用于反应性分子分离的色谱硬件改进的制作方法

用于反应性分子分离的色谱硬件改进
1.相关申请的交叉引用
2.本专利申请要求于2020年9月24日提交的名称为“用于反应性分子分离的色谱硬件改进(chromatographic hardware improvements for the separation of reactive molecules)”的美国临时专利申请号63/082,539的优先权和权益，该临时专利申请的内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
3.本公开涉及用于改进反应性分子分离的装置和技术。更具体地，本技术涉及用于减少或消除柱上分析物降解的装置和技术。


背景技术：

4.与金属相互作用的分析物通常被证明分离极具挑战性。期望具有分散程度最低的高效色谱系统，这要求流动路径的直径减小并且能够承受越来越快的流速下的越来越高的压力。因此，色谱流动路径选择的材料本质上通常是金属的。尽管存在以下事实：已知某些分析物(例如，生物分子、蛋白质、聚糖、肽、寡核苷酸、杀虫剂、双膦酸、阴离子代谢物和两性离子比如氨基酸和神经递质)的特性与金属表面具有不利的相互作用(所谓的色谱次级相互作用)。
5.所提出的用于金属特异性结合相互作用的机制需要理解路易斯酸碱化学理论。纯金属和金属合金(连同它们的对应氧化物层)具有末端金属原子，该末端金属原子具有路易斯酸特性。更简单地，这些金属原子示出接受供体电子的倾向。对于带有正电荷的任何表面金属离子而言，这种倾向甚至更为明显。具有足够的路易斯碱特性的分析物(可提供非成键电子的任何物质)可潜在地吸附到这些位点，从而形成有问题的非共价络合物。正是这些物质被定义为与金属相互作用的分析物。
6.例如，具有磷酸酯基团的分析物是能够进行高亲和力金属螯合的优异的多齿配体。这种相互作用导致磷酸化物质与流动路径金属结合，从而减少检测到的此类物质的量，这是特别麻烦的效应，因为磷酸化物质常常是测定中最重要的分析物。
7.分析物的其他特性同样可引起问题。例如，羧酸酯基团也具有螯合到金属的能力，尽管亲和力比磷酸酯基团低。然而，羧酸酯官能团在例如生物分子中是普遍存在的，从而为累积的基于多齿的吸附损失提供了机会。这些复杂性不仅可存在于肽和蛋白质上，而且还存在于聚糖上。例如，n-聚糖物质有时可以包含一个或多个磷酸酯基团以及包含唾液酸残基的一种或多种羧酸酯。另外，较小的生物分子(诸如核苷酸和糖类，比如糖磷酸酯)可表现出与前述n-聚糖分子类似的行为。此外，色谱次级相互作用对于生物分子特别是较大的结构可能尤其成问题，因为它们具有形成微环境的能力(通过其大小和结构顺序)，该微环境可能与分离部件和流动路径表面发生不利的相互作用。在这种情况下，具有较大结构的生物分子或分析物可呈现具有化学性质的结构区域，该化学性质放大与流动路径内的材料的次级相互作用。这与累积的金属螯合效应相结合可削弱生物分子、杀虫剂、双膦酸、阴离子
代谢物和两性离子如氨基酸和神经递质的总体有效分离。
8.反应性金属物质除了在金属表面上吸附之外，还会引起其他问题。即，不需要的金属物质可在整个液相色谱系统中催化反应，从而导致柱上降解。例如，柱上降解可能是由于溶液中溶解的金属离子(单一金属、金属氧化物或簇状分子物质)吸收在玻璃料的表面或固定相上而引起的。不需要的反应性金属物质也可能从小的不溶性金属或金属氧化物颗粒与金属表面(诸如玻璃料、管材等)的反应中出现，或者从收集在柱的头上的金属沉淀物中出现。
9.分离系统通常包含不锈钢，不仅作为导管或柱体，而且作为流动路径内的硬件，诸如玻璃料。由于与暴露的金属表面(诸如，例如管材、柱体和玻璃料)的相互作用，所以使用不锈钢硬件可能导致柱上分析物降解。由于玻璃料完全容纳在柱内，所以它们会促成柱上反应并导致不期望的分析物吸附。
10.为了解决这些问题，已经使用比不锈钢问题更少的金属(诸如钛和钛合金)来形成玻璃料。然而，这些问题较少的材料仍可能导致不期望的分析物吸附并促成柱上反应。实验室器皿(诸如玻璃料)的吸附损失降低了分析结果的强度。
11.因此，需要不断努力减少润湿表面与流体样品之间的相互作用，以提供改进的结果。


技术实现要素：

12.通常，本技术涉及施加到金属玻璃料以解决柱上分析物降解的表面涂层。本技术的特征还在于将表面涂层施加到液相色谱系统的其他金属部件(例如，玻璃料、管材、连接器、样品贮存器和进样器、和/或柱)以解决液相色谱系统中的分析物降解问题。在一些实施方案中，表面涂层是无机-有机杂化涂层，该涂层可被气相沉积以覆盖金属玻璃料(诸如不锈钢玻璃料和非不锈钢玻璃料(例如，钛))的外表面。使用这种技术，可掩蔽玻璃料的金属表面上的活性位点，以防止柱上金属催化的分析物反应，诸如，例如氧化、氨基化、亚硝基化或亚硝化。将表面涂层(例如，无机-有机杂化表面)施加到金属玻璃料，与未经涂覆的对应金属玻璃料相比，减少了柱上降解。通常，表面涂层的施加消除或减少了能够用于与分析物反应的金属表面位点的数量。
13.在一个方面，本技术涉及色谱柱。该色谱柱包括玻璃料，该玻璃料包括金属基材和围绕该基材的表面的至少一部分的外部涂层，其中该外部涂层包含无机-有机杂化物。
14.上述方面可以包括以下特征中的一个或多个特征。在一个实施方案中，金属基材包含基本上纯的钛。在某些实施方案中，外部涂层可包含c2和/或c2c10。在一些实施方案中，玻璃料还可包括设置在外部涂层的至少一部分与金属基材的表面之间的中间涂层。该中间涂层可以是纯金属、金属氧化物、金属氮化物或金属碳化物。在一些实施方案中，容纳在色谱柱内的暴露的金属壁的至少一部分包括含流体涂层，该含流体涂层包括无机-有机杂化物，诸如，例如c2和/或c2c10。
15.在一个方面，本技术涉及一种减少液相色谱期间样品组分(例如，胺)的金属催化反应(例如，降解)的方法。该方法包括在包括掩蔽金属玻璃料的色谱柱中分离样品，其中该掩蔽金属玻璃料包括在外表面上涂覆有与样品无反应的无机-有机杂化涂层的金属玻璃料；以及用检测器来检测分离的样品组分。在某些实施方案中，使用惰性lc色谱系统来分离
样品，该惰性lc色谱系统包括柱和其他硬件，该其他硬件使其金属润湿表面的全部或大部分涂覆有惰性涂层，诸如，例如与金属玻璃料上的无机-有机杂化涂层相同。在一些实施方案中，惰性lc色谱系统还包括生物惰性泵，以将溶剂递送至色谱柱。
16.上述方面可以包括以下特征中的一个或多个特征。在一个实施方案中，掩蔽金属玻璃料包括纯的或基本上纯的(例如，97％纯度或更高)钛玻璃料，然后在该钛玻璃料的外部上涂覆无机-有机杂化涂层。在一个实施方案中，掩蔽金属玻璃料包括钛合金玻璃料，然后在该钛合金玻璃料外部上涂覆无机-有机杂化涂层。掩蔽金属玻璃料(即，包括无机-有机涂层)减少了系统内与样品或溶剂反应的位点数量。在某些实施方案中，掩蔽金属玻璃料包括不锈钢玻璃料，然后在该不锈钢玻璃料外部上涂覆无机-有机杂化涂层。在某些实施方案中，玻璃料包括在外部的无机-有机杂化涂层之前施加的中间涂层，该中间涂层包含金属(例如，钛、钛合金、铂等)、金属氧化物、金属氮化物或金属碳化物层。在一些实施方案中，中间涂层为底层金属基材提供孔密封性和化学稳定性特性。例如，用于密封孔并提供化学稳定性的一些金属氧化物包括但不限于al2o3、tio2、ta2o5和zro2。在一些实施方案中，中间涂层与无机-有机杂化涂层同时(例如，在同一时间，或在同一反应室内)施加。在一些实施方案中，含金属涂层包含钛(例如，纯钛、钛合金、氧化钛)。在一些实施方案中，无机-有机杂化涂层是有机二氧化硅涂层。在一些实施方案中，无机-有机杂化涂层是烷基甲硅烷基涂层。在某些实施方案中，除了包括掩蔽金属玻璃料之外，色谱柱内暴露的金属壁(或lc系统内的金属表面)还涂覆有无机-有机杂化涂层。无机-有机杂化涂层防止或减少与样品和/或与lc系统中使用的溶剂的催化反应。
17.在一个方面，本技术涉及一种用于在包括胺的样品的分离中改进色谱性能的方法。该方法包括在惰性液相色谱系统中分离样品，该惰性液相色谱系统包括柱，该柱包括涂覆有无机-有机杂化涂层的钛玻璃料；以及使用uv检测器或ms检测器来检测所分离的组分。在一些实施方案中，该方法还包括提供生物惰性泵(作为惰性液相色谱系统的一部分)以将溶剂递送至色谱柱。在该方法的某些实施方案中，特征在于惰性液相色谱系统，该惰性液相色谱系统包括具有无机-有机杂化涂层的内部柱表面。
18.上述方面可以包括以下特征中的一个或多个特征。在一个实施方案中，钛玻璃料涂覆有一层或多层c2。在某些实施方案中，钛玻璃料涂覆有c2的基底层和c2c10的顶层。在实施方案中，钛玻璃料涂覆有二醇包封的无机-有机杂化涂层。在其他实施方案中，钛玻璃料涂覆有苯基包封的无机有机杂化涂层。
19.在另一方面，本技术涉及一种用于液相色谱柱的惰性玻璃料。该惰性玻璃料包括不锈钢基材，该不锈钢基材包括多层涂层。该多层涂层包括与不锈钢基材相邻的钛层和外层。该外层包括无机-有机杂化涂层。在另一方面，本技术涉及一种惰性玻璃料，该惰性玻璃料包括基本上纯的钛基材(例如，少于5％的杂质、少于3％的杂质、少于1％的杂质)，其中气相沉积的c2涂层和/或c2c10覆盖所有外表面以防止液相色谱柱中的分析物-金属相互作用。在仍另一方面，本技术涉及一种用于液相色谱柱的惰性玻璃料。该惰性玻璃料包括基本上纯的钛基材，其中气相沉积的c2c10涂层覆盖所有外表面以防止液相色谱柱中的分析物-金属相互作用。
20.本技术的上述方面和特征提供许多优点。例如，本公开的装置和方法降低了在液相色谱系统中利用金属基玻璃料的有害结果。使用本技术，能够掩蔽不锈钢或其他金属(例
如，钛或钛合金)的金属表面上的活性位点以防止柱上金属催化的分析物相互作用，诸如氧化或亚硝化。特别地，本技术的方法允许施加无机-有机杂化表面来涂覆并且因此掩蔽液体流动路径内使用的底层金属玻璃料或其他硬件，以减少柱上降解，从而增加分析结果的强度。
附图说明
21.通过以下结合附图所作的详细描述，将更充分地理解本技术，在附图中：
22.图1a是litronesib(一种胺)的化学式的示意图。
23.图1b是litronesib的亚硝基杂质(z异构体)的化学式的示意图。
24.图1c是litronesib的亚硝基杂质(e异构体)的化学式的示意图。
25.图1d是litronesib分离的色谱图，其中由于litronesib在分离期间的亚硝化而存在亚硝基杂质。
26.图1e是litronesib分离的uv色谱图，其中由于litronesib在分离期间的亚硝化而存在亚硝基杂质。
27.图2a是胺clozapine(氯氮平)的化学式的示意图。
28.图2b是氯氮平的n-氧化物的化学式的示意图。
29.图3是根据本技术的例示性实施方案的包括色谱柱和各种其他部件的色谱流动系统的示意图。流体被载送通过色谱流动系统，其中流体流动路径从流体管理器延伸到检测器诸如ms检测器。
30.图4是示出了根据本技术的实施方案的在液相色谱期间减少样品组分的降解的方法的流程图。
31.图5是根据本技术的玻璃料的实施方案的剖面示意图。
32.图6是根据本技术的玻璃料的实施方案的剖面示意图。
33.图7a是在一次进样后使用不锈钢柱的氯氮平的uv色谱图。
34.图7b是在两次进样后使用不锈钢柱的氯氮平的uv色谱图。
35.图7c是在十三次进样后使用不锈钢柱的氯氮平的uv色谱图。
36.图8a是在两次进样后使用不锈钢柱的氯氮平的tic色谱图。
37.图8b是在三十四次进样后使用不锈钢柱的氯氮平的tic色谱图。
38.图9a是示出了氯氮平鉴定的质谱。
39.图9b是示出了氯氮平的n-氧化物鉴定的质谱。
40.图10a是在一次进样后使用具有经涂覆的(即，经c2涂覆的)ti玻璃料的经涂覆的(即，经c2涂覆的)不锈钢柱的氯氮平的uv色谱图。
41.图10b是在两次进样后使用具有经涂覆的(即，经c2涂覆的)ti玻璃料的经涂覆的(即，经c2涂覆的)不锈钢柱的氯氮平的uv色谱图。
42.图10c是在十三次进样后使用具有经涂覆的(即，经c2涂覆的)ti玻璃料的经涂覆的(即，经c2涂覆的)不锈钢柱的氯氮平的uv色谱图。
43.图11a是在两次进样后使用具有经涂覆的(即，经c2涂覆的)ti玻璃料的经涂覆的(即，经c2涂覆的)不锈钢柱的氯氮平的tic色谱图。
44.图11b是在三十四次进样后使用具有经涂覆的(即，经c2涂覆的)ti玻璃料的经涂
覆的(即，经c2涂覆的)不锈钢柱的氯氮平的tic色谱图。
45.图12a是使用具有未经涂覆的不锈钢玻璃料的经c2涂覆的不锈钢柱的氯氮平分离的tic色谱图。该tic色谱图聚焦于第二次进样后的n-氧化物峰。
46.图12b是使用具有经c2涂覆的不锈钢玻璃料的经c2涂覆的不锈钢柱的氯氮平分离的tic色谱图。该tic色谱图聚焦于第二次进样后的n-氧化物峰。
47.图12c是使用具有未经涂覆的钛玻璃料的经c2涂覆的不锈钢柱的氯氮平分离的tic色谱图。该tic色谱图聚焦于第二次进样后的n-氧化物峰。
48.图12d是使用具有经c2涂覆的钛玻璃料的经c2涂覆的不锈钢柱的氯氮平分离的tic色谱图。该tic色谱图聚焦于第二次进样后的n-氧化物峰。
49.图12e是使用具有未经涂覆的不锈钢玻璃料的经c2涂覆的不锈钢柱的氯氮平分离的tic色谱图。该tic色谱图聚焦于第二次进样后的n-氧化物峰。
50.图13a是使用具有未经涂覆的不锈钢玻璃料的经c2涂覆的不锈钢柱的氯氮平分离的tic色谱图。该tic色谱图聚焦于第五次进样后的n-氧化物峰。
51.图13b是使用具有经c2涂覆的不锈钢玻璃料的经c2涂覆的不锈钢柱的氯氮平分离的tic色谱图。该tic色谱图聚焦于第五次进样后的n-氧化物峰。
52.图13c是使用具有未经涂覆的钛玻璃料的经c2涂覆的不锈钢柱的氯氮平分离的tic色谱图。该tic色谱图聚焦于第五次进样后的n-氧化物峰。
53.图13d是使用具有经c2涂覆的钛玻璃料的经c2涂覆的不锈钢柱的氯氮平分离的tic色谱图。该tic色谱图聚焦于第五次进样后的n-氧化物峰。
54.图13e是使用具有未经涂覆的不锈钢玻璃料的未经涂覆的不锈钢柱的氯氮平分离的tic色谱图。该tic色谱图聚焦于第五次进样后的n-氧化物峰。
55.图14a是使用具有未经涂覆的不锈钢玻璃料的不锈钢柱的氯氮平分离的tic色谱图。该tic色谱图聚焦于第二次进样后氯氮平亚硝基杂质峰的z异构体和e异构体。
56.图14b是使用具有未经涂覆的不锈钢玻璃料的不锈钢柱的氯氮平分离的tic色谱图。该tic色谱图聚焦于第三十四次进样后氯氮平亚硝基杂质峰的z异构体和e异构体。
57.图15a是使用具有经c2涂覆的ti玻璃料的经c2涂覆的不锈钢柱的氯氮平分离的tic色谱图。该tic色谱图聚焦于第二次进样后氯氮平亚硝基杂质峰的z异构体和e异构体的位置。
58.图15b是使用具有经c2涂覆的ti玻璃料的经c2涂覆的不锈钢柱的氯氮平分离的tic色谱图。该tic色谱图聚焦于第三十四次进样后氯氮平亚硝基杂质峰的z异构体和e异构体的位置。
59.图16a是示出了在未经涂覆的不锈钢柱上第一次进样样品时黄岑素(baicalein)和黄岑素氧化物的鉴定的质谱。
60.图16b是示出了在未经涂覆的不锈钢柱上第一次进样样品时没食子酸丙酯(propyl gallate)和没食子酸丙酯氧化物的鉴定的质谱。
61.图16c是示出了在经c2涂覆的不锈钢柱上第一次进样样品时黄岑素和黄岑素氧化物的鉴定的质谱。
62.图16d是示出了在经c2涂覆的不锈钢柱上第一次进样样品时没食子酸丙酯和没食子酸丙酯氧化物的鉴定的质谱。
具体实施方式
63.通常，本公开涉及用于创建惰性液相色谱(lc)系统的装置和方法。具体地，本公开涉及将无机-有机杂化涂层施加到底层金属基材以形成掩模，从而减少或防止lc系统中的分析物-金属相互作用。在实施方案中，无机-有机杂化涂层被气相沉积以生成均匀涂层。特别地，本技术涉及包括无机-有机杂化涂层的装置或系统，该无机-有机杂化涂层用以掩蔽用于惰性液相色谱系统中的金属玻璃料(例如，钛玻璃料、具有钛层的金属玻璃料)。在一些情况下，本技术涉及向系统(并且特别是经涂覆的惰性lc系统)提供经涂覆的玻璃料以减少柱上降解从而增加分析结果的强度的方法。
64.在液相色谱(lc)中使用各种条件来优化分析物分离的性能。在色谱法(诸如反相色谱法)中，通常使用水性流动相和有机溶剂来洗脱分析物。乙腈和甲醇是用于洗脱的常用溶剂，但已经证明随着时间的推移会腐蚀不锈钢和其他金属。这种腐蚀可导致lc系统或柱的金属表面(特别是关于玻璃料)变得具有催化活性。这可导致分析物-金属相互作用，从而导致样品组分的降解。
65.金属催化的分析物反应的两个示例包括亚硝化和氧化。即，暴露于有机溶剂的金属活性表面会提供用于与某些分析物(诸如胺)反应的活性位点。例如，litronesib(一种驱动蛋白抑制剂，通常被研究作为癌症治疗方案中的潜在疗法)可通过亚硝化在金属催化的反应中被转化以形成杂质，从而降低分析分离结果。参照图1a，示出了litronesib的化学式。在催化活性环境(诸如具有暴露的金属、乙腈和/或甲醇的环境)中，该结构底部处的极性共价键nh可在亚硝化反应中反应，以形成z异构体(图1b)或e异构体(图1c)。作为亚硝化反应的结果，一些原始样品材料被转化为不同的形式，这将改变研究的分析结果。例如，图1d提供了分离已知量的libronesib的色谱图(来自myers等人，journal of chromatography a(色谱法杂志a辑)，第1319卷，2013年12月6日，第57-64页)。由于分析物的一部分亚硝化为杂质形式(z异构体或e异构体)，所以光谱中存在杂质峰，从而降低结果的质量。还参见图1e，提供了litronesib分离的uv检测器的检测结果，litronesib被亚硝化反应降解。
66.在色谱分离期间，也可能发生氧化催化反应，包括流动路径内的金属。例如，已知氯氮平(一种胺和抗精神病药物)在具有暴露的金属和有机溶剂的分离环境中反应。在分离期间，由于活性金属位点和有机溶剂，样品内的至少一部分氯氮平可被转化为n-氧化物。图2a至图2b示出了氯氮平及其n-氧化物的化学式。
67.除了胺之外，其他分析物也容易发生柱上降解。例如，已知在氢氧化铵和乙腈的存在下，当暴露于金属lc组分时，苯胺在二聚过程中会降解。并且已知在流动相中使用甲酸和乙腈的金属lc系统中，各种添加剂(例如，调味剂、食品添加剂)(诸如，例如黄岑苷、黄岑素和没食子酸丙酯)会通过多酚氧化降解。
68.为了解决这些降解问题，多年来已经提出了几种替代表面，包括使用钛或钛合金来代替不锈钢。已知钛及其合金在有机溶剂中的反应性低于不锈钢。然而，钛已被证明仍具有色谱反应性，并且有助于分析物的吸附。另外，已经发现，当与甲醇(一种常见的lc溶剂)一起使用时，钛表面可浸出离子。这样，仍可能发生来自柱、其组分(例如，玻璃料)或lc系统的金属催化反应。
69.在本技术中，将无机-有机杂化气相沉积涂层(例如，烷基甲硅烷基涂层、二醇涂
层、苯基涂层、其他基于配体的涂层)施加到不锈钢或其他金属材料可防止发生由柱或lc系统引起的降解。无机-有机杂化涂层可掩蔽柱和lc系统的金属表面，使其免受由流动相诸如乙腈和甲醇或甚至分析物本身引起的腐蚀。如果金属表面上的活性位点被掩蔽，则无机-有机杂化涂层会防止底层金属的腐蚀并且因此防止分析物降解。通过利用气相沉积，可实现在玻璃料上的均匀涂层掩蔽活性位点，同时仍允许其通过。在许多不同的金属基材上实现了降解的减少，不仅是钛及其合金，而且还有不锈钢。
70.在一些实施方案中，本技术包括多个层或涂层以掩蔽活性位点。例如，在某些实施方案中，在金属玻璃料的顶部上施加多层无机-有机杂化涂层。多层涂层可以是单一材料(例如，c2或c2c10)，其中首先施加基底层，然后将其累积在第二层中。另选地，多层涂层可包含两种不同的材料。例如，将c2的基底层直接气相沉积在钛玻璃料上，随后是包含c2c10的生长层或次级层。在某些实施方案中，可在施加无机-有机杂化涂层之前对玻璃料进行预处理。例如，在施加无机-有机杂化涂层之前，可用不同的金属材料将不锈钢玻璃料金属化以减少活性位点。例如，可施加单一金属材料(诸如ti)作为基底涂层材料。在其他实施方案中，可在无机-有机杂化涂层之前向玻璃料施加合金。在某些实施方案中，向不锈钢玻璃料施加金属氧化物、金属氮化物或在一些情况下施加金属碳化物基底涂层。在一个实施方案中，将钛涂层作为基底层施加(例如，喷涂或气相沉积)到金属玻璃料上；接着将无机-有机杂化涂层(例如，c2)气相沉积在ti金属化不锈钢玻璃料之上。在另一个实施方案中，将由氧化铝和二氧化钛或者氧化铝和氧化钽组成的双层双分子层经由气相沉积施加到不锈钢玻璃料(或其他组分)基材，随后将无机-有机杂化涂层气相施加在外部上。
71.在一些方面，本技术涉及在惰性lc系统内使用掩蔽玻璃料。在实施方案中，本技术包括以下方法和系统，该方法和系统包括在lc系统中使用掩蔽金属玻璃料(例如，经无机-有机杂化物涂覆的金属玻璃料)，该lc系统已被调整以减少次级相互作用。例如，本技术包括在lc系统中使用经c2涂覆的钛玻璃料，该lc系统包括沿着其润湿流动路径的涂层。在一些实施方案中，该润湿流动路径包括柱和连接的管材。在某些实施方案中，润湿流动路径从样品贮存器延伸通过样品进样器到达连接管材、柱，并且到达管材下游的一个或多个检测器。一种此类系统的示例包括在美国专利公开us 2020-0215457(2020年7月9日)中描述的系统，该专利以引用方式并入本文。在某些实施方案中，lc系统还包括具有生物惰性表面的专用泵。具有生物相容性泵的市售泵的示例包括但不限于bioqsm(零件号18601541)、bioqsm plus(零件号18601581)、bioqsm-xr plus(零件号18601584)和biobsm(零件号18601561)，所有这些全都可从waters technologies corporation(milford，ma)获得。
72.本技术还涉及在液相色谱期间减少样品组分的降解的方法。通常，该方法旨在掩蔽流动路径内的金属，以减少可能的金属催化反应，诸如样品组分的亚硝化和氧化。图3是可用于分离样品中的分析物(诸如胺)的色谱流动系统/装置100的代表性示意图。样品可含有已知容易发生降解的其他分析物。例如，在一些实施方案中，样品可包括苯胺或添加剂，诸如黄岑苷、黄岑素、没食子酸丙酯、槲皮素-e-鼠李糖苷或芦丁。色谱流动系统100包括若干部件，该若干部件包括流体管理器系统105(例如，控制流过系统的流动相)，管材110(其也可被微加工流体导管替换或与微加工流体导管配套使用)，流体连接器115(例如，流体帽)，玻璃料120，色谱柱125(其在其入口和/或出口处容纳玻璃料120)，样品进样器135(该样品进样器包括用以将样品插入或注入到流动相中的针(未示出))，用于在进样之前盛装
样品的小瓶、沉降器或样品贮存器130，检测器150(诸如质谱仪)，以及用于控制流压力的压力调节器140。色谱系统/装置的部件的内表面形成具有润湿表面的流体流动路径。流体流动路径可具有至少20、至少25、至少30、至少35或至少40的长度与直径比率。用于递送流体的泵是流体管理器105的一部分，并且该泵未单独示出。
73.在本技术中，玻璃料120位于流体流动路径内并且具有润湿表面。即，玻璃料120暴露于有机溶剂和通过其中的样品。通常，金属玻璃料由于几个原因是优选的。例如，金属玻璃料可根据期望的需要形成和成形。金属玻璃料具有公知的渗透性和颗粒保留能力。另外，金属玻璃料即使在长时间使用后仍维持其形状和结构。然而，金属玻璃料却会通过提供金属催化反应的活性位点而导致分析物损失。为了减少或防止那些反应，但为了维持由金属玻璃料提供的结构完整性，根据本公开的方法用经掩蔽或经涂覆的金属玻璃料来分离样品以防止液相色谱柱125中的分析物-金属相互作用。
74.图4提供了示出本技术的方法的流程图。在分析(例如，液相色谱分离)期间减少样品组分的降解的方法400包括：步骤405，该步骤使用具有掩蔽金属玻璃料的柱来分离样品；和步骤410，该步骤用检测器来检测所分离的样品组分。步骤405的掩蔽金属玻璃料是用气相沉积的无机-有机杂化涂层涂覆在外表面上的金属玻璃料。经掩蔽或经涂覆的金属玻璃料上的涂层会形成屏障，以防止底层金属与流过玻璃料并围绕玻璃料流动的有机溶剂/样品之间的相互作用。即，该涂层防止分析物-金属相互作用并且因此减少样品组分在液相色谱期间的降解。
75.该方法的一些实施方案还包括在惰性液相色谱系统中分离样品，该惰性液相色谱系统不仅包括掩蔽金属玻璃料，而且还包括经涂覆的润湿表面，以及部件(例如，样品进样器和将柱连接至其他部件的管材)，并且在一些情况下包括用于递送流体的生物惰性泵。
76.图5所示的掩蔽玻璃料500包括为玻璃料提供结构和完整性的金属基材505和至少一个涂层510。至少一个涂层510通常是气相沉积的，使得掩蔽玻璃料500的整个外部被涂层保护——使得没有能够用于溶剂/分析物相互作用的活性金属位点。
77.无机-有机杂化涂层保护底层金属材料不与有机溶剂/金属反应性分析物相互作用。在一个实施方案中，无机-有机杂化涂层是烷基甲硅烷基涂层。烷基甲硅烷基涂层对于样品中的分析物中的至少一种是惰性的。在一些实施方案中，烷基甲硅烷基涂层是有机二氧化硅涂层。在某些实施方案中，烷基甲硅烷基涂层是形成润湿表面或涂覆润湿表面(例如，几乎整个润湿表面、超过95％的暴露表面、超过97％的暴露表面、超过99％的暴露表面)的无机-有机杂化材料。
78.无机-有机涂层可具有至少约15
°
的接触角。在一些实施方案中，该涂层可具有小于或等于30
°
的接触角。接触角可小于或等于约115
°
。在一些实施方案中，涂层的接触角介于约15
°
至约90
°
之间，在一些实施方案中介于约15
°
至约105
°
之间，并且在一些实施方案中介于约15
°
至约115
°
之间。例如，涂层的接触角可为约0
°
、5
°
、10
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或115
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。
79.无机-有机杂化涂层(例如，烷基甲硅烷基涂层)的厚度可为至少约例如，厚度可介于约至约之间。涂层的厚度可为约
80.或涂层(例如，气相沉积的烷基甲硅烷基涂层)的厚度可通过肉眼进行光学检测。例如，较高的不透明度和着色指示较厚的涂层。当在全光谱光(诸如太阳光)下观察到涂覆的部件时，从薄到厚，颜色从黄色，变成紫色，变成蓝色，变成略微绿色，然后变回黄色。例如，当烷基甲硅烷基涂层的厚度为时，涂层可呈现黄色并反射峰值波长在560nm和590nm之间的光。当烷基甲硅烷基涂层的厚度为时，涂层可呈现紫色并反射峰值波长在400nm和450nm之间的光。当烷基甲硅烷基涂层的厚度为时，涂层可呈现蓝色并反射峰值波长在450nm和490nm之间的光。参见例如faucheu等人的relatinggloss loss to topographical features of a pvdf coating(pvdf涂层的光泽度损失与地形特征的关系)，2004年10月6日公布；bohlin、erik的surfaceand porous structure of pigment coatings(颜料涂层的表面和多孔结构)、interactions with flexographic ink and effects of print quality(与柔性版油墨的相互作用及其对印刷质量的影响)，dissertation，karlstad universitystudies，2013:49。
81.无机-有机杂化涂层可以是气相沉积的双(三氯甲硅烷基)乙烷、双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷、双(三氯甲硅烷基)辛烷、双(三甲氧基甲硅烷基)辛烷、双(三甲氧基甲硅烷基)己烷和双(三氯甲硅烷基)己烷的产物。
82.在一些方面，润湿表面的至少一部分涂覆有多层相同或不同的烷基甲硅烷基，其中烷基甲硅烷基涂层的厚度与所进行的分层步骤的数量(例如，在玻璃料的润湿表面上沉积的烷基甲硅烷基涂层的层的数量，或者在惰性lc系统的情况下沿着润湿表面诸如柱壁、配件、进样器等沉积的烷基甲硅烷基涂层的层的数量)相关。
83.金属玻璃料可具有多个涂层，诸如多个烷基甲硅烷基涂层。例如，第二烷基甲硅烷基涂层可与第一或基底烷基甲硅烷基涂层直接接触。在一个实施方案中，钛金属玻璃料涂覆有c2的基底涂层和c2c10的第二涂层。
84.在一个方面，无机-有机杂化涂层是正癸基三氯硅烷、(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷(gptms)、水解之后的(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷(gptms)、2-(3,4-环氧基环己基)乙基三甲氧基硅烷、三甲基氯硅烷、三甲基二甲基氨基硅烷、甲氧基-聚乙烯氧基(3)硅烷、丙基三氯硅烷、丙基三甲氧基硅烷、(十七氟-1,1,2,2-四氢癸基)三(二甲基氨基)硅烷、(十七氟-1,1,2,2-四氢癸基)三氯硅烷、(十七氟-1,1,2,2-四氢癸基)三甲氧基硅烷、乙烯基三氯硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、烯丙基三氯硅烷、2-[甲氧基(聚乙烯氧基)3丙基]三氯硅烷、2-[甲氧基(聚乙烯氧基)3丙基]三甲氧基硅烷或2-[甲氧基(聚乙烯氧基)3丙基]三(二甲基氨基)硅烷。
[0085]
除了烷基甲硅烷基涂层之外，其他涂层材料也是可能的。例如，包含二醇、苯基或其他配体的其他无机-有机杂化涂层可用于保护金属玻璃料免受不期望的相互作用。
[0086]
除了将无机-有机杂化涂层施加到金属玻璃料之外，可使用其他工艺来减少样品组分的不期望的降解。例如，如果由于不锈钢玻璃料的结构完整性而需要不锈钢玻璃料，则可在气相沉积无机-有机杂化涂层之前或同时将含金属的钛外部涂层施加到其外表面。不锈钢玻璃料(或其他金属lc组分)的其他类型的金属化或含金属涂层(在沉积外部无机-有机杂化涂层之前)也是可能的。不锈钢玻璃料可首先涂覆有铁、硅、锰、镍、钼、锡、钴、铝、铜、
钒、铬或硼，而不是用钛进行金属化。在某些实施方案中，金属玻璃料可涂覆有金、铂、银、钨、钽或铱。在一些实施方案中，在沉积外部无机-有机杂化物之前，可首先用碳(例如，金刚石膜)、磷或硫涂覆或处理不锈钢玻璃料，以防止分析物相互作用。
[0087]
该掩蔽玻璃料可包括多个涂层。例如，参照图6，所示的是掩蔽玻璃料600，该掩蔽玻璃料包括覆盖金属基材605的含金属层607(例如，含金属、合金、金属氧化物、金属氮化物或金属碳化物的层)，随后是一个或多个气相沉积的无机-有机杂化涂层610。
[0088]
在一些实施方案中，含金属层607为由单一材料组成的单一层(例如，ti层、ti
203
层等)。含金属层607也可以是由两种不同材料组成的双分子层(例如，氧化铝层，随后是二氧化钛层)。含金属层607可包括纯的或基本上纯的元素金属(例如，ti、au、pt)。在其他实施方案中，含金属层为合金，诸如ti 6al-4v。在某些实施方案中，含金属层是氧化物、氮化物或碳化物。例如，含金属层可以是氧化铝、氮化硅或碳化钛。在实施方案中，含金属层是气相沉积的，并且在氧化物、氮化物或碳化物的情况下，除了金属前体之外，气相沉积还利用氧、氮或碳前体。表1提供了形成用于形成含金属层的前体的感兴趣配体类型的列表。表2提供了用于形成氧化物、氮化物和碳化物的前体。表2中列出的前体能够以未活化或等离子体活化状态提供。在一些实施方案中，表2中提供的碳前体可与金属氧化物和氮化物结合使用以向这些膜添加有机桥。
[0089]
表1：形成用于沉积的前体的感兴趣配体类型
[0090]
金属配体类型钪环戊二烯基、酰胺、酰亚胺、脒钇环戊二烯基、酰胺、酰亚胺、脒钛卤化物、环戊二烯基、醇盐、酰胺、酰亚胺、脒锆卤化物、环戊二烯基、醇盐、酰胺、酰亚胺、脒铪卤化物、环戊二烯基、醇盐、酰胺、酰亚胺、脒钒卤化物、醇盐、酰胺、酰亚胺、脒铌卤化物、醇盐、酰胺、酰亚胺钽卤化物、醇盐、酰胺、酰亚胺铬卤化物、醇盐、酰胺、酰亚胺钼卤化物、酰胺、酰亚胺钨卤化物、酰胺、酰亚胺铝卤化物、烷基、醇盐、酰胺、酰亚胺、脒硼卤化物、烷基、醇盐硅卤化物、烷基、醇盐、酰胺锗卤化物、烷基、醇盐、脒
[0091]
表2：氧化物、氮化物和碳化物前体
[0092]
氧前体水、过氧化氢、氧、臭氧、醇氮前体氮、氨、肼碳前体乙炔、甲酸、碳(参见表1中的配体)、醇、酸、酸酐
[0093]
本技术的掩蔽玻璃料与未经涂覆的玻璃料相比，提供了更大的优势。在下面的实施例部分中，结合不同的lc系统对不同玻璃料材料的评估表明，与未经涂覆的硬件相比，本
技术在很大程度上减少了柱上催化反应，诸如，例如氧化和亚硝化。因此，与常规的分离途径相比，提供了更稳健的分析并强化结果。
[0094]
实施例
[0095]
实施例1：不同柱技术的柱上氧化
[0096]
在0.1％(w/v)20/80/0.08(乙腈/水/乙酸)中制备氯氮平。使用waters acquity uplc i-class lc系统和以下概述的分离方法对这些样品进行分析。图7a至图7c和图8a至图8b呈现了来自多次进样的在未经涂覆的不锈钢柱(柱a)上的分离的柱上氧化结果。图10a至图10c和图11a至图11b呈现了来自多次进样的在利用经c2涂覆的ti玻璃料的经c2涂覆的不锈钢柱(柱b)上的分离的柱上氧化结果。图9a呈现了m/z＝327的氯氮平的质谱，而图9b呈现了m/z＝343的n-氧化物氯氮平的质谱。
[0097]
表3：实施例1的分离细节
[0098][0099]
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[0100][0101]
柱技术的选择对金属催化反应有影响。在本实施例中，研究了两种类型的柱。柱a是未经涂覆的不锈钢柱，而柱b是经c2涂覆的不锈钢柱。
[0102]
图7a至图7c示出了金属催化反应对于在未经涂覆的柱(柱a)上分离氯氮平的增加效果。在图7a中，在第一次进样后，观察到干净的氯氮平峰。然而，在向系统提供更多样品(图7b中所示的2次进样以及图7c中所示的13次进样)后，出现氯氮平的氧化物形式，从而使结果降级。图8a和图8b示出了氧化物形式的增加会继续增加并且极大地影响结果——比较图8a中两次进样后的氧化物峰与图8b中34次进样后的氧化物峰。
[0103]
结果的降级可通过选择柱体材料来最小化。图7a至图8b中所示的光谱呈现了未经涂覆的不锈钢柱的结果，并且呈现了n-氧化物峰随着越来越暴露于样品和流动相的增长。然而，通过选择不同的柱技术，即，涂覆有无机-有机杂化材料(即，c2)的不锈钢柱，结果的降级被最小化，因为氧化物峰(当存在时)没有增加到如图7a至图8b中所示的相同程度。图
10a至图10c提供了在经c2涂覆的柱上第一次、第二次和第十三次(分别)之后的光谱。图11a至图11b示出了在第二次进样和第三十四次进样之间n-氧化物峰的变化。
[0104]
实施例2：不同玻璃料材料的柱上氧化
[0105]
在0.1％(w/v)20/80/0.08乙腈/水/乙酸中制备氯氮平。使用经涂覆的惰性系统(acquity uplc premier lc系统，可从waters corporation,milford ma商购获得)和以下概述的分离方法对这些样品进行分析。图12a至图12d(在第二次进样之后)和图13a至图13d(在第五次进样之后)呈现了使用不同的玻璃料材料(例如，未经涂覆的金属，诸如不锈钢和钛，以及经涂覆的金属，包括经c2涂覆的不锈钢玻璃料和经c2涂覆的钛玻璃料)在柱中多次进样(即，第2次和第5次)的分离的柱上氧化结果。
[0106]
表4：实施例2的分离细节
[0107][0108]
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[0109][0110]
如在对结合杂化有机-无机涂层(在该实施例中为c2涂层)使用的不同玻璃料材料的评估中所示，具有c2涂层技术的不锈钢玻璃料和钛玻璃料两者，与它们对应的未经涂覆的玻璃料相比，均可减少胺的柱上降解。氯氮平是一种已知通过氢氧化铵和乙腈流动相进行柱上氧化的化合物，分离氯氮平后，与不锈钢玻璃料(未经涂覆的)相比，使用经c2涂覆的不锈钢玻璃料会使氯氮平n-氧化物减少50％。与没有涂层的钛玻璃料相比，在钛玻璃料上使用c2会观察到80％的减少。
[0111]
表5：氧化氯氮平占总峰面积的百分比
[0112][0113]
ss＝不锈钢；ti＝钛；c2ss＝不锈钢上的c2涂层；c2ti＝钛上的c2涂层。参见图12a至图12e和图13a至图13e。
[0114]
有趣的是，当比较所研究的玻璃料的性能时，经c2涂覆的钛玻璃料会产生最少量的氧化性物质，随后是填充有钛玻璃料的柱。经c2涂覆的不锈钢玻璃料虽然比标准不锈钢玻璃料更有优势，但在防止柱上氧化方面的有效性仍比使用钛玻璃料时低77％。有理由认为，c2涂层可能不能有效地应用于不锈钢玻璃料，并且改进的工艺或添加金属层可能证明更有效。然而，c2涂层会产生显著较低的氧化性物质，并且在经c2涂覆的钛的情况下，甚至可能潜在地防止氧化性物质的形成，如图11b中所示的在具有经c2涂覆的ti玻璃料的经c2不锈钢涂覆的柱上的34次进样所表明的。例如，比较图11a和图11b，示出了很少的氧化物峰增长，甚至没有氧化物峰生长。
[0115]
使用经掩蔽或涂覆的玻璃料的结果还显示，在用氢氧化铵和乙腈流动相分离氯氮平期间，亚硝化减少。虽然氯氮平的亚硝化不如氧化形式显著，但也记录到亚硝化的减少。图14a和图14b提供了在使用未经涂覆的不锈钢玻璃料的未经涂覆的柱中第二次进样和第三十四次进样氯氮平之后在已知的氯氮平亚硝基杂质峰(z异构体和e异构体的峰)处的光谱。随着更多的氯氮平被进样到系统中，会发生额外的亚硝化。然而，亚硝化在包含经c2涂覆的钛玻璃料的经c2涂覆的不锈钢柱中受到阻碍。将图14a和图14b中亚硝化峰(例如，在保留时间8.52和8.66处的峰)的生长缺乏与图15a和图15b中峰的缺乏进行比较。
[0116]
因此，在本发明的其他实施方案中，杂化有机-无机不限于c2涂层，而是应用于可掩蔽金属-分析物相互作用的任何涂层或配体。因此，不同模式的色谱以及各种分析物(即，不仅仅是胺)可受益于这种保护。例如，本技术可用于任何金属反应性分析物(诸如，例如苯胺)的分离或研究。还可防止或减少降解或金属催化反应的替代副产物。可以预见，该技术可应用于整个lc系统或ms仪器或甚至不同的表面，诸如样品小瓶或流动相容器，以防止可能在这些仪器或容器内发生的表面催化反应。
[0117]
实施例3：不同柱技术的柱上氧化
[0118]
在甲醇/水(1:1，体积/体积)中制备黄岑素、黄岑素氧化物、没食子酸丙酯和没食子酸丙酯氧化物以生成单个样品。使用waters acquity uplc h-class bio binary系统和以下使用不锈钢、具有未经涂覆的玻璃料的未经涂覆的柱(柱a)和具有经涂覆的玻璃料的经涂覆的不锈钢柱(柱b)概述的分离条件对样品(即，样品中的分析物)进行分析。流动相包括乙腈以及甲酸，已知它们在金属的存在下引起这些分析物的多酚氧化。图16a至图16b呈现了在未经涂覆的不锈钢柱(柱a)上第一次进样的分离的柱上氧化结果；并且图16c至图16d呈现了在经c2涂覆的不锈钢柱(柱b)上的结果。呈现了质谱，在质谱中标记了化合物及其氧化形式。这些光谱表明，与在经涂覆的柱b(其包括具有覆盖其润湿表面的涂层的钛玻
璃料)中相比，在未经涂覆的柱a中，氧化物峰(即，黄岑素氧化物和没食子酸丙酯氧化物)显著更大(即，含有更大量的氧化物形式)。
[0119]
表6：实施例3的分离细节
[0120][0121]
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[0122]

技术特征：
1.一种色谱柱，包括：玻璃料，所述玻璃料包括金属基材和围绕所述基材的表面的至少一部分的外部涂层，所述外部涂层包含无机-有机杂化物。2.根据权利要求1所述的色谱柱，其中所述金属基材包含基本上纯的钛。3.根据权利要求2所述的色谱柱，其中所述外部涂层包含c2和/或c2c10。4.根据权利要求2所述的色谱柱，其中所述玻璃料还包括设置在所述外部涂层的至少一部分与所述金属基材的所述表面之间的中间涂层。5.根据权利要求1所述的色谱柱，其中所述玻璃料还包括设置在所述外部涂层的至少一部分与所述金属基材的所述表面之间的中间涂层。6.根据权利要求4或5所述的色谱柱，其中所述中间涂层包含纯金属、金属氧化物、金属氮化物或金属碳化物。7.根据权利要求1所述的色谱柱，其中容纳在所述色谱柱内的暴露的金属壁的至少一部分包括流体接触涂层，所述流体接触涂层包含无机-有机杂化物。8.根据权利要求7所述的色谱柱，其中所述无机-有机杂化物包含c2和/或c210。9.根据权利要求7所述的色谱柱，其中所述金属基材包含钛。10.一种减少液相色谱期间样品组分的金属催化反应的方法，所述方法包括：在包括掩蔽金属玻璃料的色谱柱中分离样品，其中所述掩蔽金属玻璃料包括在外表面上涂覆有与所述样品无反应的无机-有机杂化涂层的金属玻璃料；以及用检测器来检测分离的样品组分。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述掩蔽金属玻璃料包括纯的或基本上纯的钛玻璃料。12.根据权利要求10所述的方法，其中所述掩蔽金属玻璃料包括钛合金玻璃料。13.根据权利要求10所述的方法，其中所述掩蔽金属玻璃料包括不锈钢玻璃料。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述不锈钢玻璃料包括在所述无机-有机杂化涂层之前施加的中间涂层，所述中间涂层包含钛、金属氧化物、金属氮化物或金属碳化物层。15.根据权利要求13所述的方法，其中所述不锈钢玻璃料包括与所述无机-有机杂化涂层同时施加的中间层，所述中间层包含钛、金属氧化物、金属氮化物或金属碳化物。16.根据权利要求10所述的方法，其中所述无机-有机杂化涂层包括烷基甲硅烷基涂层。17.根据权利要求10所述的方法，其中所述色谱柱内暴露的金属壁涂覆有所述无机-有机杂化涂层。18.根据权利要求17所述的方法，其中生物惰性泵连接到液相色谱系统。19.一种用于在包含胺的样品的分离中改进色谱性能的方法，所述方法包括：在惰性液相色谱系统中分离所述样品，所述惰性液相色谱系统包括柱，所述柱包括涂覆有无机-有机杂化涂层的钛玻璃料；以及使用基本上不含氧化杂质的uv检测器或ms检测器来检测所述样品的分离的组分。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述惰性液相色谱系统还包括生物惰性泵。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述惰性液相色谱系统还包括涂覆有无机-有机杂化涂层的内部柱表面。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述钛玻璃料涂覆有一层或多层c2。23.根据权利要求19所述的方法，其中所述钛玻璃料涂覆有c2的基底层和c2c10的顶层。24.根据权利要求19所述的方法，其中所述钛玻璃料涂覆有二醇包封的无机-有机杂化涂层。25.根据权利要求19所述的方法，其中所述钛玻璃料涂覆有苯基包封的无机-有机杂化涂层。26.一种用于液相色谱柱的惰性玻璃料，所述惰性玻璃料包括：不锈钢基材，所述不锈钢基材包括多层涂层，其中所述多层涂层包括与所述不锈钢基材相邻的钛层和包括无机-有机杂化涂层的外层。27.一种用于液相色谱柱的惰性玻璃料，所述惰性玻璃料包括：基本上纯的钛基材，其中c2和/或c2c10涂层覆盖所有外表面以防止所述液相色谱柱中的分析物-金属相互作用。

技术总结
本公开涉及一种减少液相色谱系统中样品组分的降解的方法。该方法利用掩蔽金属玻璃料来防止或减少金属表面变得具有催化活性。该掩蔽金属玻璃料是金属基玻璃料，该金属基玻璃料在其外表面上包含涂层以掩蔽或防止有机溶剂(和/或任何分析物或其他相关的溶剂)与底层金属之间的接触。该涂层是气相沉积的无机-有机杂化涂层，诸如气相沉积的C2涂层。诸如气相沉积的C2涂层。诸如气相沉积的C2涂层。


技术研发人员：M
受保护的技术使用者：沃特世科技公司
技术研发日：2021.09.24
技术公布日：2023/7/7