40)的变体可以是il-12b中与肝素结合的赖氨酸(k)被另一种氨基酸取代的形式。具体地，它可以是seq id no:124的第258、260、263和264位的赖氨酸被其他氨基酸取代的形式。具体地，il-12b(p40)的变体可以包括对seq id no:124的氨基酸序列中选自k258a、k260a、k263a和k264a组成的组中的至少一个进行取代而获得的氨基酸序列。具体地，il-12b(p40)的变体可以包括对seq id no:124的氨基酸序列中的
k258a和k263a进行取代而获得的氨基酸序列，或者还可以包括在seq id no:124的氨基酸序列中k260a和/或k264a的突变。
[0084]
在一个实施方案中，il-12b(p40)的变体可以是il-12b中与肝素结合的精氨酸(r)或赖氨酸(k)被另一种氨基酸取代的形式。具体地，它可以是seq id no:131的第254个精氨酸和/或第255、256和260个赖氨酸被其他氨基酸取代的形式。具体地，il-12b(p40)的变体可以包括对seq id no:131的氨基酸序列中选自由r254a、k255a、k256a和k260a组成的组中的至少一个进行取代而获得的氨基酸序列。具体地，il-12b(p40)的变体可以包括对seq id no:131的氨基酸序列中的r254a和k260a进行取代而获得的氨基酸序列，或者还可以包括seq id no:131的氨基酸序列中的k255a和/或k256a的突变。
[0085]
在一个实施方案中，il-12b(p40)的变体可包括seq id no:127、seq id no:129、seq id no:134或seq id no:136的氨基酸序列。
[0086]
在一个实施方案中，人il-12b变体可由以下结构式a组成：
[0087]
【结构式a】
[0088]
x
1-l-x2[0089]
其中，x1为seq id no:141的氨基酸序列，
[0090]
x2为seq id no:142的氨基酸序列，并且
[0091]
l是由v-a
1-a
2-q-a
3-k
*-a
4-a
5-a
6-a
7-k
*-a8组成的氨基酸序列。
[0092]
a1为r或q，a2为v、a或i，a3为g或r
*
，a4为s、n或k
*
，a5为k
*
、n或e，a6为r或k，a7为e、m或t，a8为k
*
或e。
[0093]
至少一个标有“*”的氨基酸残基可以被选自a、g、i、l、m、f、p和v组成的组中的非极性氨基酸残基取代，但不限于此。
[0094]
在一个实施方案中，il-12b(p40)的变体可以包括参与肝素结合的氨基酸的取代，以降低il-12的细胞因子相关毒性，同时保持对癌细胞的杀伤效果。
[0095]
cd20和特异性结合cd20的抗原结合位点
[0096]
如本文所用，术语“cd20”是一种分子量约为35kda的疏水跨膜蛋白，其表达在未成熟b淋巴细胞和成熟b淋巴细胞的表面上。cd20在90％的b细胞非霍奇金淋巴瘤(nhl)中高表达，但在造血干细胞、祖b细胞、正常浆细胞或其他正常组织中未发现。
[0097]
cd20可与“cd20抗原”互换使用，并且可以包含由细胞自然表达或在用cd20基因转染的细胞上表达的人cd20的任何变体、同种型和物种同源物。本发明的抗体可以与cd20结合并介导表达cd20的细胞(例如肿瘤细胞)的死亡。表达cd20的细胞的死亡可能由一种或多种抗体依赖性细胞毒性(adcc)和补体依赖性细胞毒性(cdc)机制引起。
[0098]
如本文所用，术语“特异性结合”是指可测量地不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可以通过与类似于不具有结合活性的靶标的对照分子竞争来确定。
[0099]
如本文所用，术语“抗原结合位点(表位)”是指与抗体可变区中的特定抗原结合位点相互作用的决定簇。抗原结合位点是一组分子，例如氨基酸或糖侧链，其通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特性。特异性结合cd20的抗原结合位点可以是能够特异性结合cd20的抗原抗体的分子的通用术语。
[0100]
此外，抗体或其片段可以以任何形式使用，只要其含有能够特异性结合cd20的抗原结合结构域。
[0101]
抗原结合位点可以包括不直接参与结合的其它氨基酸，或其作用被抗原结合位点的氨基酸残基阻断的氨基酸。
[0102]
具体地，抗原结合位点可以是特异性结合cd20的抗体或其片段。
[0103]
如本文所用，术语“抗体”是指含有抗原结合位点的分子，以及含有抗原结合位点的免疫球蛋白分子的免疫活性片段。所述免疫球蛋白分子可以是igg、ige、igm、igd、iga、igy或其亚类的免疫球蛋白分子。抗体包括合成抗体、单克隆抗体、单域抗体、单链抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、体内抗体、scfv(包括例如单特异性和双特异性等)、fab片段、f(ab')片段、二硫键连接的fv(sdfv)、抗独特型(抗-id)抗体和抗体的抗原结合片段，但不限于此。
[0104]
如本文所用，术语“抗体片段”可以是抗体的一部分，例如f(ab')2、f(ab)2、fab'、fab、fv、scfv。无论结构如何，抗体片段都与完整抗体识别的相同抗原结合。
[0105]
在一个实施方案中，特异性结合cd20的抗原结合位点可包括包含如seq id no:107所示的hcdr1、如seq id no:108所示的hcdr2和如seq id no:109所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:110所示的lcdr1、如seq id no:111所示的lcdr2和如seq id no:112所示的lcdr3的轻链可变区。然后，在一个实施方案中，特异性结合cd20的抗原结合位点可以具有如seq id no:113所示的重链可变区和如seq id no:114所示的轻链可变区。
[0106]
此外，在一个实施方案中，特异性结合cd20的抗原结合位点可包括包含如seq id no：115所示的hcdr1、如seq id no:116所示的hcdr2和如seq id no:117所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:118所示的lcdr1、如seq id no:119所示的lcdr2和如seq id no:120所示的lcdr3的轻链可变区。然后，在一个实施方案中，特异性结合cd20的抗原结合位点可以具有如seq id no:121所示的重链可变区和如seq id no:122所示的轻链可变区。
[0107]
在一个实施方案中，特异性结合cd20的抗原结合位点可以是scfv。然后，scfv可以包括上述重链和轻链cdr。在一个实施方案中，特异性结合cd20的scfv可以具有seq id no:88或seq id no:89的氨基酸序列。
[0108]
此外，特异性结合cd20的抗原结合位点可包含已知的抗cd20抗体或其片段。所述抗cd20抗体或其片段可以指本领域技术人员已知的抗体，但不限于此。
[0109]
抗cd20抗体或其片段可包含选自奥瑞珠单抗(ocrelizumab)(rg-1594)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)(rg-7159)、奥法木单抗(ofatumumab)(gsk-1841157)、2b8(biogen)、托西莫单抗(tositumomab)(bexxar)、乌妥昔单抗(ublituximab)(emab-603)、艾可瑞妥单抗(epcortitamab)的7d8(gen-3013)、地伐西单抗(divozilimab)(bcd-132)、奥尼妥单抗(odronextabmab)(regn-1979)、维妥组单抗(veltuzumab)、mb-cart2019.1、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)(ly-2469298)、adi-001的3h7、帕拉莫妥单抗(pamotamab)(thg-338)、dnl-1的ha20和mab-1.5.3组成的组中的至少一个可变区。
[0110]
在另一个实施例中，作为抗体，可以使用公开于国际专利申请公开号wo 2004-056312a2、国际专利申请公开号wo 2005-044859 a2、美国专利号us 8529902 b2、美国专利号us 8563269 b2、美国专利号us 9694071 b2、国际专利申请公开号wo 2019-155008a1、国际专利申请公开号wo 2020-091634 a1、美国专利申请公开号us 2017-0174781a1、国际专利申请公开号wo 2003-068821 a2、美国专利申请公开号us 2020-0109210a1、美国专利号
us 8153125 b2、国际专利申请公开号wo 2020-072536 a1、美国专利申请公开号us 2021-0095027 a1、国际专利申请公开号wo 2003-068821 a2或美国专利申请公开号us 2011-0129412 a1中的抗cd20抗体或其片段。
[0111]
在一个实施方案中，抗cd20抗体可包含奥瑞珠单抗(ocrelizumab)的可变区。具体地，抗体可包括包含如seq id no:143所示的hcdr1、如seq id no:144所示的hcdr2和如seq id no:145所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:146所示的lcdr1、如seq id no:147所示的lcdr2和如seq id no:148所示的lcdr3的轻链可变区。此外，抗cd20抗体可包括如seq id no:240所示的重链可变区和如seq id no:241所示的轻链可变区。
[0112]
在一个实施方案中，抗cd20抗体可包含阿托珠单抗(afutuzumab)或奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)的可变区。具体地，抗体可包括包含如seq id no:149所示的hcdr1、如seq id no:150所示的hcdr2和如seq id no:151所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:152所示的lcdr1、如seq id no:153所示的lcdr2和如seq id no:154所示的lcdr3的轻链可变区。此外，抗cd20抗体可包括如seq id no:242所示的重链可变区和如seq id no:243所示的轻链可变区。
[0113]
在一个实施方案中，抗cd20抗体可包含奥法木单抗(ofatumumab)的可变区。具体地，抗体可包括包含如seq id no:155所示的hcdr1、如seq id no:156所示的hcdr2和如seq id no:157所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:158所示的lcdr1、如seq id no:159所示的lcdr2和如seq id no:160所示的lcdr3的轻链可变区。此外，抗cd20抗体可包括如seq id no:244所示的重链可变区和如seq id no:245所示的轻链可变区。
[0114]
在一个实施方案中，抗cd20抗体可包含2b8的可变区。具体地，抗体可包括包含如seq id no:161所示的hcdr1、如seq id no:162所示的hcdr2和如seq id no:163所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:164所示的lcdr1、如seq id no:165所示的lcdr2和如seq id no:166所示的lcdr3的轻链可变区。此外，抗cd20抗体可包括如seq id no:246所示的重链可变区和如seq id no:247所示的轻链可变区。
[0115]
在一个实施方案中，抗cd20抗体可包含托西莫单抗(tositumomab)的可变区。具体地，抗体可包括包含如seq id no:167所示的hcdr1、如seq id no:168所示的hcdr2和如seq id no:169所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:170所示的lcdr1、如seq id no:171所示的lcdr2和如seq id no:172所示的lcdr3的轻链可变区。此外，抗cd20抗体可包括如seq id no:248所示的重链可变区和如seq id no:249所示的轻链可变区。
[0116]
在一个实施方案中，抗cd20抗体可包含乌妥昔单抗(ublituximab)的可变区。具体地，抗体可包括包含如seq id no:173所示的hcdr1、如seq id no:174所示的hcdr2和如seq id no:175所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:176所示的lcdr1、如seq id no:177所示的lcdr2和如seq id no:178所示的lcdr3的轻链可变区。此外，抗cd20抗体可包括如seq id no:250所示的重链可变区和如seq id no:251所示的轻链可变区。
[0117]
在一个实施方案中，抗cd20抗体可包含艾可瑞妥单抗(epcortitamab)的可变区。具体地，抗体可包括包含如seq id no:179所示的hcdr1、如seq id no:180所示的hcdr2和如seq id no:181所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:182所示的lcdr1、如seq id no:183所示的lcdr2和如seq id no:184所示的lcdr3的轻链可变区。此外，抗cd20抗体可包括如seq id no:252所示的重链可变区和如seq id no:253所示的轻链可变区。
[0118]
在一个实施方案中，抗cd20抗体可包含地伐西单抗(divozilimab)的可变区。具体地，抗体可包括包含如seq id no:185所示的hcdr1、如seq id no:186所示的hcdr2和如seq id no:187所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:188所示的lcdr1、如seq id no:189所示的lcdr2和如seq id no:190所示的lcdr3的轻链可变区。此外，抗cd20抗体可包括如seq id no:254所示的重链可变区和如seq id no:255所示的轻链可变区。
[0119]
在一个实施方案中，抗cd20抗体可包含奥尼妥单抗(odronextabmab)的可变区。具体地，抗体可包括包含如seq id no:191所示的hcdr1、如seq id no:192所示的hcdr2和如seq id no:193所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:194所示的lcdr1、如seq id no:195所示的lcdr2和如seq id no:196所示的lcdr3的轻链可变区。此外，抗cd20抗体可包括如seq id no:256所示的重链可变区和如seq id no:257所示的轻链可变区。
[0120]
在一个实施方案中，抗cd20抗体可包含维妥组单抗(veltuzumab)的可变区。具体地，抗体可包括包含如seq id no:197所示的hcdr1、如seq id no:198所示的hcdr2和如seq id no:199或seq id no:200所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:201所示的lcdr1、如seq id no:202所示的lcdr2和如seq id no:203所示的lcdr3的轻链可变区。此外，抗cd20抗体可包括如seq id no:258所示的重链可变区和如seq id no:259所示的轻链可变区。
[0121]
在一个实施方案中，抗cd20抗体可包含mb-cart2019.1的可变区。具体地，抗体可包括包含如seq id no:204所示的hcdr1、如seq id no:205所示的hcdr2和如seq id no:206所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:207所示的lcdr1、如seq id no:208所示的lcdr2和如seq id no:209所示的lcdr3的轻链可变区。此外，抗cd20抗体可包括如seq id no:260所示的重链可变区和如seq id no:261所示的轻链可变区。
[0122]
在一个实施方案中，抗cd20抗体可包含奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)的可变区。具体地，抗体可包括包含如seq id no:210所示的hcdr1、如seq id no:211所示的hcdr2和如seq id no:212所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:213所示的lcdr1、如seq id no:214所示的lcdr2和如seq id no:215所示的lcdr3的轻链可变区。此外，抗cd20抗体可包括如seq id no:262所示的重链可变区和如seq id no:263所示的轻链可变区。
[0123]
在一个实施方案中，抗cd20抗体可包含adi-001的可变区。具体地，抗体可包括包含如seq id no:216所示的hcdr1、如seq id no:217所示的hcdr2和如seq id no:218所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:219所示的lcdr1、如seq id no:220所示的lcdr2和如seq id no:221所示的lcdr3的轻链可变区。此外，抗cd20抗体可包括如seq id no:264所示的重链可变区和如seq id no:265所示的轻链可变区。
[0124]
在一个实施方案中，抗cd20抗体可包含帕拉莫妥单抗(pamotamab)的可变区。具体地，抗体可包括包含如seq id no:222所示的hcdr1、如seq id no:223所示的hcdr2和如seq id no:224所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:225所示的lcdr1、如seq id no:226所示的lcdr2和如seq id no:227所示的lcdr3的轻链可变区。此外，抗cd20抗体可包括如seq id no:266所示的重链可变区和如seq id no:267所示的轻链可变区。
[0125]
在一个实施方案中，抗cd20抗体可包含dnl-1的可变区。具体地，抗体可包括包含如seq id no:228所示的hcdr1、如seq id no:229所示的hcdr2和如seq id no:230所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:231所示的lcdr1、如seq id no:232所示的
lcdr2和如seq id no:233所示的lcdr3的轻链可变区。此外，抗cd20抗体可包括如seq id no:268所示的重链可变区和如seq id no:269所示的轻链可变区。
[0126]
在一个实施方案中，抗cd20抗体可包含mab-1.5.3的可变区。具体地，抗体可包括包含如seq id no:234所示的hcdr1、如seq id no:235所示的hcdr2和如seq id no:236所示的hcdr3的重链可变区；以及包含如seq id no:237所示的lcdr1、如seq id no:238所示的lcdr2和如seq id no:239所示的lcdr3的轻链可变区。此外，抗cd20抗体可包括如seq id no:270所示的重链可变区和如seq id no:271所示的轻链可变区。
[0127]
抗cd20抗体特异性结合癌细胞上存在的cd20，并且可以使用任何抗体，只要其可以诱导癌细胞死亡。
[0128]
第一单体的结构
[0129]
第一单体包含il-12或其变体。
[0130]
第一单体还可以包含特异性结合cd20的抗原结合位点。
[0131]
在一个实施方案中，第一单体可包含il-12或其变体；和fc区片段或其变体。
[0132]
在一个实施方案中，第一单体可包含il-12或其变体、fc区片段或其变体，以及特异性结合cd20的抗原结合位点。
[0133]
第一单体可包含以下结构式(iii)或(iv)：
[0134]
n'-x-[接头(2)]p-fc区片段或其变体-[接头(3)]q-(t)r-c'(iii)
[0135]
n'-(t)r-[接头(2)]q-fc区片段或其变体-[接头(3)]p-x-c'(iv)
[0136]
在结构式(iii)和(iv)中，
[0137]
n'可以是融合蛋白的n末端，
[0138]
c'可以是融合蛋白的c末端，
[0139]
x可以是结构式(i)或(ii)，
[0140]
t可以是特异性结合cd20的抗原结合位点，
[0141]
接头(2)和接头(3)可以是肽接头，并且
[0142]
p、q和r可以各自独立地为0或1。
[0143]
在一个实施方案中，当r为0时，第一单体可以是融合蛋白的形式，其中il-12或其变体和fc区片段或其变体通过肽接头连接。
[0144]
然后，第一单体可以包括如seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:34、seq id no:35或seq id no:36所示的氨基酸序列。
[0145]
然后，在结构式(iii)中，当r为1时，第一单体可以是抗cd20抗体的单体与il-12或其变体结合的形式。
[0146]
然后，在结构式(iii)中，当r为1时，第一单体可以包括如seq id no:272、seq id no:273、seq id no:276、seq id no:277、seq id no:277、seq id no:278、seq id no:279、seq id no:282或seq id no:283所示的氨基酸序列。
[0147]
然后，在结构式(iv)中，当r为1时，第一单体可以包括如seq id no:274、seq id no:275、seq id no:280或seq id no:281所示的氨基酸序列。
[0148]
在一个实施方案中，当r为1时，结构式(iii)可包括以下结构式(iii')和(iii”)：
[0149]
n'-x-[接头(2)]p-fc区片段或其变体-[接头(3)]q-(t')-c'(iii')
[0150]
n'-(t”)-c'(iii”)
[0151]
在结构式(iii')和(iii”)中，
[0152]
t'为特异性结合cd20的抗体的重链区，其包括可变区和ch1区，或抗体的轻链区；
[0153]
t”为特异性结合cd20的抗体的轻链区，或抗体的重链区，其包括可变区和ch1区；
[0154]
其中，t'和t”相互结合形成抗体的可变区，其中所述可变区特异性结合cd20；
[0155]
接头(2)至(3)为肽接头，
[0156]
p和q各自独立为0或1，并且
[0157]
n'、x和c'的定义如上所述。
[0158]
在一个实施方案中，当r为1时，结构式(iv)可包括以下结构式(iv')和(iv”)：
[0159]
n'-(t')-[接头(2)]q-fc区片段或其变体-[接头(3)]p-x-c'(iv')；和
[0160]
n'-(t”)-c'(iv”)
[0161]
在结构式(iv')和(iv”)中，
[0162]
t'为特异性结合cd20的抗体的重链区，其包括可变区和ch1区，或抗体的轻链区；
[0163]
t”为特异性结合cd20的抗体的轻链区，或抗体的重链区，其包括可变区和ch1区；
[0164]
其中，t'和t”相互结合形成抗体的可变区，其中所述可变区特异性结合cd20；
[0165]
接头(2)至(3)为肽接头，
[0166]
p和q各自独立为0或1，并且
[0167]
n'、x和c'的定义如上所述。
[0168]
然后，第一单体可以包括如seq id no:10和seq id no:2所示；如seq id no:11和seq id no:2所示；如seq id no:31和seq id no:23所示；或如seq id no:32和seq id no:23所示；如seq id no:274和seq id no:2所示；如seq id no:275和seq id no:2所示；如seq id no:280和seq id no:23所示；或如seq id no:281和seq id no:23所示的氨基酸序列。
[0169]
第二单体的结构
[0170]
第二单体可进一步包含特异性结合cd20的抗原结合位点。
[0171]
在一个实施方案中，第二单体可包含第一cd20结合位点和第二cd20结合位点。
[0172]
特异性结合cd20的抗原结合位点可以是fab、scfv、fv或其片段。然后，第一cd20结合位点可以是fab，第二cd20结合位点可以是fv或scfv。
[0173]
第二cd20结合位点可以与第二单体的n末端或c末端结合。具体地，第二cd20结合位点可以另外结合到重链的c末端、轻链的c末端或可变区的n末端。
[0174]
第二单体可包含以下结构式(v)：
[0175]
n'-(r)s-[接头(4)]t-q-[接头(5)]u-fc区片段或其变体-[接头(6)]v-(w)a-c'(v)
[0176]
在结构式(v)中，
[0177]
n'可以是融合蛋白的n末端，
[0178]
c'可以是融合蛋白的c末端，
[0179]
r和q可以是特异性结合cd20的抗原结合位点，
[0180]
w可以是特异性结合cd20的scfv；或结构式(i)或(ii)的il-12或其变体，接头(4)、(5)和(6)可以各自为肽接头，并且
[0181]
s、t、u、v和a可以各自独立地为0或1。
[0182]
在一个实施方案中，结构式(v)可以包括选自如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:12、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:42、seq id no:274、seq id no:275、seq id no:280和seq id no:281所示的氨基酸序列组成的组中的至少一个。
[0183]
在一个实施方案中，结构式(v)可包括以下结构式(v')和(v”)：
[0184]
n'-(r')s-[接头(4)]t-q'-[接头(5)]u-fc区片段或其变体-[接头(6)]p-(w)a-c'(v')
[0185]
n'-(r”)s-[接头(4)]t-q
”‑
[接头(7)]x-(w)b-c'(v”)
[0186]
在结构式(v')和(v”)中，
[0187]
r'可以是特异性结合cd20的抗体的重链区，其包括可变区和ch1区，或抗体的轻链区；
[0188]
r”可以是特异性结合cd20的抗体的轻链区，或抗体的重链区，其包括可变区和ch1区；
[0189]
其中，r'和r”可以相互结合形成抗体的可变区，其中可变区特异性结合cd20；
[0190]
q'可以是特异性结合cd20的抗体的重链区，其包括可变区和ch1区，或抗体的轻链区；
[0191]
q”可以是特异性结合cd20的抗体的轻链区，或抗体的重链区，其包括可变区和ch1区；
[0192]
其中q'和q”可以相互结合形成抗体的可变区，其中可变区特异性结合cd20，
[0193]
w可以是特异性结合cd20的scfv；或结构式(i)或(ii)的il-12或其变体，接头(4)、(5)、(6)和(7)可以各自为肽接头，并且
[0194]
s、t、u、x、a和b可以各自独立地为0或1。
[0195]
在一个实施方案中，结构式(v')可以是seq id no:1、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:12、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:33、seq id no:42、seq id no:274、seq id no:275、seq id no:280或seq id no:281。
[0196]
在一个实施方案中，结构式(v”)可以是seq id no:2、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:23、seq id no:28或seq id no:30。
[0197]
在一个实施方案中，第二单体可包括由seq id no:113的氨基酸序列组成的重链和由seq id no:114的氨基酸序列组成的轻链；或由seq id no:121的氨基酸序列组成的重链和由seq id no:122的氨基酸序列组成的轻链。
[0198]
此外，当w为scfv时，w可以具有seq id no:88或seq id no:89的氨基酸序列。
[0199]
肽接头
[0200]
如本文所用，术语“肽接头”是指用于提供物理化学距离或连接融合蛋白结构域之间的肽。接头可包含免疫球蛋白的铰链区。
[0201]
肽接头(1)至(7)是指由氨基酸组成的肽接头。具体地，肽接头(2)或(5)可由5至80个连续氨基酸、7至70个连续氨基酸或10至60个连续氨基酸或12至50个氨基酸组成。肽接头可以包括(g4s)n(其中，n为1至10的整数)。然后，在(g4s)n中，n可以分别为1、2、3、4、5、6、7、
8、9或10。
[0202]
肽接头(2)或(5)可由5至80个连续氨基酸、7至70个连续氨基酸或10至60个连续氨基酸或12至50个氨基酸组成。在一个实施方案中，肽接头(2)可由30个氨基酸组成。此外，肽接头(2)可包含至少一个半胱氨酸。具体地，可包含一个、两个或三个半胱氨酸。此外，肽接头(2)可以衍生自免疫球蛋白的铰链，并且还可以包括(g4s)n(其中，n为1至10的整数)。具体地，肽接头(2)或(5)可包含由以下任意一种氨基酸序列组成的铰链区：seq id no:94、seq id no:95、seq id no:96、seq id no:97、seq id no:98、seq id no:99、seq id no:100、seq id no:101和seq id no:102。
[0203]
此外，肽接头(3)、(4)、(6)和(7)可由1至30个连续氨基酸、5至20个连续氨基酸或10至15个连续氨基酸组成。肽接头可以包括(g4s)n(其中，n为1至10的整数)。然后，在(g4s)n中，n可以分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0204]
在一个实施方案中，肽接头(1)可以是由如seq id no:91、seq id no:92或seq id no:93所示的氨基酸序列组成的肽接头。
[0205]
此外，具体地，肽接头(2)、(3)或(5)可包含seq id no:91或seq id no:92。
[0206]
在本发明的一个实施方案中，肽接头(2)或(5)可以是包含如seq id no:100或seq id no:102所示的氨基酸序列的肽接头。
[0207]
fc区或其片段
[0208]
然后，上述免疫球蛋白片段可以是免疫球蛋白的fc区。免疫球蛋白的fc区可以是野生型fc结构域，也可以是fc结构域变体。然后，fc区可以是igg、iga、ige、igd或igm的fc区。具体地，fc区可能来源于igg1或igg2a。
[0209]
如本文所用，术语“fc结构域变体”可以指其在糖基化模式方面不同于野生型fc结构域的形式，与野生型fc结构域相比具有高糖基化，与野生型fc结构域相比具有低糖基化或具有去糖基化的形式。此外，其中还包括无糖基化的fc结构域。fc结构域或其变体可以通过培养条件或宿主的基因操作而适于具有调整数量的唾液酸、岩藻糖基化或糖基化。
[0210]
此外，免疫球蛋白的fc结构域的糖基化可以通过常规方法进行修饰，例如化学方法、酶方法和使用微生物的基因工程方法。此外，fc结构域变体可以是免疫球蛋白igg、iga、ige、igd或igm的各自fc区的混合形式。此外，fc结构域变体可以是fc结构域的某些氨基酸被其他氨基酸取代的形式。
[0211]
通过取代和/或添加引入的“氨基酸”可以是选自由赖氨酸(k)、丙氨酸(a)、精氨酸(r)、天冬酰胺(n)、天冬氨酸(d)、半胱氨酸(c)、谷氨酰胺(q)、谷氨酸(e)、甘氨酸(g)、组氨酸(h)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、蛋氨酸(m)、苯丙氨酸(f)、脯氨酸(p)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、色氨酸(w)，酪氨酸(y)和缬氨酸(v)组成的组中的任意一种。
[0212]
此外，所述fc区可包含杵结构或臼结构。
[0213]
如本文所用，术语“杵臼”是用于制造特异性结合不同区域的抗体的设计策略，例如双特异性抗体、多特异性抗体或异二聚体抗体。通常，该技术涉及在第一多肽(例如第一抗体重链的第一ch3结构域)的界面处引入杵，并在第二多肽(例如第二抗体重链的第二ch3结构域)的界面处引入一个相应的臼，以便杵可以定位于臼内以促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。
[0214]“杵”是通过用较大的侧链(例如精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)替换第一多
肽(例如第一抗体重链的第一ch3结构域)界面的小氨基酸侧链来构建的。通过将第二多肽(例如第二抗体重链的第二ch3结构域)界面的大氨基酸侧链替换为较小的侧链(例如丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸或苏氨酸)，在杵中产生相同或相似大小的互补“臼”。杵和臼可以通过改变编码多肽的核酸来产生，例如通过位点特异性突变或通过肽合成。
[0215]
在一个实施方案中，igg1的杵结构可以是seq id no:19或seq id no:103，并且臼结构可以是seq id no:20或seq id no:104。杵结构或臼结构可以是其中seq id no:284的氨基酸序列的第146、148和187位氨基酸被其他氨基酸取代的形式。具体地，在本发明的一个实施方案中，杵结构或臼结构可以是其中seq id no:284的氨基酸序列被t146w、t146s、l148a和y187v取代的形式。具体地，杵结构可以是用t146w取代的形式，臼结构可以是用t146s、l148a和y187v取代的形式。
[0216]
另一方面，在本发明的一个实施方案中，igg2a的杵结构可以是seq id no:40或seq id no:105，并且臼结构可以是seq id no:41或seq id no:106。杵结构或臼结构可以是其中seq id no:285的氨基酸序列的第152、154和193位氨基酸被其他氨基酸取代的形式。具体地，在本发明的一个实施方案中，杵结构或臼结构可以是其中seq id no:285的氨基酸序列被t152w或t152s、m154a和y193v取代的形式。具体地，杵结构可以是用t152w取代的形式，臼结构可以是用t152s、m154a和y193v取代的形式。
[0217]
在一个实施方案中，fc结构域变体可以包括dang突变或ng突变。然后，“dang突变”是指用于去除人igg1或小鼠igg2a中的效应子功能的d265a/n297g突变。
[0218]
由igg分子中的fc区介导的效应子功能包括c1q结合、补体依赖性细胞毒性、fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、吞噬作用、细胞表面受体(例如b细胞受体、bcr)的下调等。通常，这些效应子功能需要将fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)结合。
[0219]
效应子功能可以通过取代非突变fc区的氨基酸序列来改变，并且可以例如通过修饰c1q结合和/或fcr结合来设计改变效应子功能的fc区，从而改变cdc活性和/或adcc活性。也就是说，“dang突变”意味着由fc区介导的效应子功能从igg分子中去除，因此在抗体产生过程中不会发生不需要的效应子功能。
[0220]
在一个实施方案中，dang突变可以是seq id no:104的人igg1中的氨基酸被d45a/n77g取代的形式。此外，其可以是seq id no:106的小鼠igg2a中的氨基酸被d51a/n83g取代的形式。
[0221]
融合蛋白的结构
[0222]
融合蛋白可以是抗体。具体地，所述抗体可以是包括杵臼结构的异二聚体抗体。
[0223]
所述融合蛋白可包含结构式(iii)和结构式(v)；或结构式(iv)和结构式(v)。
[0224]
更具体地，融合蛋白的一个实施方案可包含以下(i)或(ii)的第一单体；以及以下(iii)、(iv)、(v)或(vi)的第二单体：
[0225]
第一单体的实例：
[0226]
(i)当r为0时，结构式(iii)
[0227]
(ii)当r为1时，结构式(iv)
[0228]
第二单体的实例：
[0229]
(iii)当s、a和b为0时，结构式(v')和结构式(v”)
[0230]
(iv)当s为1且a和b为0时，结构式(v')和结构式(v”)
[0231]
(v)当s和b为0且a为1时，结构式(v')和结构式(v”)
[0232]
(vi)当b为1且s和a为0时，结构式(v')和结构式(v”)。
[0233]
在一个实施方案中，融合蛋白可包括包含上述(i)的第一单体；和包含上述(iii)的第二单体(图31中左起第一个)。然后，所述融合蛋白可包括至少一个选自以下组的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:33、seq id no:34和seq id no:35。具体地，所述融合蛋白可包括seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3；seq id no:1、seq id no:2和seq id no:4；seq id no:1、seq id no:2和seq id no:5；seq id no:2、seq id no:12和seq id no:13；seq id no:2、seq id no:12和seq id no:14；seq id no:22、seq id no:23和seq id no:24；seq id no:22、seq id no:23和seq id no:25；seq id no:22、seq id no:23和seq id no:26；seq id no:23、seq id no:33和seq id no:34；或seq id no:23、seq id no:33和seq id no:35。
[0234]
在一个实施方案中，融合蛋白可包括包含上述(i)的第一单体；和包含上述(iv)的第二单体(图31中左起第二个)。然后，所述融合蛋白可包括至少一个选自以下组的氨基酸序列：seq id no:3、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:27和seq id no:28。具体地，所述融合蛋白可包括seq id no:3、seq id no:6和seq id no:7；seq id no:5、seq id no:6和seq id no:7；seq id no:24、seq id no:27和seq id no:28；或seq id no:26、seq id no:27和seq id no:28。
[0235]
在一个实施方案中，融合蛋白可包括包含上述(i)的第一单体；和包含上述(v)的第二单体(图31中左起第三个)。然后，所述融合蛋白可包括至少一个选自以下组的氨基酸序列：seq id no:2、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:8、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:26和seq id no:29。具体地，所述融合蛋白可包括seq id no:2、seq id no:3和seq id no:8；seq id no:2、seq id no:5和seq id no:8；seq id no:23、seq id no:24和seq id no:29；或seq id no:23、seq id no:26和seq id no:29。
[0236]
在一个实施方案中，融合蛋白可包括包含上述(i)的第一单体；和包含上述(vi)的第二单体(图31中左起第四个)。然后，所述融合蛋白可包括至少一个选自以下组的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:9、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26和seq id no:30。具体地，所述融合蛋白可包括seq id no:1、seq id no:3和seq id no:9；seq id no:1、seq id no:5和seq id no:9；seq id no:22、seq id no:24和seq id no:30；或seq id no:22、seq id no:26和seq id no:30。
[0237]
在一个实施方案中，融合蛋白可包括包含上述(ii)的第一单体；和包含上述(iii)的第二单体(图31中左起第五个)。然后，融合蛋白可包括至少一个选自以下组的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:31和seq id no:32。具体地，所述融合蛋白可包括seq id no:1、seq id no:2和seq id no:10；seq id no:1、seq id no:2和seq id no:11；seq id no:22、seq id no:23和seq id no:31；或seq id no:22、seq id no:23和seq id no:32。
[0238]
此外，在一个实施方案中，包含il-12或其变体以及特异性结合cd20的抗原结合位
点的融合蛋白二聚体可以是包含结构式(iii)的单体和结构式(v)的单体的融合蛋白二聚体(图32中的左侧)。然后，在结构式(iii)中，r为1，在结构式(v)中，s、a和t为0。然后，结构式(v)可包括(v')和(v”)。然后，在(v')和(v”)中，s、a、t和b为0。此外，二聚体的fc区具有杵臼结构，通过该结构，不同的融合蛋白可以相互结合。
[0239]
具体地，所述融合蛋白可包括至少一个选自以下组的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:272、seq id no:273、seq id no:278和seq id no:279。具体地，所述融合蛋白可包括seq id no:1、seq id no:2和seq id no:272；seq id no:1、seq id no:2和seq id no:273；seq id no:22、seq id no:23和seq id no:278；或seq id no:22、seq id no:23和seq id no:279。
[0240]
此外，包含il-12或其变体以及特异性结合cd20的抗原结合位点的融合蛋白二聚体可以是包含结构式(v)的融合蛋白二聚体(图32中的中间)。然后，所述融合蛋白二聚体可包括(v')和(v”)。然后，在结构式(v)中，s和t为0，a为1。此外，在(v')和(v”)中，s、t和b为0，a为1。此外，融合蛋白二聚体可以是包含结构式(iv)的融合蛋白二聚体。然后，在结构式(iv)中，r为1。
[0241]
具体地，所述融合蛋白可包括至少一个选自以下组的氨基酸序列：seq id no:2、seq id no:23、seq id no:274、seq id no:275、seq id no:280和seq id no:281。具体地，所述融合蛋白可包括seq id no:2和seq id no:274；seq id no:2和seq id no:275；seq id no:23和seq id no:280；或seq id no:23和seq id no:281。
[0242]
在一个实施方案中，包含il-12或其变体以及特异性结合cd20的抗原结合位点的融合蛋白二聚体可以是包括结构式(iii)的融合蛋白二聚体(图32中的右侧)。然后，在结构式(iii)中，r为1。
[0243]
具体地，所述融合蛋白可包括seq id no:276、seq id no:277、seq id no:282或seq id no:283。
[0244]
本文中的多特异性融合蛋白可以是化学修饰的形式。在一个实施方案中，融合蛋白可以通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、与已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割和/或与细胞配体或其它蛋白质结合进行化学修饰。许多这些化学修饰可以通过已知技术进行。
[0245]
编码融合蛋白的多核苷酸
[0246]
在本发明的另一方面，提供了编码第一单体的多核苷酸或编码第二单体的多核苷酸。
[0247]
在一个实施方案中，第一单体的多肽可包含与seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:31、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:272、seq id no:273、seq id no:274、seq id no:275、seq id no:276、seq id no:277、seq id no:278、seq id no:279、seq id no:280、seq id no:281、seq id no:282或seq id no:283具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列。
[0248]
在一个实施方案中，编码第一单体的多核苷酸可以与seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:52、seq id no:53、seq id no:55、seq id no:56、seq id no:57、seq id no:66、seq id no:67、seq id no:68、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:76、seq id no:77或seq id no:78具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％的同一性。
[0249]
在一个实施方案中，第二单体的多肽可包含与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:12、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:42、seq id no:274、seq id no:275、seq id no:280或seq id no:281具有约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列。
[0250]
在一个实施方案中，编码第二单体的多核苷酸可以与seq id no:43、seq id no:44、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:51、seq id no:54、seq id no:63、seq id no:64、seq id no:65、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:75、seq id no:84具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％的同一性。
[0251]
所述多核苷酸还可以包括编码信号序列或前导序列的核酸。如本文所用，术语“信号序列”是指指导靶蛋白分泌的信号肽。信号肽被翻译，然后在宿主细胞中切割。具体地，信号序列是启动蛋白质通过内质网(er)膜转运的氨基酸序列。
[0252]
信号序列因其特性而在本领域是众所周知的。这种信号序列通常含有16至30个氨基酸残基，并且可以含有比这种氨基酸残基更多或更少的氨基酸残基。典型的信号肽由三个区域组成，即碱性n末端区域、中心疏水区域和极性更强的c末端区域。中央疏水区域包含4至12个疏水残基，这些疏水残基导致信号序列在未成熟多肽通过膜脂双层运输过程中被固定。
[0253]
启动后，信号序列在er的腔内被细胞酶(通常称为信号肽酶)切割。然后，信号序列可以是tpa(组织纤溶酶原激活剂)，hsv gds(单纯疱疹病毒糖蛋白d的信号序列)或生长激素的分泌信号序列。优选地，可以使用用于包括哺乳动物等在内的高级真核细胞的分泌信号序列。此外，可以使用野生型信号序列，或者可以使用在宿主细胞中被具有高表达频率的密码子取代的信号序列。
[0254]
含有多核苷酸的载体
[0255]
在本发明的另一方面，提供了包含多核苷酸的载体。
[0256]
载体可以被引入宿主细胞中，与宿主细胞的基因组重组并插入其中。或者，载体被理解为含有多核苷酸序列的核酸手段，该多核苷酸序列可作为附加体自主复制。所述载体包括线性核酸、质粒、噬菌体、粘粒(cosmid)、rna载体、病毒载体及其类似物。病毒载体的实
例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。
[0257]
具体地，载体可包括质粒dna、噬菌体dna等；以及商业开发的质粒(puc18、pbad、pidtsamrt-amp等)、大肠杆菌衍生质粒(pyg601br322、pbr325、puc118、puc119等)、枯草芽孢杆菌衍生质粒(pub110、ptp5等)、酵母衍生质粒(yep13、yep24、ycp50等)、噬菌体dna(charon4a、charon21a、embl3、embl4、λgt10、λgt11、λzap等)、动物病毒载体(逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒等)、昆虫病毒载体(杆状病毒等)。由于载体根据宿主细胞表现出不同的表达水平和蛋白质修饰，因此优选选择和使用最适合该目的的宿主细胞。
[0258]
如本文所用，术语目标蛋白的“基因表达”或“表达”被理解为dna序列的转录、mrna转录本的翻译以及融合蛋白产物或其片段的分泌。有用的表达载体可以是rccmv(invitrogen，carlsbad)或其变体。表达载体可以含有用于促进哺乳动物细胞中靶基因连续转录的人巨细胞病毒(cmv)启动子，以及用于提高转录后rna稳定性水平的牛生长激素聚腺苷酸化信号序列。
[0259]
表达融合蛋白的转化细胞
[0260]
在本发明的另一方面，提供了一种已将载体引入其中的转化细胞。
[0261]
转化细胞的宿主细胞可以包括但不限于原核细胞、真核细胞和哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细胞来源的细胞。作为原核细胞的一个例子，可以使用大肠杆菌。此外，作为真核细胞的一个例子，可以使用酵母。此外，对于哺乳动物细胞，可以使用cho细胞、f2n细胞、cso细胞、bhk细胞、bowes黑色素瘤细胞、hela细胞、911细胞、at1080细胞、a549细胞、hek293细胞、hek293t细胞等。然而，哺乳动物细胞不限于此，任何本领域技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的细胞都可以使用。
[0262]
此外，为了将表达载体引入宿主细胞，可以使用cacl2沉淀、通过在cacl2沉淀中使用还原剂(例如二甲基亚砜(dmso))来提高效率的hanahan方法、电穿孔、磷酸钙沉淀、原生质体融合、使用碳化硅纤维搅拌、农杆菌介导的转化、使用peg的转化、硫酸葡聚糖、脂质体或干/抑制介导的转化等。
[0263]
如上所述，为了优化融合蛋白作为治疗剂的性质或用于任何其他目的，融合蛋白的糖基化模式(例如，唾液酸、岩藻糖基化、糖基化)可以通过本领域技术人员已知的方法操纵宿主细胞所具有的糖基化相关基因来调节。
[0264]
产生融合蛋白的方法
[0265]
在本发明的另一方面，提供了一种产生融合蛋白的方法，包括i)培养转化细胞；ii)回收包含第一单体和第二单体的融合蛋白。
[0266]
培养转化细胞的方法可以使用本领域公知的方法进行。具体地，所述培养可以在分批进料过程中进行，或者在补料分批或重复补料分批过程中连续进行。
[0267]
融合蛋白的使用
[0268]
在本发明的另一方面，提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含融合蛋白作为活性成分。
[0269]
然后，所述癌症可以是选自由胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌、骨癌、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、卵巢癌、胰腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、脑肿瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌和淋巴瘤组成的组中的任一种。
[0270]
药物组合物的优选剂量根据患者的病情和体重、疾病的严重程度、药物形式、给药途径和持续时间而变化，并且可以由本领域技术人员适当地选择。在本发明用于治疗或预防肿瘤的药物组合物中，活性成分可以根据应用、剂型、混合目的等以任意量(有效量)含有，只要活性成分可以表现出治疗肿瘤的活性或特别是对癌症的治疗效果。其常规有效量将基于组合物的总重量在0.001％至20.0％重量的范围内确定。然后，术语“有效量”是指活性成分的量，其能够诱导改善或治疗疾病状况的效果，特别是诱导改善或治疗癌症状况的效果。这样的有效量可以在本领域技术人员的公知范围内通过实验确定。
[0271]
如本文所用，术语“治疗”可用于表示治疗性和预防性治疗。然后，预防可用于表示缓解或减轻受试者的病理状况或疾病。在一个实施方案中，术语“治疗”包括用于治疗哺乳动物(包括人)的疾病的应用或任何形式的给药。此外，该术语包括抑制或减缓疾病的进展；并且包括恢复或修复受损或丧失的功能，以部分或完全缓解疾病；刺激低效流程；或缓解严重疾病的含义。
[0272]
药代动力学参数(例如生物利用度)和基础参数(例如清除率)也可能影响功效。因此，“增强功效”(例如功效的改善)可能是由于药代动力学参数的增强和功效的增强，这可以通过比较试验动物或人类受试者的肿瘤，诸如清除率和治疗或改善等参数来测量。
[0273]
如本文所用，术语“治疗有效量”或“药学有效量”是指有效预防或治疗所讨论疾病的化合物或组合物的量，其足以以适用于医学治疗的合理效益/风险比治疗疾病并且不引起副作用。有效量的水平可以取决于包括患者的健康状况、疾病的类型和严重程度、药物的活性、患者对药物的敏感性、给药方式、给药时间、给药途径和排泄率、治疗持续时间、配方或同时使用的药物，以及医学领域公知的其他因素在内的因素来确定。在一个实施方案中，治疗有效量是指有效治疗癌症的药物的量。
[0274]
然后，所述药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以是任何载体，只要该载体是适合递送给患者的无毒物质。可以含有蒸馏水、酒精、脂肪、蜡和惰性固体作为载体。药学上可接受的佐剂(缓冲剂、分散剂)也可以包含在药物组合物中。
[0275]
具体地，通过包括除活性成分之外的药学上可接受的载体，可以使用本领域已知的常规方法根据给药途径将药物组合物制备成肠胃外制剂。然后，术语“药学上可接受的”是指载体不具有比要施用(规定)的受试者可以适应的毒性更大的毒性，同时不抑制活性成分的活性。
[0276]
当将药物组合物制备成肠胃外制剂时，可以根据本领域已知的方法将其制成具有合适载体的注射剂、透皮贴剂、鼻吸入剂或栓剂形式的制剂。在被制成注射剂的情况下，可以使用无菌水、乙醇、多元醇如甘油或丙二醇，或其混合物作为合适的载体；可以优选使用等渗溶液，如林格氏溶液、含有三乙醇胺或无菌注射用水的磷酸盐缓冲盐水(pbs)，和5％葡萄糖等。药物组合物的配方是本领域已知的，并且可以具体参考雷明顿的《药物科学》(第19版，1995)等。本文档被视为本规范的一部分。
[0277]
药物组合物的优选剂量范围可以是每天0.01μg/kg至10g/kg，或0.01mg/kg至1g/kg，这取决于患者的状况、体重、性别、年龄、患者的严重程度和给药途径。剂量可以每天施用一次，也可以每天分成几次。这样的剂量不应被解释为在任何方面限制本发明的范围。
[0278]
可以施用(规定)药物组合物的受试者为哺乳动物和人，特别优选人。除了活性成
分之外，本发明的药物组合物还可以含有任何化合物或天然提取物，其已知对肿瘤具有治疗作用。
[0279]
在本发明的另一方面，提供了一种融合蛋白的用途，其包括包含il-12或其变体的第一单体；以及包含特异性结合cd20的抗原结合位点的第二单体，用于治疗癌症。
[0280]
在本发明的另一方面，提供了一种融合蛋白的用途，其包括包含il-12或其变体的第一单体；以及包含特异性结合cd20的抗原结合位点的第二单体，用于制造治疗癌症的药物。
[0281]
在本发明的又一方面，提供了一种治疗或预防癌症的方法，包括向受试者施用融合蛋白，所述融合蛋白包括包含il-12或其变体的第一单体；以及包含特异性结合cd20的抗原结合位点的第二单体。
[0282]
那么，受试者可以是患有癌症的受试者。此外，受试者可以是哺乳动物，优选人。
[0283]
融合蛋白或融合蛋白二聚体的给药途径、剂量和给药频率可以根据患者的病情和是否存在副作用而变化，因此融合蛋白或融合蛋白二聚体可以以各种方式和量施用于受试者。最佳给药方法、剂量和给药频率可由本领域技术人员在适当范围内选择。此外，融合蛋白或融合蛋白二聚体可以与其它药物或生理活性物质组合施用，其治疗效果相对于待治疗的疾病是已知的，或者可以配制成与其它药物的组合制剂的形式。
[0284]
在下文中，将通过以下实施例对本发明进行更详细的描述。但是，以下实施例仅用于说明本发明，本发明的保护范围并不限于此。
[0285]
准备例1.抗cd20/il-12igg1人源融合蛋白的概述
[0286]
【表1】
[0287]
[0288][0289]
[seq1]由人抗cd20重链可变区序列和人igg1 fc组成，其中通过t366w突变形成杵结构。
[0290]
[seq2]由人抗cd20轻链序列组成。
[0291]
[seq3]由人il-12p40(β)区序列和接头ggggsggggsggggs、人白细胞介素12p35(α)区序列、接头ggggsggggs和人igg1 fc组成，其中通过t366s、l368a和y407v突变形成臼结构。
[0292]
[seq4]由人il-12p40(β)区中参与肝素结合的第280和第285位氨基酸的赖氨酸(k)突变为丙氨酸(a)的序列、接头ggggsggggsggggs、人il-12p35(α)区序列、接头ggggsggggs和人igg1 fc臼组成。
[0293]
[seq5]由人il-12p40(β)区中参与肝素结合的第280、282、285和286位氨基酸的赖氨酸(k)突变为丙氨酸(a)的序列、接头ggggsggggsggggs、人il-12p35(α)区序列、接头ggggsggggs和人igg1 fc臼组成。
[0294]
[seq6]由人抗cd20重链可变区序列、接头ggggsggggsggggs、人抗cd20重链可变区序列和人igg1 fc杵组成。
[0295]
[seq7]由人抗cd20轻链可变区序列、接头ggggsggggsggggs和人抗cd20轻链序列组成。
[0296]
[seq8]由人抗cd20重链可变区序列、人igg1 fc杵、接头ggggsggggsggggs、人抗cd20重链可变区序列、接头ggggsggggsggggsggggs和人抗cd20轻链可变区序列组成。
[0297]
[seq9]由人抗cd20轻链序列、接头ggggsggggsggggs、人抗cd20重链可变区序列、接头ggggsggggsggggsggggs和人抗cd20轻链可变区序列组成。
[0298]
[seq10]由人抗cd20重链序列、人igg1 fc臼、接头ggggsggggsggggs、人il-12p40
(β)区序列、接头ggggsggggsggggs和人il-12p35(α)区序列组成。
[0299]
[seq11]由人抗cd20重链序列、人igg1 fc臼、ggggsggggsggggs、含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的人il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs和人il-12p35(α)区序列组成。
[0300]
[seq12]由人抗cd20抗体的重链序列和人igg1 fc杵dang组成。
[0301]
[seq13]由人il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs、人il-12p35(α)区序列、接头ggggsggggs和人igg1 fc臼dang组成。
[0302]
[seq14]由含有参与肝素结合的氨基酸突变(两个)的人il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs、人il-12p35(α)区序列、接头ggggsggggs和人igg1 fc臼dang组成。
[0303]
[seq15]由含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的人il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs、人il-12p35(α)区序列、接头ggggsggggs和人igg1 fc组成。
[0304]
[seq16]由人抗fap重链可变区序列和人igg1 fc杵组成。
[0305]
[seq17]由人抗fap轻链序列组成。
[0306]
[seq18]由人抗fap重链可变区序列和人igg1 fc杵dang组成。
[0307]
[seq19]仅由人igg1 fc杵dang组成。
[0308]
[seq20]仅由人igg1 fc臼dang组成。
[0309]
[seq21]是人抗cd20抗体利妥昔单抗的重链序列。
[0310]
[seq272]由人il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs、人il-12p35(α)区序列、接头ggggsggggs和人igg1 fc臼、接头ggggsggggsggggs、人抗cd20重链可变区序列、接头ggggsggggsggggsggggs和人抗cd20轻链可变区序列组成。
[0311]
[seq273]由含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的人il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs、人il-12p35(α)区序列、接头ggggsggggs和人igg1fc臼、接头ggggsggggsggggs、人抗cd20重链可变区序列、接头ggggsggggsggggsggggs和人抗cd20轻链可变区序列组成。
[0312]
[seq274]由人抗cd20重链序列、人igg1 fc、接头ggggsggggsggggs、人il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs和人il-12p35(α)区序列组成。
[0313]
[seq275]由人抗cd20重链序列、人igg1 fc、接头ggggsggggsggggs、含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的人il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs和人il-12p35(α)区序列组成。
[0314]
[seq276]由人il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs、人il-12p35(α)区序列、接头ggggsggggs和人igg1 fc、接头ggggsggggsggggs、人抗cd20重链可变区序列、接头ggggsggggsggggsggggs和人抗cd20轻链可变区序列组成。
[0315]
[seq277]由含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的人il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs、人il-12p35(α)区序列、接头ggggsggggs和人igg1fc、接头ggggsggggsggggs、人抗cd20重链可变区序列、接头ggggsggggsggggsggggs和人抗cd20轻链可变区序列组成。
[0316]
t2.01(seq1，seq2，seq3)是一种双特异性抗体，其中靶向cd20蛋白的人抗cd20序列和人il-12序列形成杵臼结构。
[0317]
t2.02(seq1，seq2，seq4)是一种双特异性抗体，其中靶向cd20蛋白的人抗cd20序
列和含有参与肝素结合的氨基酸突变(两个)的人il-12序列形成杵臼结构。
[0318]
t2.03(seq1，seq2，seq5)是一种双特异性抗体，其中靶向cd20蛋白的人抗cd20序列和含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的人il-12序列形成杵臼结构。
[0319]
t2.04(seq3，seq6，seq7)是一种双特异性抗体，其中双可变结构域免疫球蛋白(dvd-ig)形式的人抗cd20序列和人il-12序列形成杵臼结构。
[0320]
t2.05(seq5，seq6，seq7)是一种双特异性抗体，其中双可变结构域免疫球蛋白(dvd-ig)形式的人抗cd20序列和含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的人il-12序列形成杵臼结构。
[0321]
t2.06(seq2，seq3，seq8)是一种双特异性抗体，其中人抗cd20序列中的单链可变片段(靶向cd20蛋白的人抗cd20序列的scfv)与重链的c末端相连，与人il-12序列形成杵臼结构。
[0322]
t2.07(seq2，seq5，seq8)是一种双特异性抗体，其中人抗cd20序列中的单链可变片段(靶向cd20蛋白的人抗cd20序列的scfv)与重链的c末端相连，与含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的人il-12序列形成杵臼结构。
[0323]
t2.08(seq1，seq3，seq9)是一种双特异性抗体，其中人抗cd20序列中的单链可变片段(靶向cd20蛋白的人抗cd20序列的scfv)与轻链的c末端相连，与人il-12序列形成杵臼结构。
[0324]
t2.09(seq1，seq5，seq9)是一种双特异性抗体，其中人抗cd20序列中的单链可变片段(靶向cd20蛋白的人抗cd20序列的scfv)与轻链的c末端相连，与含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的人il-12序列形成杵臼结构。
[0325]
t2.10(seq1，seq2，seq10)是一种抗体，其中靶向cd20蛋白的人抗cd20序列和其中人il-12序列与重链的c末端连接的人抗cd20序列形成杵臼结构。
[0326]
t2.11(seq1，seq2，seq11)是一种抗体，其中靶向cd20蛋白的人抗cd20序列和其中含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的人il-12序列与重链的c末端连接的人抗cd20序列形成杵臼结构。
[0327]
t2.12(seq2，seq12，seq14)是一种双特异性抗体，其中靶向cd20蛋白的人抗cd20序列与含有参与肝素结合的氨基酸突变(两个)的人il-12序列形成杵臼结构，并去除效应子功能。
[0328]
t2.13(seq13，seq19)是一种抗体，其中仅具有人il-12序列的杵臼结构的效应子功能被去除。
[0329]
t2.14(seq14，seq19)是一种抗体，其中仅具有含有参与肝素结合的氨基酸突变(两个)的人il-12序列的杵臼结构的效应子功能被去除。
[0330]
t2.15(seq15)是一种fc融合蛋白，其仅具有含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的人il-12序列。
[0331]
t2.16(seq4，seq16，seq17)是一种双特异性抗体，其中靶向fap蛋白的人抗fap序列与含有参与肝素结合的氨基酸突变(两个)的人il-12序列形成杵臼结构。
[0332]
t2.17(seq17，seq18，seq20)是一种抗体，其中仅具有靶向fap蛋白的人抗fap序列的杵臼结构的效应子功能被去除。
[0333]
利妥昔单抗(seq2，seq21)是一种靶向cd20蛋白的人抗cd20(利妥昔单抗)抗体。
[0334]
t2.18(seq1，seq2，seq272)是一种双特异性抗体，其中人抗cd20序列和其中人抗cd20序列的单链可变片段(scfv)与c末端连接的人il-12序列形成杵臼结构。
[0335]
t2.19(seq1，seq2，seq273)是一种双特异性抗体，其中人抗cd20重链序列和其中人抗cd20序列的单链可变片段(scfv)与c末端连接的含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的人il-12序列形成杵臼结构。
[0336]
t2.20(seq2，seq274)是一种含有人抗cd20序列的fc融合蛋白二聚体，其中人il-12序列与重链的c末端相连。
[0337]
t2.21(seq2，seq275)是一种含有人抗cd20序列的fc融合蛋白二聚体，其中含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的人il-12序列与重链的c末端相连。
[0338]
t2.22(seq276)是一种含有人il-12序列的fc融合蛋白二聚体，其中人抗cd20序列的单链可变片段(scfv)与c末端相连。
[0339]
t2.23(seq277)是一种由含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的人il-12序列组成的fc融合蛋白二聚体，其中人抗cd20序列的单链可变片段(scfv)与c末端相连。
[0340]
[seq1]抗-hu cd20 hc hu igg1 fc杵
[0341]
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[0342]
[seq2]抗-hu cd20 lc
[0343]
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[0344]
[seq3]hu scil-12-hu igg1 fc臼
[0345]
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[0346]
[seq4]hu scil-12mut1-hu igg1 fc臼
[0347]
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[0348]
[seq5]hu scil-12mut2-hu igg1 fc臼
[0349]
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[0350]
[seq6](抗-hu cd20 vh)2-hu igg1 fc杵
[0351]
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[0352]
[seq7](抗-hu cd20 vl)2
[0353]
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[0354]
[seq8]抗-hu cd20 hc hu igg1 fc杵-抗-hu cd20 scfv
[0355]
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[0356]
[seq9]抗-hu cd20 lc-抗-hu cd20 scfv
[0357]
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[0358]
[seq10]抗-hu cd20 hc hu igg1 fc臼-hu scil-12
[0359]
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[0360]
[seq11]抗-hu cd20 hc hu igg1 fc臼-hu scil-12mut2
[0361]
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[0362]
[seq12]抗-hu cd20 hc hu igg1 fc杵dang
[0363]
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[seq13]hu scil-12-hu igg1 fc臼dang
[0365]
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[0366]
[seq14]hu scil-12mut1-hu igg1 fc臼dang
[0367]
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[0368]
[seq15]hu scil-12mut2-hu igg1 fc
[0369]
iwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqvkefgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysgrftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqedsacpaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevsweypdtwstphsyfsltfcvqvqgasareaadrvftdktsatvicrknasisvraqdryyssswsewasvpcsggggsggggsggggsrnlpvatpdpgmfpclhhsqnllravsnmlqkarqtlefypctseeidheditkdktstveaclpleltknesclnsretsfitngsclasrktsfmmalclssiyedlkmyqvefktmnakllmdpkrqifldqnmlavidelmqalnfnsetvpqkssleepdfyktkiklcillhafriravtidrvmsylnasggggsggggsdkt
htcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0370]
[seq16]抗-hu fap hc igg1 fc杵
[0371]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvscktsrytfteytihwvrqapgqrlewigginpnngipnynqkfkgrvtitvdtsastaymelsslrsedtavyycarrriaygydeghamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0372]
[seq17]抗-hu fap lc
[0373]
divmtqspdslavslgeratinckssqsllysrnqknylawyqqkpgqppkllifwastresgvpdrfsgsgfgtdftltisslqaedvavyycqqyfsypltfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0374]
[seq18]抗-hu fap hc hu igg1 fc杵dang
[0375]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvscktsrytfteytihwvrqapgqrlewigginpnngipnynqkfkgrvtitvdtsastaymelsslrsedtavyycarrriaygydeghamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvavshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqygstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0376]
[seq19]hu igg1 fc杵dang
[0377]
dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvavshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqygstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0378]
[seq20]hu igg1 fc臼dang
[0379]
dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvavshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqygstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0380]
[seq21]抗-hu cd20(利妥昔单抗)hc
[0381]
qvqlqqpgaelvkpgasvkmsckasgytftsynmhwvkqtpgrglewigaiypgngdtsynqkfkgkatltadkssstaymqlssltsedsavyycarstyyggdwyfnvwgagttvtvsaastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0382]
[seq272]hu scil-12-hu igg1 fc臼-抗-hu cd20 scfv
[0383][0384]
[seq274]抗-hu cd20 hc hu igg1 fc-hu scil-12
[0385][0386]
[seq275]抗-hu cd20 hc hu igg1 fc-hu scil-12mut2
[0387][0388]
[seq276]hu scil-12-hu igg1 fc-抗-hu cd20 scfv
[0389][0390]
[seq277]hu scil-12mut2-hu igg1 fc-抗-hu cd20 scfv
[0391][0392]
准备例2.抗cd20/il-12igg2a小鼠融合蛋白的概述
[0393]
【表2】
[0394]
[0395][0396]
[seq22]由小鼠抗cd20抗体重链序列和小鼠igg2a fc组成，其中通过t321w突变形成杵结构。
[0397]
[seq23]由小鼠抗cd20抗体18b12的轻链序列组成。
[0398]
[seq24]由小鼠il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs，小鼠il-12p35(α)区序列，接头ggggsggggs和小鼠igg2a fc组成，其中通过t321s、m323a和y362v突变形成臼结构。
[0399]
[seq25]由小鼠il-12p40(β)区中参与肝素结合的第277和第282位氨基酸的赖氨酸(k)突变为丙氨酸(a)的序列、接头ggggsggggsggggs、小鼠il-12p35(α)区序列、接头ggggsggggs和小鼠igg2a fc臼组成。
[0400]
[seq26]由小鼠il-12p40(β)区中参与肝素结合的第276位氨基酸的精氨酸(r)和第277、278和282位氨基酸的赖氨酸(k)突变为丙氨酸(a)的序列、接头ggggsggggsggggs、小鼠il-12p35(α)区序列、接头ggggsggggs和小鼠igg2afc臼组成。
[0401]
[seq27]由小鼠抗cd20重链可变区序列、接头ggggsggggsggggs、小鼠抗cd20重链可变区序列和小鼠igg2a fc杵组成。
[0402]
[seq28]由小鼠抗cd20轻链可变区序列、接头ggggsggggsggggs和小鼠抗cd20轻链序列组成。
[0403]
[seq29]由小鼠抗cd20重链可变区序列、小鼠igg2a fc杵、接头ggggsggggsggggs、小鼠抗cd20重链可变区序列、接头ggggsggggsggggsggggs和小鼠抗cd20轻链可变区序列组成。
[0404]
[seq30]由小鼠抗cd20轻链序列、接头ggggsggggsggggs、小鼠抗cd20重链可变区序列、接头ggggsggggsggggsggggs和小鼠抗cd20轻链可变区序列组成。
[0405]
[seq31]由小鼠抗cd20重链可变区域序列、小鼠igg2a fc臼、接头
ggggsggggsggggs、小鼠il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs和小鼠il-12p35(α)区序列组成。
[0406]
[seq32]由小鼠抗cd20重链可变区序列、小鼠igg2a fc臼、接头ggggsggggsggggs、含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的小鼠il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs和小鼠il-12p35(α)区序列组成。
[0407]
[seq33]由小鼠抗cd20抗体的重链可变区序列和小鼠igg2a fc杵dang组成。
[0408]
[seq34]由小鼠il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs、小鼠il-12p35(α)区序列、接头ggggsggggs和小鼠igg2a fc臼dang组成。
[0409]
[seq35]由含有参与肝素结合的氨基酸突变(两个)的小鼠il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs、小鼠il-12p35(α)区序列，接头ggggsggggs和小鼠igg2a fc臼dang组成。
[0410]
[seq36]由含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的小鼠il-12p40(β)区序列，接头ggggsggggsggggs，小鼠il-12p35(α)区序列，接头ggggsggggs和小鼠igg2a fc组成。
[0411]
[seq37]由小鼠抗fap重链可变区序列和小鼠igg2a fc杵组成。
[0412]
[seq38]由小鼠抗fap轻链序列组成。
[0413]
[seq39]由小鼠抗fap重链可变区序列和小鼠igg2a fc杵dang组成。
[0414]
[seq40]仅由小鼠igg2a fc杵dang组成。
[0415]
[seq41]仅由小鼠igg2a fc臼dang组成。
[0416]
[seq42]是小鼠抗cd20抗体18b12的重链序列。
[0417]
[seq278]由小鼠il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs、小鼠il-12p35(α)区序列、接头ggggsggggs、小鼠igg2a fc臼、接头ggggsggggsggggs、小鼠抗cd20重链可变区序列、接头ggggsggggsggggsggggs和小鼠抗cd20轻链可变区序列组成。
[0418]
[seq279]由含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的小鼠il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs、小鼠il-12p35(α)区序列、接头ggggsggggs和小鼠igg2a fc臼、接头ggggsggggsggggs、小鼠抗cd20重链可变区序列、接头ggggsggggsggggsggggs和小鼠抗cd20轻链可变区序列组成。
[0419]
[seq280]由小鼠抗cd20重链序列、小鼠igg2a fc、接头ggggsggggsggggs、小鼠il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs和小鼠il-12p35(α)区序列组成。
[0420]
[seq281]由小鼠抗cd20重链序列、小鼠igg2a fc、接头ggggsggggsggggs、含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的小鼠il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs和小鼠il-12p35(α)区序列组成。
[0421]
[seq282]由小鼠il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs、小鼠il-12p35(α)区序列、接头ggggsggggs和小鼠igg2a fc、接头ggggsggggsggggs、小鼠抗cd20重链可变区序列、接头ggggsggggsggggsggggs和小鼠抗cd20轻链可变区序列组成。
[0422]
[seq283]由含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的小鼠il-12p40(β)区序列、接头ggggsggggsggggs、小鼠il-12p35(α)区序列、接头ggggsggggs和小鼠igg2a fc、接头ggggsggggsggggs、小鼠抗cd20重链可变区序列、接头ggggsggggsggggsggggs和小鼠抗cd20轻链可变区序列组成。
[0423]
t2.01m(seq22，seq23，seq24)是一种双特异性抗体，其中靶向cd20蛋白的小鼠抗
cd20序列和小鼠il-12序列形成杵臼结构。
[0424]
t2.02m(seq22，seq23，seq25)是一种双特异性抗体，其中靶向cd20蛋白的小鼠抗cd20序列和含有参与肝素结合的氨基酸突变(两个)的小鼠il-12序列形成杵臼结构。
[0425]
t2.03m(seq22，seq23，seq26)是一种双特异性抗体，其中靶向cd20蛋白的小鼠抗cd20序列和含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的小鼠il-12序列形成杵臼结构。
[0426]
t2.04m(seq24，seq27，seq28)是一种双特异性抗体，其中双可变结构域免疫球蛋白(dvd-ig)形式的小鼠抗cd20序列和小鼠il-12序列形成杵臼结构。
[0427]
t2.05m(seq26，seq27，seq28)是一种双特异性抗体，其中双可变结构域免疫球蛋白(dvd-ig)形式的小鼠抗cd20序列和含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的小鼠il-12序列形成杵臼结构。
[0428]
t2.06m(seq23，seq24，seq29)是一种双特异性抗体，其中靶向cd20蛋白的单链可变片段(scfv)与重链的c末端连接的小鼠抗cd20序列和小鼠il-12序列形成杵臼结构。
[0429]
t2.07m(seq23，seq26，seq29)是一种双特异性抗体，其中靶向cd20蛋白的单链可变片段(scfv)与重链的c末端连接的小鼠抗cd20序列和含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的小鼠il-12序列形成杵臼结构。
[0430]
t2.08m(seq22，seq24，seq30)是一种双特异性抗体，其中靶向cd20蛋白的单链可变片段(scfv)与轻链的c末端连接的小鼠抗cd20序列和小鼠il-12序列形成杵臼结构。
[0431]
t2.09m(seq22，seq26，seq30)是一种双特异性抗体，其中靶向cd20蛋白的单链可变片段(scfv)与轻链的c末端连接的小鼠抗cd20序列和含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的小鼠il-12序列形成杵臼结构。
[0432]
t2.10m(seq22，seq23，seq31)是一种抗体，其中靶向cd20蛋白的小鼠抗cd20序列和其中小鼠il-12序列与重链的c末端连接的小鼠抗cd20序列形成杵臼结构。
[0433]
t2.11m(seq22，seq23，seq32)是一种抗体，其中靶向cd20蛋白的小鼠抗cd20序列和其中含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的小鼠il-12序列与重链的c末端连接的小鼠抗cd20序列形成杵臼结构。
[0434]
t2.12m(seq23，seq33，seq35)是一种双特异性抗体，其中靶向cd20蛋白的小鼠抗cd20序列与含有参与肝素结合的氨基酸突变(两个)的小鼠il-12序列形成杵臼结构，并去除效应子功能。
[0435]
t2.13m(seq34，seq40)是一种抗体，其中仅具有小鼠il-12序列的杵臼结构的效应子功能被去除。
[0436]
t2.14m(seq35，seq40)是一种抗体，其中仅具有含有参与肝素结合的氨基酸突变(两个)的小鼠il-12序列的杵臼结构的效应子功能被去除。
[0437]
t2.15m(seq36)是一种fc融合蛋白，其仅具有含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的小鼠il-12序列。
[0438]
t2.16m(seq25，seq37，seq38)是一种双特异性抗体，其中靶向fap蛋白的小鼠抗fap序列与含有参与肝素结合的氨基酸突变(两个)的小鼠il-12序列形成杵臼结构。
[0439]
t2.17m(seq38，seq39，seq41)是一种抗体，其中仅具有靶向fap蛋白的小鼠抗fap序列的杵臼结构的效应子功能被去除。
[0440]
18b12(seq23，seq42)是一种靶向cd20蛋白的小鼠抗cd20(18b12)抗体。
[0441]
t2.18m(seq22，seq23，seq278)是一种双特异性抗体，其中小鼠抗cd20序列和其中小鼠抗cd20序列的单链可变片段(scfv)与c末端连接的小鼠il-12序列形成杵臼结构。
[0442]
t2.19m(seq22，seq23，seq279)是一种双特异性抗体，其中小鼠抗cd20重链序列和其中小鼠抗cd20序列的单链可变片段(scfv)与c末端连接的含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的小鼠il-12序列形成杵臼结构。
[0443]
t2.20m(seq23，seq280)是一种含有小鼠抗cd20序列的fc融合蛋白二聚体，其中小鼠il-12序列与重链的c末端相连。
[0444]
t2.21m(seq23，seq281)是一种含有小鼠抗cd20序列的fc融合蛋白二聚体，其中含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的小鼠il-12序列与重链的c末端相连。
[0445]
t2.22m(seq282)是一种含有小鼠il-12序列的fc融合蛋白二聚体，其中小鼠抗cd20序列的单链可变片段(scfv)与c末端相连。
[0446]
t2.23m(seq283)是一种由含有参与肝素结合的氨基酸突变(四个)的小鼠il-12序列组成的fc融合蛋白二聚体，其中小鼠抗cd20序列的单链可变片段(scfv)与c末端相连。
[0447]
[seq22]抗-mu cd20 hc mu igg2a fc杵
[0448]
qvqlqqpgaelvrpgtsvklsckasgytftsywmhwikqrpgqglewigvidpsdnytkynqkfkgkatltvdtssstaymqlssltsedsavyfcaregyygsspwfaywgqgtlvtvssakttapsvyplapvcgdttgssvtlgclvkgyfpepvtltwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvtsstwpsqsitcnvahpasstkvdkkieprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvdvseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredynstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtlwcmvtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmysklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgk
[0449]
[seq23]抗-mu cd20 lc
[0450]
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[0451]
[seq24]mu scil-12-mu igg2a fc臼
[0452]
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[0453]
[seq25]mu scil-12mut1-mu igg2a fc臼
[0454]
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[0455]
[seq26]mu scil-12mut2-mu igg2a fc臼
[0456]
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[0457]
[seq27](抗-mu cd20 vh)2-mu igg2a fc杵
[0458]
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[0459]
[seq28](抗-mu cd20 vl)2
[0460]
qivmsqspailsaspgekvtmtcrarssvsyihwyqqkpgsspkpwiyatsnlasgvpgrfsgsgsgtsysltitrveaedaatyycqqwsskpptfgggtkleikggggsggggsggggsqivmsqspailsaspgekvtmtcrarssvsyihwyqqkpgsspkpwiyatsnlasgvpgrfsgsgsgtsysltitrveaedaatyycqqwsskpptfgggtkleikrtdaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec
[0461]
[seq29]抗-mu cd20 hc mu igg2a fc杵-抗-mu cd20 scfv
[0462]
qvqlqqpgaelvrpgtsvklsckasgytftsywmhwikqrpgqglewigvidpsdnytkynqkfkgkatltvdtssstaymqlssltsedsavyfcaregyygsspwfaywgqgtlvtvssakttapsvyplapvcgdttgssvtl
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[0463]
[seq30]抗-mu cd20 lc-抗-mu cd20 scfv
[0464]
qivmsqspailsaspgekvtmtcrarssvsyihwyqqkpgsspkpwiyatsnlasgvpgrfsgsgsgtsysltitrveaedaatyycqqwsskpptfgggtkleikrtdaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnecggggsggggsggggsqvqlqqpgaelvrpgtsvklsckasgytftsywmhwikqrpgqglewigvidpsdnytkynqkfkgkatltvdtssstaymqlssltsedsavyfcaregyygsspwfaywgqgtlvtvssggggsggggsggggsggggsqivmsqspailsaspgekvtmtcrarssvsyihwyqqkpgsspkpwiyatsnlasgvpgrfsgsgsgtsysltitrveaedaatyycqqwsskpptfgggtkleik
[0465]
[seq31]抗-mu cd20 hc mu igg2a fc臼-mu scil-12
[0466]
qvqlqqpgaelvrpgtsvklsckasgytftsywmhwikqrpgqglewigvidpsdnytkynqkfkgkatltvdtssstaymqlssltsedsavyfcaregyygsspwfaywgqgtlvtvssakttapsvyplapvcgdttgssvtlgclvkgyfpepvtltwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvtsstwpsqsitcnvahpasstkvdkkieprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvdvseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredynstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtlscavtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmvsklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgkggggsggggsggggsmwelekdvyvvevdwtpdapgetvnltcdtpeedditwtsdqrhgvigsgktltitvkefldagqytchkggetlshshlllhkkengiwsteilknfknktflkceapnysgrftcswlvqrnmdlkfnikssssspdsravtcgmaslsaekvtldqrdyekysvscqedvtcptaeetlpielalearqqnkyenystsffirdiikpdppknlqmkplknsqvevsweypdswstphsyfslkffvriqrkkekmketeegcnqkgaflvektstevqckggnvcvqaqdryynsscskwacvpcrvrsggggsggggsggggsrvipvsgparclsqsrnllkttddmvktareklkhysctaedidheditrdqtstlktclplelhknesclatretssttrgsclppqktslmmtlclgsiyedlkmyqtefqainaalqnhnhqqiildkgmlvaidelmqslnhngetlrqkppvgeadpyrvkmklcillhafstrvvtinrvmgylssa
[0467]
[seq32]抗-mu cd20 hc mu igg2a fc臼-mu scil-12mut2
[0468]
qvqlqqpgaelvrpgtsvklsckasgytftsywmhwikqrpgqglewigvidpsdnytkynqkfkgkatltvdtssstaymqlssltsedsavyfcaregyygsspwfaywgqgtlvtvssakttapsvyplapvcgdttgssvtlgclvkgyfpepvtltwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvtsstwpsqsitcnvahpasstkvdkkieprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvdvseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredynstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtlscavtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmvsklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgkggggsggggsggggsmwelekdvyvvevdwtpdapgetvnltcdtpeedditwtsdqrhgvigsgktltitvkefldagqytchkggetlshshlllhkkengiwsteilknfknktflkceapnysgrftcswlvqrnmdlkfnikssssspdsra
vtcgmaslsaekvtldqrdyekysvscqedvtcptaeetlpielalearqqnkyenystsffirdiikpdppknlqmkplknsqvevsweypdswstphsyfslkffvriqaaaekmaeteegcnqkgaflvektstevqckggnvcvqaqdryynsscskwacvpcrvrsggggsggggsggggsrvipvsgparclsqsrnllkttddmvktareklkhysctaedidheditrdqtstlktclplelhknesclatretssttrgsclppqktslmmtlclgsiyedlkmyqtefqainaalqnhnhqqiildkgmlvaidelmqslnhngetlrqkppvgeadpyrvkmklcillhafstrvvtinrvmgylssa
[0469]
[seq33]抗-mu cd20 hc mu igg2a fc杵dang
[0470]
qvqlqqpgaelvrpgtsvklsckasgytftsywmhwikqrpgqglewigvidpsdnytkynqkfkgkatltvdtssstaymqlssltsedsavyfcaregyygsspwfaywgqgtlvtvssakttapsvyplapvcgdttgssvtlgclvkgyfpepvtltwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvtsstwpsqsitcnvahpasstkvdkkieprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvavseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredygstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtlwcmvtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmysklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgk
[0471]
[seq34]mu scil-12-mu igg2a fc臼dang
[0472]
mwelekdvyvvevdwtpdapgetvnltcdtpeedditwtsdqrhgvigsgktltitvkefldagqytchkggetlshshlllhkkengiwsteilknfknktflkceapnysgrftcswlvqrnmdlkfnikssssspdsravtcgmaslsaekvtldqrdyekysvscqedvtcptaeetlpielalearqqnkyenystsffirdiikpdppknlqmkplknsqvevsweypdswstphsyfslkffvriqrkkekmketeegcnqkgaflvektstevqckggnvcvqaqdryynsscskwacvpcrvrsggggsggggsggggsrvipvsgparclsqsrnllkttddmvktareklkhysctaedidheditrdqtstlktclplelhknesclatretssttrgsclppqktslmmtlclgsiyedlkmyqtefqainaalqnhnhqqiildkgmlvaidelmqslnhngetlrqkppvgeadpyrvkmklcillhafstrvvtinrvmgylssaggggsggggseprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvavseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredygstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtlscavtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmvsklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgk
[0473]
[seq35]mu scil-12mut1-mu igg2a fc臼dang
[0474]
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[0475]
[seq36]mu scil-12mut2-mu igg2a fc
[0476]
mwelekdvyvvevdwtpdapgetvnltcdtpeedditwtsdqrhgvigsgktltitvkefldagqytchkggetlshshlllhkkengiwsteilknfknktflkceapnysgrftcswlvqrnmdlkfnikssssspdsravtcg
maslsaekvtldqrdyekysvscqedvtcptaeetlpielalearqqnkyenystsffirdiikpdppknlqmkplknsqvevsweypdswstphsyfslkffvriqaaaekmaeteegcnqkgaflvektstevqckggnvcvqaqdryynsscskwacvpcrvrsggggsggggsggggsrvipvsgparclsqsrnllkttddmvktareklkhysctaedidheditrdqtstlktclplelhknesclatretssttrgsclppqktslmmtlclgsiyedlkmyqtefqainaalqnhnhqqiildkgmlvaidelmqslnhngetlrqkppvgeadpyrvkmklcillhafstrvvtinrvmgylssaggggsggggseprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvdvseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredynstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtltcmvtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmysklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgk
[0477]
[seq37]抗-mu fap hc mu igg2a fc杵
[0478]
qvqlqqsgaelarpgasvnlsckasgytftnnginwlkqrtgqglewigeiyprstntlynekfkgkatltadrssntaymelrsltsedsavyfcartltapfafwgqgtlvtvsaakttapsvyplapvcgdttgssvtlgclvkgyfpepvtltwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvtsstwpsqsitcnvahpasstkvdkkieprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvdvseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredynstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtlwcmvtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmysklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgk
[0479]
[seq38]抗-mu fap lc
[0480]
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[0481]
[seq39]抗-mu fap hc mu igg2a fc杵dang
[0482]
qvqlqqsgaelarpgasvnlsckasgytftnnginwlkqrtgqglewigeiyprstntlynekfkgkatltadrssntaymelrsltsedsavyfcartltapfafwgqgtlvtvsaakttapsvyplapvcgdttgssvtlgclvkgyfpepvtltwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvtsstwpsqsitcnvahpasstkvdkkieprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvavseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredygstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtlwcmvtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmysklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgk
[0483]
[seq40]mu igg2a fc杵dang
[0484]
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[0485]
[seq41]mu igg2a fc臼dang
[0486]
eprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvavseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredygstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtlscavtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmvsklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgk
[0487]
[seq42]抗-mu cd20(18b12)hc
[0488]
qvqlqqpgaelvrpgtsvklsckasgytftsywmhwikqrpgqglewigvidpsdnytkynqkfkgkat
ltvdtssstaymqlssltsedsavyfcaregyygsspwfaywgqgtlvtvssakttapsvyplapvcgdttgssvtlgclvkgyfpepvtltwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvtsstwpsqsitcnvahpasstkvdkkieprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvdvseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredynstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtltcmvtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmysklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgk
[0489]
[seq278]mu scil-12-mu igg2a fc臼-抗-mu cd20 scfv
[0490][0491]
[seq279]mu scil-12mut2-mu igg2a fc臼-抗-mu cd20 scfv
[0492][0493]
[seq280]抗-mu cd20 hc mu igg2a fc-mu scil-12
[0494][0495]
[seq281]抗-mu cd20 hc mu igg2a fc-mu scil-12mut2
[0496][0497]
[seq282]mu scil-12-mu igg2a fc-抗-mu cd20 scfv
[0498][0499]
[seq283]mu scil-12mut2-mu igg2a fc-抗-mu cd20 scfv
[0500][0501]
制造例1.融合蛋白的制造
[0502]
试剂和设备如下表3和表4所示。
[0503]
【表3】
[0504][0505]
【表4】
[0506]
设备和工具生产商型号名称生物安全柜nuairelabgard class
±
离心机eppendorf5424凝胶成像系统tanon2500r
[0507]
合成的dna片段通过pcr扩增，pcr产物用凝胶纯化。ptt5载体被限制性内切酶ecori和bamhi切割，然后纯化凝胶。使用in-fusion试剂盒连接每个pcr产物和线性载体。将产生的载体转化入ecos101 dh5α感受态细胞，并将细胞培养在含有100μg/ml氨苄青霉素的2
×
yt琼脂平板上。所有操作过程均根据标准转化方法执行。通过菌落pcr鉴定阳性重组体，并对重组质粒进行序列验证测序。选择单个菌落，并将菌种培养物接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的5ml2
×
yt培养基中。在37℃下振荡培养8小时。
[0508]
此后，将菌种培养物以1:1000的比例稀释在200ml选择性2
×
yt培养基中。在37℃下振荡培养16小时。通过在4℃、4700rpm下离心10分钟收获细菌细胞。将细菌沉淀重悬于12ml的res-ef缓冲液中。此后，加入12ml的lys-ef缓冲液，将密封管用力翻转以充分混合，然后在室温下孵育5分钟。向裂解物中加入12ml的neu-ef缓冲液并用力翻转以充分快速地混合。
[0509]
在将裂解物注入xtra柱过滤器之前，通过将裂解液管翻转3次来制备沉淀物的均匀悬浮液，以防止过滤器堵塞。此后，用10ml过滤器洗涤缓冲液fil-ef洗涤xtra柱过滤器和xtra柱。通过拉出或翻转柱来去除xtra柱过滤器。用90ml洗涤缓冲液endo洗涤xtra柱。
[0510]
用45ml洗涤缓冲液wash-ef洗涤xtra柱。用15ml洗脱缓冲液elu洗脱质粒dna。将洗脱液收集在50ml离心管中。在室温下加入10.5ml异丙醇以沉淀洗脱的质粒dna。涡旋后，将混合物静置2分钟。
[0511]
此后，向沉淀中加入5ml的70％乙醇。使用移液器吸头小心地将乙醇完全从管中除去。将沉淀在室温(20℃)下干燥。此后，用1000μl的h2o溶解dna沉淀。
[0512]
制造例2.细胞转染和蛋白质表达
[0513]
制造例2.1.细胞转染
[0514]
使用的材料和试剂如下表5所示。
[0515]
【表5】
[0516][0517]
将含有完整培养基的293f菌种保持在130rpm、37℃和8％co2的振荡培养箱中。以0.3至0.4
×
106细胞/ml的密度培养，每2至3天更换培养基。在转染前24小时，以新的传代数为2.6
×
106细胞/ml制备293f细胞。将制备好的细胞置于振荡培养箱中在130rpm、37℃和8％co2的条件下培养。转染当天，使用新鲜培养基将细胞密度调节至5.0
×
106细胞/ml的密度。在3l摇瓶中以1l的总体积进行。用50ml的opti mem i稀释0.4mg的hc和0.6mg的lc质粒，并通过0.22μm过滤器过滤。此后，用50ml的opti mem i稀释2mg的pei以制备转染试剂。
[0518]
将稀释的pei加入dna混合物中，然后立即混合。此后，在室温下培养15分钟。将dna-pei混合物加入到以2.6
×
106细胞/ml制备的293f细胞中。此后，将细胞置于振荡培养箱中在130rpm、37℃和8％co2的条件下连续培养24小时。转染24小时后，将10％蛋白胨加入到1/20的培养液中，使终浓度为0.5％。此后，将细胞置于振荡培养箱中在130rpm、37℃和8％co2的条件下连续培养。在转染后2至5天内每天测量和记录细胞密度/活力。在转染后7天或细胞活力低于70％时收获细胞进行纯化。
[0519]
制造例2.2.蛋白质纯化
[0520]
用于蛋白质纯化的试剂、缓冲液组成和设备如下表6至表8所示。
[0521]
【表6】
[0522]
试剂生产商产品目录#mabselect surege healthcare11003493trissigma77-86-1氯化钠acros organivs7647-14-5柠檬酸钠adamas-beta76198b柠檬酸general-reagentg83162b精氨酸vetecv900343-500g琥珀酸sigma-aldrichs9512-500gtriton x-100abconex10010-1ltriton x-114sigma-aldrichx114millex-gp无菌过滤装置0.22μmmilliporeslgp033rs氢氧化钠merckb146369740
[0523]
【表7】
[0524][0525]
【表8】
[0526][0527][0528]
使用mabselect sure柱纯化蛋白质。具体地，通过在2000
×
g、4℃下离心20分钟收获上清液。此后，用sartopore 2过滤器过滤上清液。用缓冲液a平衡的5ml mabselect sure柱上样澄清的上清液。此后，用缓冲液a洗涤柱，直到a280吸光度达到基线。用10cv缓冲液b洗涤柱。用10cv缓冲液a洗涤柱。结合的蛋白质用6cv缓冲液c洗脱，并加入1/6体积的缓冲液d以中和洗脱的物质。进行sds-page和sec-hplc分析。
[0529]
此后，使用hic柱纯化蛋白质。然后将蛋白质在4℃下用缓冲液e透析过夜。用缓冲液e平衡的hic柱上样上清液。此后，用缓冲液e洗涤柱，直到a280吸光度达到基线。结合的蛋白质通过梯度洗脱(10cv缓冲液f 0％-40％)洗脱。结合的蛋白质用2cv 100％缓冲液f洗
脱。进行sds-page分析。
[0530]
将纯化的蛋白质混合，然后将蛋白质在4℃下用终缓冲液透析过夜。此后，进行sds-page和sec-hplc分析。
[0531]
结果，如图1至图6所示，发现一个实施方案的人蛋白和小鼠蛋白被纯化。
[0532]
制造例3.优化双特异性抗体的产生
[0533]
制造例3.1.鉴定包含人il-12的融合蛋白产生的优化
[0534]
下表9显示了根据人il-12突变产生的人抗cd20/il-12双特异性抗体的变化。括号表示蛋白质的生产规模，单位为l。括号前面的数字是将纯化蛋白质的量除以生产规模获得的每升产量。
[0535]
【表9】
[0536][0537]
如上表9所示，随着人il-12p40(β)区中参与肝素结合的氨基酸突变数量的增加，通过蛋白a柱(mabselect sure柱)纯化的蛋白量增加。结果发现，与t2.01相比，第280和第285位氨基酸的赖氨酸(k)突变为丙氨酸(a)的双特异性抗体t2.02的产量有所提高。结果发现，与t2.01相比，第280、282、285和286位氨基酸的赖氨酸(k)突变为丙氨酸(a)的双特异性抗体t2.03的产量提高了约1.5倍。
[0538]
制造例3.2.鉴定包含小鼠il-12的融合蛋白产生的优化
[0539]
下表10显示了根据小鼠il-12突变产生的小鼠抗cd20/il-12双特异性抗体的变化。
[0540]
【表10】
[0541][0542]
如上表10所示，随着小鼠il-12p40(β)区中参与肝素结合的氨基酸突变数量的增加，通过蛋白a柱(mabselect sure柱)纯化的蛋白量增加。
[0543]
在每个表中，通过将总蛋白质产量除以生产规模来比较通过蛋白a柱后的蛋白量。结果发现，与t2.01m相比，第277和第282位氨基酸的赖氨酸(k)突变为丙氨酸(a)的双特异性抗体t2.02m的产量有所提高。此外，结果发现，与t2.01m和t2.02m相比，第276位氨基酸的精氨酸(r)突变为丙氨酸(a)以及第277、278和282位氨基酸的赖氨酸(k)突变为丙氨酸(a)的双特异性抗体t2.03m的蛋白质产量有所提高。此外，还发现，与使用hek293细胞系相比，使用cho细胞系的t2.03m产量提高了约3倍。
[0544]
制造例4.细胞系和细胞系培养
[0545]
人b细胞淋巴瘤细胞系raji、人b细胞淋巴瘤细胞系ramos、人t谱系细胞系jurkat和小鼠b细胞淋巴瘤细胞系a20从atcc(美国模式培养物集存库，美国弗吉尼亚州马纳萨斯)获得。将raji细胞、ramos细胞和jurkat细胞保存在含有10％fbs(gibco)的rpmi-1640(gibco，美国纽约州格兰德岛)中。将a20细胞保存在含有10％fbs(gibco)和0.05mm 2-巯基乙醇的rpmi-1640(gibco)中。
[0546]
hek-blue il-12细胞系经il-12受体基因和stat4诱导seap报告基因转化为hek293细胞，即人胚胎肾成纤维细胞，从invivogen(美国圣地亚哥)获得。
[0547]
将hek-blue il-12细胞保存在含有10％fbs(gibco)、100μg/ml normocin和1
×
hek-blue的dmem(gibco)选择性培养基中。
[0548]
制造例5.人类免疫细胞的分离和活化
[0549]
经机构审查委员会(irb)批准，从韩国红十字会获得了血液包，分离并冷冻了外周血单核细胞(pbmc)。对解冻的pbmc进行阳性选择方法，并用easy sep(干细胞，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华)试剂盒分离人单核细胞。通过树突状细胞培养试剂盒(干细胞)方法用5天将分离出的单核细胞分化为未成熟树突状细胞。通过树突状细胞培养试剂盒(干细胞)方法用5天使未成熟树突状细胞成熟。
[0550]
对解冻的pbmc进行阴性选择方法，并用easy sep(干细胞)试剂盒分离人t细胞。将人t细胞培养在涂有1μg/ml抗cd3(okt3，invitrogen)的平板上并活化72小时。将人t细胞保存在含有10％fbs(gibco)的rpmi-1640(gibco)中。
[0551]
实施例1.鉴定融合蛋白的结合亲和力
[0552]
实施例1.1.鉴定融合蛋白与重组人cd20的结合
[0553]
通过表面等离子体共振(spr)鉴定了t2.01和t2.02与重组人cd20的结合。
[0554]
具体地，用50nm nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)和200nm edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)的1:1混合物活化cm5芯片的表面，并以10μl/min的速率固定25μg/ml抗人igg(fc)抗体400秒。剩余的活性酯基团用1m乙醇胺封闭。将t2.01和t2.02稀释至2μg/ml，并在用抗人igg(fc)抗体固定的cm5芯片上反应。将重组人cd20在1
×
hbs-ep+缓冲溶液中稀释至200nm，并通过连续稀释进行稀释。稀释的重组人cd20以30μl/min的速率反应。结合和解离时间分别为180秒和400秒。解离后，稳定60秒，然后用10mm甘氨酸ph 1.5溶液以30μl/min的速率再生30秒。
[0555]
结果，如图7所示，发现t2.01和t2.02可以特异性结合重组人cd20。
[0556]
此外，通过表面等离子体共振鉴定了t2.04、t2.05、t2.06、t2.07、t2.08、t2.09、t2.10和t2.11与重组人cd20的结合。将t2.04、t2.05、t2.06、t2.07、t2.08、t2.09、t2.10和t2.11分别稀释至15μg/ml、2μg/ml、2μg/ml、2μg/ml、10μg/ml、2μg/ml、20μg/ml和20μg/ml，并在用蛋白a固定的芯片上反应。将重组人cd20在1
×
hbs-ep+、0.05％ddm(洗涤剂十二烷基麦芽糖苷)、0.01％chs(胆固醇琥珀酸单酯)缓冲溶液中稀释至100nm或200nm，并通过连续稀释进行稀释。稀释的重组人cd20以30μl/min的速率反应。结合和解离时间分别为180秒和400秒。解离后，稳定60秒，然后用10mm甘氨酸ph 1.5溶液以30μl/min的速率再生30秒。
[0557]
结果，如图29至30所示，发现t2.04、t2.05、t2.06、t2.07、t2.08、t2.09、t2.10和t2.11可以与重组人cd20结合，以特异性靶向cd20。
1640中，每25μl进行等分。
[0582]
(ii)以250μg/ml的浓度将利妥昔单抗、t2.01、t2.02和t2.12悬浮在含有4％低igg血清的rpmi-1640中，并通过连续稀释进行稀释。稀释的利妥昔单抗、t2.01、t2.02和t2.12每25μl进行等分。
[0583]
(iii)以3
×
106细胞/ml的浓度将效应细胞悬浮在含有4％低igg血清的rpmi-1640中，每25μl进行等分。
[0584]
(iv)细胞培养6小时后，用bioglo
tm
荧光素酶检测试剂(promega)处理细胞，并测量发光值(相对发光单位(rlu))。
[0585]
结果，如图11所示，用抗cd20单克隆抗体的利妥昔单抗处理的样品显示出高抗体依赖性细胞毒性，50％有效浓度(ec50)为31.1μg/ml，而用t2.01处理的样品显示出低抗体依赖性细胞毒性，ec50为5.3
×
103μg/ml，用t2.02处理的样品显示出低抗体依赖性细胞毒性，ec50为6.7
×
103μg/ml。用对照t2.12处理的样品由于fc部分的突变而没有效应功能，未显示出抗体依赖性细胞毒性。
[0586]
实施例2.鉴定融合蛋白诱导信号传导的能力
[0587]
实施2.1.鉴定il-12识别细胞中的信号传导能力
[0588]
考虑到已知当il-12与il-12受体结合时，il-12通过诱导信号介质stat4(信号传导及转录激活因子4)的磷酸化来启动信号传导，评估了一个实施方案的融合蛋白在表达il-12受体的il-12识别细胞中的信号传导能力。
[0589]
具体地，将hek-blue il-12细胞系(il-12识别细胞)稀释至2.8
×
105细胞/ml，并以180μl/孔分配。将重组人il-12、t2.01m、t2.02m、t2.03m和18b12以4nm悬浮并通过连续稀释进行稀释。hek-blue il-12细胞用稀释的重组人il-12、t2.01m、t2.02m、t2.03m和18b12处理。处理24小时后，收集细胞上清液并与quanti-blue溶液(invivogen)在96孔板中混合。使用分光光度计(thermo fisher)在620nm处测量报告基因表达水平。
[0590]
结果，如图12所示，通过620nm吸光度鉴定出在重组人il-12、t2.01m、t2.02m和t2.03m的情况下，il-12被识别，并且stat4通过磷酸化表达报告基因。此外，当用18b12处理il-12识别细胞时，发现18b12不识别il-12。这些结果表明，一个实施方案的融合蛋白特异性结合il-12受体以诱导信号传导。
[0591]
实施例2.2.鉴定人t细胞中的信号传导能力
[0592]
鉴定了当il-12与人t细胞的il-12受体结合时，il-12是否通过诱导信号介质stat4的磷酸化来启动信号传导。
[0593]
具体地，通过使用alphalisasurefire ultra p-stat4(tyr693)检测试剂盒(perkinelmer，美国马萨诸塞州)分析用抗cd3(okt3，invitrogen)激活的人t细胞来鉴定人t细胞中的信号传导能力。将重组人il-12、t2.01、t2.02和t2.17以100ng/ml悬浮，并通过连续稀释进行稀释。活化的人t细胞用稀释的重组人il-12、t2.01、t2.02和t2.17处理。处理2小时后，裂解细胞并用检测p-stat4(磷酸化stat4)的试剂(perkinelmer)处理。用分光光度计在680nm的激发波长和615nm的发射波长下检测p-stat4。
[0594]
结果，如图13所示，用重组人il-12处理的样品显示出50％有效浓度(ec50)为0.1946ng/ml，用t2.01处理的样品显示出ec50为0.5547ng/ml，用t2.02处理的样品显示出ec50为1.555ng/ml。通过ec50比较发现，由于il-12突变，t细胞信号传导能力减弱。在用
t2.17处理的样品中未鉴定出磷酸化的stat4。这些结果表明，il-12突变减弱了t细胞信号传导能力。
[0595]
实施例3.鉴定融合蛋白的细胞因子分泌能力
[0596]
实施例3.1.用于细胞因子检测的酶联免疫吸附测定
[0597]
对于细胞因子检测，对储存在-20℃下的上清液进行酶联免疫吸附测定(elisa，r&dsystems)，步骤如下：
[0598]
(i)根据分析证书(coa)稀释捕获抗体，并在96孔板上包被24小时。
[0599]
(ii)用洗涤溶液洗涤孔，然后用1％bsa(牛血清白蛋白，sigma)溶液封闭1小时。
[0600]
(iii)用洗涤溶液洗涤孔，然后对样品处理2小时。
[0601]
(iv)用洗涤溶液洗涤孔，然后根据分析证书稀释检测抗体并等分到孔中，然后用其处理孔2小时。
[0602]
(v)用洗涤溶液洗涤孔，然后用链霉亲和素-hrp处理20分钟。
[0603]
(vi)用洗涤溶液洗涤孔，然后用底物溶液处理20分钟。
[0604]
(vii)用终止溶液处理孔，并在450nm处测量吸光度。
[0605]
实施例3.2.鉴定人t细胞中的细胞因子分泌能力
[0606]
考虑到ifn-γ(干扰素-γ)分泌是一种主要的免疫反应，当人t细胞用il-12处理时会发生ifn-γ分泌，当人t细胞用重组人il-12、利妥昔单抗、t2.01、t2.02和t2.03处理时，通过酶联免疫吸附测定评估细胞上清液中的ifn-γ分泌能力。
[0607]
具体地，将用抗cd3(okt3，invitrogen)激活的人t细胞稀释至5
×
105细胞/ml，并以200μl/孔分配在96孔板中。将重组人il-12、利妥昔单抗、t2.01、t2.02和t2.03稀释至10nm并以20μl/孔分配。用重组人il-12、利妥昔单抗、t2.01、t2.02和t2.03各250pm处理。处理48小时后，收集细胞上清液，并于-80℃下储存样品。
[0608]
结果，如图14所示，发现用重组人il-12处理的样品具有平均1640pg/ml的ifn-γ，用t2.01处理的样品具有平均1170pg/ml的ifn-γ，用t2.02处理的样品具有平均956ng/ml的ifn-γ，用t2.03处理的样品具有平均662pg/ml的ifn-γ。发现用利妥昔单抗处理的样品不具有ifn-γ。这些结果表明，t2.01、t2.02和t2.03作用于人t细胞，以诱导ifn-γ分泌。
[0609]
实施例3.3.通过混合淋巴细胞反应试验鉴定细胞因子分泌能力
[0610]
鉴定了当通过混合人t细胞和同系树突状细胞诱导人工同源免疫反应时，融合蛋白是否诱导细胞因子分泌。通过酶联免疫吸附测定评估细胞上清液中的ifn-γ浓度。
[0611]
具体地，将成熟人树突状细胞稀释至4
×
105细胞/ml，并以50μl/孔分配在96孔板中。将来自不同献血者的人t细胞用抗cd3抗体激活，稀释至2
×
106细胞/ml，以100μl/孔分配，并与分配的成熟人树突状细胞混合(混合淋巴细胞反应，mlr)。将利妥昔单抗、t2.01和t2.02稀释至1μm，并以50μl/孔分配。混合培养5天后，收集细胞上清液，并于-80℃下储存样品。
[0612]
结果，如图15所示，发现用t2.01处理的样品具有平均487pg/ml的ifn-γ，用t2.02处理的样品具有平均587pg/ml的ifn-γ。相比之下，发现用利妥昔单抗处理的样品不具有ifn-γ。这些结果表明，t2.01和t2.02在混合淋巴细胞免疫反应期间诱导ifn-γ分泌。
[0613]
实施例4.同系小鼠模型中的抗癌功效评价
[0614]
实施例4.1.同系小鼠模型的建立和抗癌功效评价
[0615]
在机构动物护理和使用委员会(iacuc，crownbio，美国)的批准下于体内进行。从上海灵畅生物科技有限公司(中国上海)获得6周龄雌性balb/c小鼠。将a20细胞以5
×
105细胞/100μl的浓度悬浮在pbs(磷酸盐缓冲盐水，gibco)中，然后将5
×
105个细胞皮下注射到小鼠的右胁中。
[0616]
当肿瘤大小达到100mm3时，将小鼠随机分组。每隔3天腹腔注射100μg t2.01m、50μg t2.02m、100μg t2.02m和300μg t2.02m3次。化疗组每隔一周腹腔注射chop1(100mg/kg环磷酰胺、6mg/kg阿霉素、0.1mg/kg长春新碱、0.2mg/kg地塞米松)1次，腹腔注射chop2(50mg/kg环磷酰胺、3mg/kg阿霉素、0.1mg/kg长春新碱、0.2mg/kg地塞米松)两次。每组使用10只小鼠。每周测量两次肿瘤大小和体重。抗癌活性评估两个月。
[0617]
结果，如图16和17所示，在第一次腹腔注射后第20天，发现用50μg/ml t2.02m处理的组显示出43％(3/7)，用100μg/mlt2.02m处理的组显示出100％(7/7)，用300μg/mlt2.02m处理的组显示出100％(7/7)的完全缓解(cr)，表明t2.02m具有优异的抗癌作用。结果发现，用100μg/mlt2.01m处理的组显示出86％(6/7)的cr。另一方面，发现接受chop1治疗的化疗组显示出28.5％(2/7)的cr，而接受chop2治疗的化疗组未显示出cr。
[0618]
此外，腹腔注射t2.01m、t2.02m、chop1和chop2，副作用表现为体重变化。
[0619]
结果，如图18所示，未观察到由于腹腔注射t2.01m、t2.02m、chop1和chop2而导致的体重变化。这些结果表明，一个实施方案的融合蛋白进行腹腔注射后没有副作用。
[0620]
接下来，为了比较一个实施方案的融合蛋白和化疗组的抗癌效果，在腹腔注射t2.01m、t2.02m、chop1和chop2后第9天，将每组3只动物的肿瘤组织与其分开，并比较每组的相对肿瘤组织重量。
[0621]
具体地，根据iacuc规定，在实验组中通过治疗法第一次腹腔注射后第9天，从每组3只动物中收获肿瘤组织。将收获的肿瘤组织在电子天平上称重。使用肿瘤解离试剂盒(miltenyi，德国)从肿瘤组织中分离免疫细胞。使用抗小鼠cd45抗体(biolegend)、抗小鼠cd3抗体(bd)、抗小鼠cd4抗体(biolegend)、抗小鼠cd8抗体(ebioscience)、抗小鼠cd19抗体(biolegend)、抗小鼠cd49/b(biolegend)、活/死(ebioscience)和计数微珠(ebioscience)对细胞进行染色。使用bd lsr测量染色细胞的表达速率，并使用flowjo软件进行分析。
[0622]
结果，如图19所示，发现肿瘤组织重量随腹腔注射t2.02m剂量的增加而减少。这些结果表明，抗癌效果与t2.02m的剂量成正比。
[0623]
此外，通过分析肿瘤组织中免疫细胞的分布，鉴定了上述作用是否是由于融合蛋白激活免疫细胞而引起的抗癌作用。
[0624]
结果，如图20所示，当用t2.02m的治疗组与对照组、chop1的化疗组和chop2的化疗组进行比较时，发现cd3+cd4+t细胞或cd3+cd8+t细胞的分布没有差异，但免疫细胞的绝对数量存在差异。这些结果表明，上述结果是由于效应细胞的渗透增加了t2.02m而具有抗癌作用。
[0625]
实施例4.2.肿瘤再激发模型中肿瘤再激发抑制的评价
[0626]
使用达到完全缓解的小鼠进行肿瘤再激发。
[0627]
诱导小鼠肿瘤再激发模型，其中通过用t2.02m处理移植有a20细胞的同系小鼠来实现完全缓解(cr)。
[0628]
具体地，以5
×
105细胞/100μl的浓度将a20细胞悬浮在pbs(磷酸盐缓冲盐水，gibco)中，并将5
×
105个细胞皮下注射到小鼠的右胁中。以5
×
105细胞/100μl的浓度将4t1细胞悬浮在pbs(磷酸盐缓冲盐水，gibco)中，并将5
×
105个细胞皮下注射到小鼠的左胁中。作为对照组，使用与实验组年龄相同的未经治疗的小鼠。作为对照组，使用与实验组年龄相同的小鼠。每组使用5只小鼠。每周测量两次肿瘤大小和体重。
[0629]
结果，如图21和22所示，发现在经t2.02m治疗达到完全缓解的组中，4t1肿瘤生长，但a20肿瘤没有生长。另一方面，发现4t1肿瘤和a20肿瘤在对照组中均生长。这些结果表明，融合蛋白可以抑制肿瘤再激发。
[0630]
此外，测量完全缓解模型的体重以确定是否存在任何副作用。结果，如图23所示，发现由融合蛋白引起的肿瘤再激发没有副作用。
[0631]
实施例4.3.同系小鼠模型中cd20特异性融合蛋白和抗cd20抗体的抗肿瘤活性评价的比较
[0632]
将根据一个实施方案的cd20特异性融合蛋白的抗肿瘤作用与非特异性融合蛋白的抗肿瘤作用进行比较。
[0633]
具体地，它是在机构动物护理和使用委员会(iacuc，crownbio，美国)的批准下于体内进行的。从上海灵畅生物科技有限公司(中国上海)获得6周龄雌性balb/c小鼠。以5
×
105细胞/100μl的浓度将a20细胞悬浮在pbs(磷酸盐缓冲盐水，gibco)中，并将5
×
105个细胞皮下注射到小鼠的右胁中。
[0634]
当肿瘤大小达到100mm3时，将小鼠随机分成几组。用制备的25μg t2.02m和25μg18b12每隔3天腹腔注射3次。每组使用8只小鼠。每周测量两次肿瘤大小和体重，并评估一个月的抗癌活性。
[0635]
结果，如图24所示，发现在第一次腹腔注射后第11天，用t2.02m治疗的组显示出完全缓解(cr)，并且在第一次腹腔注射后第18天，该组显示出100％(8/8)的cr，表明t2.02m具有优异的抗癌作用。另一方面，在用非融合蛋白18b12治疗的组中，无法确定抗癌作用。这些结果表明，一个实施方案的融合蛋白的抗癌作用优于非融合蛋白的抗癌作用。
[0636]
实施例4.4.同系小鼠模型中cd20特异性融合蛋白的靶标特异性抗癌功效的评价
[0637]
将根据一个实施方案的靶标特异性融合蛋白的抗肿瘤作用与非特异性非融合蛋白的抗肿瘤作用进行比较。
[0638]
它是在机构动物护理和使用委员会(iacuc，crownbio，美国)的批准下于体内进行的。从上海灵畅生物科技有限公司(中国上海)获得6周龄雌性balb/c小鼠。以5
×
105个细胞/100μl的浓度将a20细胞悬浮在pbs(磷酸盐缓冲盐水，gibco)中，并将5
×
105个细胞皮下注射到小鼠的右胁中。
[0639]
当肿瘤大小达到100mm3时，将小鼠随机分成几组。用制备的0.2μg t2.02m和0.2μg t2.13m每隔一周静脉注射两次。每组使用7只小鼠。每周测量两次肿瘤大小和体重。
[0640]
结果，如图25所示，发现在第一次静脉注射后第11天，用t2.02m治疗的组显示出63％的肿瘤生长抑制百分比(tgi)，而用t2.13m治疗的组显示出20％的肿瘤生长抑制百分比。这些结果表明，一个实施方案的靶标特异性融合蛋白的抗癌效果优于非靶标特异性非融合蛋白的抗癌效果。
[0641]
实施例4.5.同系小鼠模型中cd20特异性融合蛋白与抗cd20抗体和细胞因子共给
药抗癌功效评价的比较
[0642]
比较了一个实施方案的靶标特异性融合蛋白与非特异性融合蛋白的联合治疗效果。
[0643]
具体地，它是在机构动物护理和使用委员会(iacuc，crownbio，美国)的批准下于体内进行的。从上海灵畅生物科技有限公司(中国上海)获得6周龄雌性balb/c小鼠。以5
×
105个细胞/100μl的浓度将a20细胞悬浮在pbs(磷酸盐缓冲盐水，gibco)中，并将5
×
105个细胞皮下注射到小鼠的右胁中。
[0644]
当肿瘤大小达到100mm3时，将小鼠随机分成几组。小鼠被分入用制备的0.2μgt2.02m治疗的组以及用0.2μg t2.13m和0.2μg 18b12治疗的组。每一剂量每隔一周静脉注射3次，并评估两周。每组使用7只小鼠。每周测量两次肿瘤大小和体重。
[0645]
结果，如图26所示，发现在第一次静脉注射后第10天，用t2.02m治疗的组显示出80％的肿瘤生长抑制百分比(tgi)，用18b12和t2.13m治疗的组显示出65％的肿瘤生长抑制百分比。这些结果表明，靶标特异性融合蛋白的抗癌效果优于非靶标特异性非融合蛋白的联合治疗，并且确定了一个实施方案的融合蛋白结构的协同作用。
[0646]
实施例4.6.同系小鼠模型中cd20特异性融合蛋白减毒细胞因子抗癌功效评价的比较
[0647]
与t2.01m相比，确定了il-12在包含肝素结合位点突变的t2.02m和t2.03m中的作用是否减弱。
[0648]
在机构动物护理和使用委员会(iacuc，crownbio，美国)的批准下于体内进行。从上海灵畅生物科技有限公司(中国上海)获得6周龄雌性balb/c小鼠。以5
×
105细胞/100μl的浓度将a20细胞悬浮在pbs(磷酸盐缓冲盐水，gibco)中，并将5
×
105个细胞皮下注射到小鼠的右胁中。
[0649]
当肿瘤大小达到100mm3时，将小鼠随机分成几组。将制备的2μg t2.01m、2μgt2.02m和2μg t2.03m每隔一周静脉注射3次，并评价小鼠模型一个月的抗癌活性。每组使用7只小鼠。每周测量两次肿瘤大小和体重。
[0650]
结果，如图27所示，发现在第一次腹腔注射后第20天，用t2.01m治疗的组显示出87％的肿瘤生长抑制百分比(tgi)，用t2.02m治疗的组显示出98％的tgi，用t2.03m治疗的组显示出40％的tgi。
[0651]
此外，静脉注射t2.01m、t2.02m和t2.03m，其产生的副作用表现为体重变化。
[0652]
结果，如图28所示，发现静脉注射t2.01m、t2.02m和t2.03m后无副作用。

技术特征：
1.一种融合蛋白，其包括：包含il-12或其变体的第一单体；和包含特异性结合cd20的抗原结合位点的第二单体。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述il-12或其变体包含il-12a(p35)或其变体；和il-12b(p40)或其变体。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述il-12或其变体包含以下结构式(i)或(ii)：n'-y-[接头(1)]o-z-c'(i)n'-z-[接头(1)]o-y-c'(ii)在结构式(i)和(ii)中，n'为融合蛋白的n末端，c'为融合蛋白的c末端，y为il-12a或其变体，z为il-12b或其变体，所述接头(1)为肽接头，并且o为0或1。4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述il-12b(p40)的变体包含在如seq id no:124所示的氨基酸序列中通过发生了选自由k258a、k260a、k263a和k264a组成的组中的至少一个取代而获得的氨基酸序列。5.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述il-12b(p40)包含如seq id no:124或seq id no:131所示的氨基酸序列。6.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述il-12b(p40)的变体包含如seq id no:127、seq id no:129、seq id no:134或seq id no:136所示的氨基酸序列。7.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述il-12a(p35)包含如seq id no:125或seq id no:132所示的氨基酸序列。8.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述il-12包含如seq id no:123、seq id no:126、seq id no:128、seq id no:130、seq id no:133或seq id no:135所示的氨基酸序列。9.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述特异性结合cd20的抗原结合位点包括：包含如seq id no:107所示的hcdr1，如seq id no:108所示的hcdr2和如seq id no:109所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:110所示的lcdr1，如seq id no:111所示的lcdr2和如seq id no:112所示的lcdr3的轻链可变区；包含如seq id no:115所示的hcdr1，如seq id no:116所示的hcdr2和如seq id no:117所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:118所示的lcdr1，如seq id no:119所示的lcdr2和如seq id no:120所示的lcdr3的轻链可变区；包含如seq id no:143所示的hcdr1，如seq id no:144所示的hcdr2和如seq id no:145所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:146所示的lcdr1，如seq id no:147所示的lcdr2和如seq id no:148所示的lcdr3的轻链可变区；
包含如seq id no:149所示的hcdr1，如seq id no:150所示的hcdr2和如seq id no:151所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:152所示的lcdr1，如seq id no:153所示的lcdr2和如seq id no:154所示的lcdr3的轻链可变区；包含如seq id no:155所示的hcdr1，如seq id no:156所示的hcdr2和如seq id no:157所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:158所示的lcdr1，如seq id no:159所示的lcdr2和如seq id no:160所示的lcdr3的轻链可变区；包含如seq id no:161所示的hcdr1，如seq id no:162所示的hcdr2和如seq id no:163所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:164所示的lcdr1，如seq id no:165所示的lcdr2和如seq id no:166所示的lcdr3的轻链可变区；包含如seq id no:167所示的hcdr1，如seq id no:168所示的hcdr2和如seq id no:169所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:170所示的lcdr1，如seq id no:171所示的lcdr2和如seq id no:172所示的lcdr3的轻链可变区；包含如seq id no:173所示的hcdr1，如seq id no:174所示的hcdr2和如seq id no:175所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:176所示的lcdr1，如seq id no:177所示的lcdr2和如seq id no:178所示的lcdr3的轻链可变区；包含如seq id no:179所示的hcdr1，如seq id no:180所示的hcdr2和如seq id no:181所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:182所示的lcdr1，如seq id no:183所示的lcdr2和如seq id no:184所示的lcdr3的轻链可变区；包含如seq id no:185所示的hcdr1，如seq id no:186所示的hcdr2和如seq id no:187所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:188所示的lcdr1，如seq id no:189所示的lcdr2和如seq id no:190所示的lcdr3的轻链可变区；包含如seq id no:191所示的hcdr1，如seq id no:192所示的hcdr2和如seq id no:193所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:194所示的lcdr1，如seq id no:195所示的lcdr2和如seq id no:196所示的lcdr3的轻链可变区；包含如seq id no:197所示的hcdr1，如seq id no:198所示的hcdr2和如seq id no:199或seq id no:200所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:201所示的lcdr1，如seq id no:202所示的lcdr2和如seq id no:203所示的lcdr3的轻链可变区；包含如seq id no:204所示的hcdr1，如seq id no:205所示的hcdr2和如seq id no:206所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:207所示的lcdr1，如seq id no:208所示的lcdr2和如seq id no:209所示的lcdr3的轻链可变区；包含如seq id no:210所示的hcdr1，如seq id no:211所示的hcdr2和如seq id no:212所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:213所示的lcdr1，如seq id no:214所示的lcdr2和如seq id no:215所示的lcdr3的轻链可变区；包含如seq id no:216所示的hcdr1，如seq id no:217所示的hcdr2和如seq id no:218所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:219所示的lcdr1，如seq id no:220所示的lcdr2和如seq id no:221所示的lcdr3的轻链可变区；包含如seq id no:222所示的hcdr1，如seq id no:223所示的hcdr2和如seq id no:224所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:225所示的lcdr1，如seq id no:226所示的lcdr2和如seq id no:227所示的lcdr3的轻链可变区；
包含如seq id no:228所示的hcdr1，如seq id no:229所示的hcdr2和如seq id no:230所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:231所示的lcdr1，如seq id no:232所示的lcdr2和如seq id no:233所示的lcdr3的轻链可变区；或包含如seq id no:234所示的hcdr1，如seq id no:235所示的hcdr2和如seq id no:236所示的hcdr3的重链可变区，以及包含如seq id no:237所示的lcdr1，如seq id no:238所示的lcdr2和如seq id no:239所示的lcdr3的轻链可变区。10.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述特异性结合cd20的抗原结合位点包含：如seq id no:113所示的重链可变区和如seq id no:114所示的轻链可变区；如seq id no:121所示的重链可变区和如seq id no:122所示的轻链可变区；如seq id no:240所示的重链可变区和如seq id no:241所示的轻链可变区；如seq id no:242所示的重链可变区和如seq id no:243所示的轻链可变区；如seq id no:244所示的重链可变区和如seq id no:245所示的轻链可变区；如seq id no:246所示的重链可变区和如seq id no:247所示的轻链可变区；如seq id no:248所示的重链可变区和如seq id no:249所示的轻链可变区；如seq id no:250所示的重链可变区和如seq id no:251所示的轻链可变区；如seq id no:252所示的重链可变区和如seq id no:253所示的轻链可变区；如seq id no:254所示的重链可变区和如seq id no:255所示的轻链可变区；如seq id no:256所示的重链可变区和如seq id no:257所示的轻链可变区；如seq id no:258所示的重链可变区和如seq id no:259所示的轻链可变区；如seq id no:260所示的重链可变区和如seq id no:261所示的轻链可变区；如seq id no:262所示的重链可变区和如seq id no:263所示的轻链可变区；如seq id no:264所示的重链可变区和如seq id no:265所示的轻链可变区；如seq id no:266所示的重链可变区和如seq id no:267所示的轻链可变区；如seq id no:268所示的重链可变区和如seq id no:269所示的轻链可变区；如seq id no:270所示的重链可变区和如seq id no:271所示的轻链可变区；如seq id no:88所示的scfv；或如seq id no:89所示的scfv。11.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一单体进一步包含特异性结合cd20的抗原结合位点。12.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一单体包含以下结构式(iii)或(iv)：n'-x-[接头(2)]p-fc区片段或其变体-[接头(3)]q-(t)r-c'(iii)n'-(t)r-[接头(2)]q-fc区片段或其变体-[接头(3)]p-x-c'(iv)在结构式(iii)和(iv)中，n'为融合蛋白的n末端，c'为融合蛋白的c末端，x为结构式(i)或(ii)，t为特异性结合cd20的抗原结合位点，
接头(2)和(3)为肽接头，并且p、q和r各自独立地为0或1。13.根据权利要求3或12所述的融合蛋白，其特征在于，所述接头包含(g4s)
n
接头，其中n为1至10的整数中的任意一个。14.根据权利要求12所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一单体的fc区来源于人igg1或小鼠igg2a。15.根据权利要求12所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一单体的fc包含杵结构或臼结构。16.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二单体进一步包含特异性结合cd20的抗原结合位点。17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其特征在于，所述特异性结合cd20的抗原结合位点为fab、scfv、fv或其片段。18.根据权利要求16所述的融合蛋白，其特征在于，所述特异性结合cd20的额外结合的抗原结合位点与所述第二单体的n末端或c末端结合。19.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二单体包含以下结构式(v)：n'-(r)s-[接头(4)]t-q-[接头(5)]u-fc区片段或其变体-[接头(6)]v-(w)a-c'(v)在结构式(v)中，n'为融合蛋白的n末端，c'为融合蛋白的c末端，r为特异性结合cd20的抗原结合位点，q为特异性结合cd20的抗原结合位点，w为特异性结合cd20的scfv；或结构式(i)或(ii)的il-12或其变体，接头(4)至(6)为肽接头，并且s、t、u和v各自独立地为0或1。20.根据权利要求19所述的融合蛋白，其特征在于，所述结构式(v)包含以下结构式(v')和(v”)：n'-(r')s-[接头(4)]t-q'-[接头(5)]u-fc区片段或其变体-[接头(6)]p-(w)a-c'(v')n'-(r”)s-[接头(4)]t-q
”‑
[接头(7)]x-(w)b-c'(v”)在结构式(v')和(v”)中，r'为特异性结合cd20的抗体的重链区，其包含可变区和ch1区；或所述抗体的轻链区；r”为特异性结合cd20的抗体的轻链区；或所述抗体的重链区，其包含可变区和ch1区；其中r'和r”相互结合形成所述抗体的可变区，其中所述可变区特异性结合cd20；q'为特异性结合cd20的抗体的重链区，其包含可变区和ch1区；或所述抗体的轻链区；q”为特异性结合cd20的抗体的轻链区；或所述抗体的重链区，其包含可变区和ch1区；其中q'和q”相互结合形成所述抗体的可变区，其中所述可变区特异性结合cd20，r'和q'各自为所述抗体的重链区，其包含可变区和ch1区；或抗体的轻链区；r”和q”各自为所述抗体的轻链区；或抗体的重链区，其包含可变区和ch1区；其中r'和r”；和q'和q”相互结合形成所述抗体的可变区，其中所述可变区特异性结合cd20，
w为特异性结合cd20的scfv，接头(4)、(5)和(7)为肽接头，并且s、t、u、x、a和b各自独立地为0或1。21.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含结构式(iii)和结构式(v)；结构式(iv)和结构式(v)；结构式(iii)和结构式(iii)；结构式(iv)和结构式(iv)；或结构式(v)和结构式(v)。22.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二单体包含由如seq id no:113所示的氨基酸序列组成的重链和由如seq id no:114所示的氨基酸序列组成的轻链；或由如seq id no:121所示的氨基酸序列组成的重链和由如seq id no:122所示的氨基酸序列组成的轻链。23.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二单体的fc包含杵结构或臼结构。24.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含权利要求1至23任一项所述的融合蛋白作为活性成分。25.根据权利要求24所述的药物组合物，其特征在于，所述癌症选自由胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌、骨癌、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、卵巢癌、胰腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、脑肿瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌和淋巴瘤组成的组中的任一种。26.一种编码权利要求1中所述第一单体的多核苷酸。27.一种包含权利要求26中所述多核苷酸的载体。28.一种编码权利要求1中所述第二单体的多核苷酸。29.一种包含权利要求28中所述多核苷酸的载体。30.一种引入了权利要求27或29中所述载体的转化细胞。31.一种产生融合蛋白的方法，其包括：i)培养权利要求30中所述的转化细胞；和ii)回收包含所述第一单体和所述第二单体的融合蛋白。32.一种用于治疗或预防癌症的方法，其包括：向受试者施用一种融合蛋白，其包括包含il-12或其变体的第一单体和包含特异性结合cd20的抗原结合位点的第二单体。33.一种融合蛋白在治疗癌症中的应用，所述融合蛋白包括包含il-12或其变体的第一单体和包含特异性结合cd20的抗原结合位点的第二单体。34.一种融合蛋白在制备用于治疗癌症的药物中的应用，所述融合蛋白包括包含il-12或其变体的第一单体和包含特异性结合cd20的抗原结合位点的第二单体。

技术总结
本发明提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合IL-12或其变体和CD20的抗原结合位点。所述双特异性抗体通过IL-12表现出抗癌作用。特别是，如果在一种抗体中采用抗CD20抗体，则可以通过靶向肿瘤中高特异性表达的CD20将IL-12特异性定位到肿瘤部位，进而有效地治疗癌症。因此，双特异性抗体可用作抗癌治疗的药物组合物，因而具有很高的工业适用性。因而具有很高的工业适用性。因而具有很高的工业适用性。


技术研发人员：李多憓 柳秀旼 金东建 张志勋 李秉喆
受保护的技术使用者：治纳辅医药科技有限公司
技术研发日：2021.08.10
技术公布日：2023/7/7