自扩增性SARS-COV-2RNA疫苗的制作方法

自扩增性sars-cov-2rna疫苗
技术领域
1.本发明涉及自复制性rna分子，其包含编码非结构性甲病毒蛋白的序列和编码sars-cov-2蛋白抗原的序列。


背景技术：

2.冠状病毒(cov)是属于冠状病毒科(coronaviridae)的正义单链rna病毒(ahmed等，2020)。新出现的sars-cov-2属于乙型冠状病毒，进一步分为四个谱系(即a-d)。谱系b包括sars-cov和sars-cov-2，有大约200个已公布的病毒序列，而谱系c包括中东呼吸综合征相关冠状病毒(mers-cov)，有超过500个病毒序列(letko等，2020)。sars-cov-2的基因组大小为约30kb，与其他冠状病毒一样，它编码多种结构性和非结构蛋白。结构蛋白包括刺突(s)蛋白、包膜(e)蛋白、膜(m)蛋白和核衣壳(n)蛋白。由于sars-cov-2最近才被发现，因此目前缺乏有关该病毒的可用信息。初步研究表明，基于全长基因组系统发育分析，sars-cov-2与sars-cov非常相似，并且具有推定的相似细胞进入机制和人类细胞受体使用(ahmed等，2020)。
3.由于sars-cov-2是一种rna病毒，它正在通过在全球不同地区不断出现的突变而迅速进化。因此，应密切监测能够改变重要病毒特性(例如传播率或致病能力)的突变。最近，某些突变导致了这些重要病毒参数的改变，产生了目前正在全球传播的三种受关注的变体(volz等，2021)。第一种受关注的变体b1.1.7起源于英国，在编码刺突蛋白的基因中包含三个关键突变：n501y、p681h和h69-v70。该变体与导致更高级别的疾病严重程度和传染性有关(davies等，2021)。第二种受关注的变体b.1.351首次在南非被鉴定出，并且在刺突蛋白编码区包含三个关键性的取代突变：n501y、k417n和e484k。该变体的数据表明，由于所述突变使得病毒的传播率增加和/或更容易逃避免疫响应(tegally等，2021)。目前受关注的最后一种变体p.1起源于巴西，并且在编码刺突蛋白的基因中包含与南非变体相同的关键性突变。因此，与野生型病毒相比，该变体也会导致更高的传播率(moore和offit,2021)。随着病毒的不断进化，未来极有可能出现更多的sars-cov-2变体。
4.所有cov都编码表面糖蛋白，刺突蛋白(spike)，它与宿主细胞受体结合并介导病毒进入。对于乙型冠状病毒，称为受体结合域(rbd)的刺突蛋白的单个区域介导与宿主细胞受体的相互作用。结合受体后，附近的宿主蛋白酶会切割刺突蛋白，这释放刺突蛋白融合肽，帮助病毒进入。已知的乙型冠状病毒宿主受体包括sars-cov的血管紧张素转换酶2(ace2)和mers-cov的二肽基肽酶4(dpp4)(letko等，2020)。研究表明，sars-cov-2刺突蛋白与ace2的结合亲和力高于sars-cov(zhou等，2020)。此外，核衣壳蛋白(nucleocapsid)也是通过蛋白质低聚化包装病毒基因组的重要亚基(zhou等，2020)。蛋白质序列比对分析表明，sars-cov-2在进化上与sars-cov最为保守。具体地，sars-cov-2的包膜和核衣壳蛋白是两个进化上保守的区域，与sars-cov相比，序列同一性分别为96％和89.6％。然而，刺突蛋白在sars-cov-2和sars-cov之间表现出最低的序列保守性(序列同一性为77％)。同时，与mers-cov相比，sars-cov-2的刺突蛋白只有31.9％的序列同一性(zhou等，2020)。
5.近年来，注意力已转向dna(pdna)疫苗接种。与更传统的疫苗接种方法相比，dna疫苗接种的主要优势之一是疫苗抗原是由宿主细胞从头产生的。dna疫苗能够在动物体内诱导针对多种抗原的有效t细胞和b细胞免疫响应。这最终导致基于质粒dna的动物用疫苗的开发和商业化(davis等，2001；garver等，2005；kurath等，2006；grosenbaugh等，2011)。然而，迄今为止，人用dna疫苗的开发并没有取得同样的成功。虽然许多临床试验证明了dna疫苗在人体中诱导细胞t细胞和b细胞响应的主要能力，但这些免疫响应的强度远低于通过更传统方法实现的强度。此外，dna疫苗有若干缺点，例如在非分裂或缓慢分裂细胞中的低效、dna构建体的表观遗传沉默、抗生素抗性基因的存在和长期不受控制的表达，这些可能不一定与良好的免疫响应相关，甚至可能对预期的免疫效应不利并导致t细胞耗尽(wherry等，2003；shin和wherry,2007；han等，2010)。对dna疫苗在人类中“表现不佳”的不同解释可能是这些疫苗的比假定的更弱的佐剂性。细胞质dna传感器在诱导dna依赖性免疫响应中的重要性最近得到越来越多的认可(aoshi等，2011；marichal等，2011；desmet和ishii，2012)。可以想象，如果没有复杂的传递方法的帮助，细胞质中可能没有足够的dna，或者这些传感器对dna刺激的敏感性存在物种差异(kallen和theβ，2014)。
6.因此，研究人员转向了rna(mrna)疫苗的应用。利用了转染的细胞的机制来将信息在体内翻译成相应的蛋白质，这是具有药理学活性的产物。ivt mrna药效学活性的主要区室是细胞质。与在细胞核中产生并通过核输出进入细胞质的天然mrna不同，ivt mrna必须从细胞外空间进入细胞质。一旦ivt mrna进入细胞质，其药理学受调节天然mrna稳定性和翻译的相同复杂细胞机制支配。从ivt mrna翻译而来的蛋白质产物经过翻译后修饰，该蛋白质是生物活性化合物。ivt mrna模板和蛋白质产物的半衰期是基于mrna的疗法的药代动力学的关键决定因素。对于免疫治疗方法，编码蛋白的加工途径对于确定其药效学至关重要。与内源性产生的蛋白质的命运类似，mrna编码的产物被蛋白酶体降解，并在主要组织相容性复合物(mhc)i类分子上呈递给cd8+t细胞。一般来说，细胞内蛋白不会到达mhc ii类加工途径来诱导t辅助细胞响应。然而，通过将分泌信号引入抗原编码序列，随着分泌信号将蛋白质抗原重新导向细胞外空间，可以实现t辅助细胞响应(sahin等，2014)。
7.在二十世纪九十年代，开始了针对不同应用的ivt mrna的临床前探索，包括用于癌症和传染病的蛋白质替代和疫苗接种方法。因此，积累的知识使最近的科学和技术进步能够克服与mrna相关的一些障碍，例如其半衰期短和不利的免疫原性(sahin等，2014)。
8.在宿主细胞的细胞质中递送合成mrna后，未修饰的合成mrna被识别为外来物并被模式识别受体(prr)检测到，这导致先天免疫响应(tam和jacques，2014)。合成mrna还可以通过触发细胞质rig-i和mda5来激活先天免疫系统(schlee等，2009；goubau等，2014；reikine等，2014)。此外，有迹象表明合成的mrna分子也被nlr识别，通过caspase-1介导的细胞焦亡导致细胞死亡(bergsbaken等，2009；andries等，2013)。因此，通过激活促进mrna疫苗接种后细胞和体液响应的不同细胞因子的表达，基于未修饰的合成mrna的基因疫苗可以充当优异的自身佐剂。然而，载体介导的未修饰mrna递送后的先天免疫响应可能如此强烈，以致于导致mrna翻译受阻甚至mrna降解(kormann等，2011；katalin karik
ó
等，2012；wu和brewer，2012；zangi等，2013；zhong等，2018)。此外，最近的报告显示，由未修饰/非hplc纯化的合成mrna的免疫刺激性质所引发的i型ifn可能会对cd8+t细胞刺激产生负面影响(de beuckelaer等，2017)。合成mrna固有的先天免疫原性也是一个潜在的安全问题，因为i
型干扰素与血栓性微血管病(kavanagh等，2016)、贫血(libregts等，2011)和自身免疫性疾病(di domizio和cao，2013)相关。因此，寻求mrna翻译和先天免疫响应之间的完美平衡非常重要。在这种情况下，在ivt-mrna中掺入天然存在的修饰核苷，例如假尿苷、2-硫尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基胞苷或n6-甲基腺苷，已显示可显著减少免疫刺激并稳定分子以抵抗rna酶裂解(katalin karik
ó
等，2005，2012；b.r.anderson等，2011；kormann等，2011)。尿苷耗竭是序列工程的最新形式，可降低免疫原性并增加翻译活性(参见发明人文章：10.1016/j.omtn.2018.06.010)。此外，修饰后的mrna的免疫刺激可以通过采用例如反相色谱法的纯化进一步降低(karik
ó
等，2005；bart r.anderson等，2010；andries，mccafferty等，2015)。通过修饰ivt-mrna的不同结构元件以系统地提高其细胞内稳定性和翻译效率，可以使ivt-mrna的蛋白质表达显著增加几个数量级(k karik
ó
等，1999；holtkamp等，2006；kallen和theβ，2014)。
9.对于疫苗接种，ivt mrna的强大免疫刺激作用和内在佐剂活性导致有效的抗原特异性细胞和体液免疫响应(sahin等，2014)。使用mrna进行疫苗接种的主要优点是同一分子不仅为适应性免疫提供抗原来源，而且可以同时与模式识别受体结合，从而刺激先天免疫。可以通过核酸或dna/rna疫苗接种有效地引发对蛋白质抗原的体液和细胞免疫响应。在基于核酸的疫苗接种中，免疫原性蛋白以正确的翻译后修饰、构象或低聚化表达；这确保了刺激中和抗体(b细胞)响应的表位的完整性。
10.然而，在概念上，基于ivt mrna方法与其他基于核酸的技术(例如dna疫苗)之间存在若干重要差异。ivt mrna无需进入细胞核即可发挥作用；一旦到达细胞质，mrna就会立即被翻译。相比之下，dna需要进入细胞核才能转录成rna，并且其功能性取决于细胞分裂过程中的核膜破裂(sahin等，2014)。此外，mrna可以被递送到非分裂细胞，因为它不需要像dna质粒一样进入细胞核(sergeeva等，2016)。此外，与质粒dna和病毒载体不同，基于ivt mrna的疗法不会整合到基因组中，因此不会造成插入性突变的风险。另外有利的是，ivt mrna仅具有短暂活性并通过生理代谢途径完全降解(sahin等，2014)。rna免疫在刺激t细胞响应方面特别有效，因为抗原肽是在瞬时体内转染后表达的细胞内或细胞外蛋白抗原的(内源性或外源性)加工途径(不受病毒蛋白干扰)中有效产生的。在真核或原核表达系统中生产的重组亚基疫苗很难实现这两个特征(reimann和schirmbeck，2000)。尽管由天然传染原产生的亚基疫苗仍然发挥着重要作用，但生产和纯化免疫原的成本可能高得令人望而却步。通过依靠患者的身体来制造所需的蛋白质，ivt mrna药物提供了一种方法，使治疗性蛋白质的稳健和可调节性的生产成为可能，而无需在发酵罐中昂贵地制造蛋白质(sahin等，2014)。
11.此外，大约10年前，pascolo(2004)指出，大规模生产mrna的成本将低于生产dna的成本(pascolo,2004)。基于mrna的核苷酸疫苗提供了灵活性，可以在很短的时间内将几乎任何蛋白质编码为抗原，但它们可以在相同的生产设施中以相同的生产过程生产。因此，可以在很短的时间内用有限的财政投资制造出新型疫苗，这对于传染病的大流行场景非常重要(kallen和theβ，2014)。使用ivt mrna作为药物背后的概念是将限定的遗传信息转移至患者细胞内，最终目的是预防或改变特定疾病状态(sahin等，2014)。原则上，正在研究两种使用ivt mrna的方法。一种是将其离体转移到患者的细胞中；然后将这些转染的细胞过继地回输给患者。第二种方法是使用各种途径在体内直接递送ivt mrna。
12.自扩增性(sa)病毒mrna复制子含有rdrp基因并模仿正链rna病毒的复制特征(etchinson和ehrenfeld，1981；mizutani和colonno，1985；van der werf等，1986；c.m.rice等，1987；和garoff，1991；rolls等，1994；khromykh和westaway，1997；perri等，2003)。复制子rna可以通过cdna模板的体外转录很容易地产生。rna病毒的结构基因被所关注的异源基因取代，这受亚基因组启动子控制(xiong等，1989；zhou等，1994；ying等，1999；hewson，2000；lundstrom，2009)。
13.最近，sa-mrna(rna复制子)疫苗接种被认为是基于纳米技术的创新疫苗接种策略(andries，kitada等，2015)。如前所述，与病毒复制子颗粒(即包封在病毒衣壳蛋白中的rna)不同，rna复制子只能通过体外转录产生。因此，整个制造过程完全无细胞，从而产生了一种组成被精确限定的治疗剂。rna复制子疫苗具有若干有吸引力的特点，例如与其非复制性对应物相比，持续时间(约2个月)和表达量级延长(kowalski等，2019)。此外，sa-mrna的细胞内复制是短暂的，它在复制过程中产生双链rna(dsrna)中间体，其可通过触发模式识别受体诱导干扰素介导的宿主防御机制。这导致针对插入的靶分子的强烈抗原特异性免疫响应。因此，sa-mrna载体系统非常适合疫苗开发，因为它们提供高瞬时转基因表达和固有的佐剂效应(sahin等，2014)。
14.根据常见的分类，可使用两种类型的载体将遗传物质递送至靶细胞。一方面，使用模仿其前体病毒行为的病毒载体。已经采用了不同类型的载体，包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒，甚至在欧洲被批准用于临床。另一方面，存在可以根据其组成来描述的非病毒载体。最常被引用的是脂质复合体(lipoplex)(脂质+dna或rna)和聚合物复合体(polyplex)(聚合物+dna或rna)(perez ruiz de garibay，2016)。
15.使用失活或非复制性病毒载体进行基因传递约占临床试验的三分之二(ginn等，2018)，根据治疗靶标选择任何特定的病毒载体。例如，经常使用的腺病毒血清型5(ad5)载体可以靶向分裂或非分裂细胞。尽管ad5病毒稳定且易于进行基因操控，但它们的免疫原性阻碍了临床转化(salameh等，2019)。腺相关病毒(aav)是研究最活跃的基因治疗载体之一，通常显示其免疫原性低于其他病毒。然而，对aav的预先存在的免疫力，尤其是循环中和抗体的存在，会对aav的临床疗效产生显著影响。迄今为止，这代表使用全身性递送aav的最大治疗挑战之一，并且被认为是早期临床失败的因素之一(naso等，2017)。逆转录病毒和慢病毒可以将它们的基因组整合到宿主细胞中，导致长期的转基因表达。然而，逆转录病毒只能转染分裂活跃的细胞，因此不能靶向非分裂细胞(例如，脑组织中的细胞)。此外，逆转录病毒和慢病毒载体制造成本高，而且作为重组载体的稳定性不如ad5，阻碍了基因转移的可重复性。病毒载体诱导的先天性和适应性免疫响应进一步限制了它们的功效。因此，许多努力都集中在通过共价连接合成聚合物例如聚乙二醇(peg)和聚-n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺聚(hpma)来掩蔽免疫原性。这种聚合物-病毒杂交体可以产生稳定、持续的基因表达，并转染非分裂细胞(ramsey等，2010)。不幸的是，副作用的减少伴随着不希望的转染效率的大幅降低(salameh等，2019)。
16.相反，由聚合物、脂质体或其他纳米级结构制备的非病毒载体提供了克服病毒载体缺点的途径。非病毒载体是更安全的平台，它们的生产比病毒载体更简单、更廉价且可重复性更高。此外，可以递送的dna或rna载荷没有限制。非病毒载体转染功效是它们的主要限制，但已通过多种策略得到改进，导致进入临床试验的产品数量增加(del pozo-rodr
í
guez
等，2016；molla和levkin，2016；perez ruiz de garibay，2016)。
17.编码基因产物例如蛋白质和rna(例如，小rna)的核酸可以被直接递送至所需的脊椎动物受试者，或者可以离体递送至从受试者获得或衍生的细胞，并且可以将细胞重新植入受试者。将此类核酸递送至脊椎动物受试者对于许多目的是期望的，例如用于基因治疗，以诱导针对编码的多肽的免疫响应，或调节内源基因的表达。这种方法的使用曾受到阻碍，因为游离dna不容易被细胞摄取，并且游离rna在体内迅速降解。因此，已使用核酸递送系统来提高核酸递送的效率。
18.核酸递送系统可分为两大类，重组病毒系统和非病毒系统。病毒作为病毒载体是一种高效的传递系统，已经进化而可以感染细胞。一些病毒已经被改变以产生不具有传染性的病毒载体，但仍然能够有效地将编码外源基因产物的核酸递送至宿主细胞。然而，某些类型的病毒载体，如重组病毒，仍然存在潜在的安全性和有效性问题。例如，当使用涉及包装的方法生产载体时，可能会通过载体成分之间的重组事件产生传染性病毒，病毒蛋白可能会诱导不希望的免疫响应，这可能缩短转基因表达的时间，甚至可能阻止重组病毒的重复使用。参见例如，seung等，gene therapy 10:706-711(2003)，tsai等，clin.cancer.res.10:7199-7206(2004)。
19.此外，使用重组病毒可递送的核酸大小存在限制，这会阻碍大核酸或多种核酸的递送。通常研究的非病毒递送系统包括游离核酸(例如dna或rna)的递送，以及含有核酸和脂质(例如，脂质体)的制剂、多阳离子或旨在提高转染率的其他试剂的递送。参见例如，montana等，bioconjugate chem.18:302-308(2007)，ouahabi等，febs letters,380:108-112,(1996)。然而，这些类型的递送系统通常不如重组病毒有效。
20.核酸疫苗诱导的免疫响应应包括对核酸编码的抗原的响应，并赋予病原体特异性免疫。抗原持续时间、剂量和抗原呈递给免疫系统的类型是与免疫响应的类型和幅度相关的重要因素。核酸疫苗接种的功效通常受到核酸进入细胞的低效摄取的限制。通常，在注射部位处不到1％的肌肉或皮肤细胞表达所关注的基因。当希望基因疫苗进入靶组织中存在的特定细胞亚群时，这种低效率尤其成问题。参见例如，restifo等，gene therapy 7:89-92(2000)。
21.自复制性rna分子在宿主细胞中复制，导致编码所需基因产物的rna数量增加，可以提高rna递送和编码的基因产物表达的效率。参见例如，johanning,f.w.等，nucleic acids res.,23(9):1495-1501(1995)；khromykh,a.a.,current opinion in molecular therapeutics,2(5):556-570(2000)；smerdou等，current opinion in molecular therapeutics,1(2):244-251(1999)。自复制性rna已作为病毒颗粒和游离rna分子产生。然而，游离rna分子在体内会迅速降解，并且大多数经过测试的基于rna的疫苗在提供产生强烈、持久的免疫响应所需的剂量和持续时间的抗原方面的能力有限。参见例如，probst等，genetic vaccines and therapy,4:4；doi:10.1186/1479-0556-4-4(2006)。
22.由sars-cov-2引起的covid-19传染病导致全球大流行。目前，188个国家和地区已报告超过1.75亿例病例，导致约3700000人死亡，急诊室人满为患。疫情爆发也被证明对全球经济构成威胁，使其成为人类历史上损失最惨重的灾难。尽管世界各国政府采取了严厉措施，并且虽然一些疫苗已通过紧急程序获得批准，但仍然迫切需要获得一种能够针对各种sars-cov-2变体引发持续保护的有效sars-cov-2疫苗。事实证明，针对这些病毒的疫苗
开发是一项艰巨的任务，因为一些报告质疑sars-cov-2感染患者的抗体响应的寿命，并且已显示同系物再次感染。此外，患者、即使是那些只有轻微症状的患者也可能会持续很长时间存在症状，这表明病毒持续存在。另一个问题涉及病毒的快速进化和sars-cov-2变体的出现，这些变体具有改变的病毒性质，包括传播率和致病能力。最后，未检测到sars-cov-2的康复患者在后来的时间段内检测呈阳性，表明存在持续性或复发性感染。因此，需要一种有效的sars-cov-2疫苗，它能产生足够的免疫响应，以显著降低sars-cov-2感染和严重疾病的机会，并且优选具有长期疗效，同时允许对已知的和未来的sars-cov-2变体进行强有力的保护。
23.sheahan等(2011)描述了用包含sars-cov的s蛋白作为抗原的委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelan equine encephalitis virus)复制子颗粒疫苗对小鼠进行免疫。然而，该技术并未针对人类使用进行优化，也未披露对sars-cov-2有任何影响。
24.与此同时，ema和fda已通过有条件的营销授权(conditional marketing authorisation)程序批准了两种针对sars-cov-2的rna疫苗，这些疫苗专门用于紧急情况，但这些疫苗需要高的多剂量mrna。这些疫苗的生产昂贵且费时。此外，高浓度的rna可能会对接受剂量的患者造成副作用。因此，需要一种更有效和更强力的rna疫苗，其解决本文所列出的一个或多个问题。


技术实现要素：

25.发明人现已出人意料地鉴定出满足上述需求的包含sars-cov-2抗原的自复制性rna分子，如权利要求中详述。特别是，已经发现编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列和编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原的序列的组合导致强烈的结合抗体响应，在体内有效中和sars-cov-2，同时引发cd4+和cd8+t细胞免疫，并提供针对各种sars-cov-2变体的稳健保护。
26.在第一方面，本发明提供了一种自复制性rna分子，其包含编码sars-cov-2抗原的序列。在一些实施方式中，自复制性rna分子基于甲病毒(alpha virus)/委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelan equine encephalitis virus)的rna基因组。优选地，自复制性rna分子含有编码基因产物例如靶蛋白(例如抗原)或rna(例如小rna)/至少一种sars-cov-2抗原的异源序列。在一个特定的实施方式中，自复制性rna分子含有突变，优选5’utr中的a3g取代和nsp2 q739l突变。
27.在一个特定的实施方式中，sars-cov-2抗原是sars-cov-2刺突蛋白抗原。在另一个实施方式中，刺突蛋白抗原是包含受体结合域(rbd)的刺突蛋白的截短形式。在另一个实施方式中，刺突蛋白融合至免疫刺激蛋白，例如c3d-p28。
28.在另一个特定的实施方式中，sars-cov-2抗原是sars-cov-2核衣壳蛋白抗原。在又一个特定的实施方式中，sars-cov-2抗原是sars-cov-2膜蛋白抗原。在优选的实施方式中，自复制性rna分子包含编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列，并且还包含编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原和/或sars-cov-2膜蛋白抗原的序列。在一个实施方式中，本发明提供了一种自复制性rna分子，其包含编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列，并且还包含编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原的序列。在另一个实施方式中，本发明提供了一种自复制性rna分子，其包含编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列，并且还包含编码sars-cov-2膜蛋白抗
原的序列。
29.在另一方面，本发明涉及药物组合物(例如，免疫原性组合物和疫苗)，其包含如本文所述的自复制性rna分子以及药学上可接受的载体和/或药学上可接受的载剂。药物组合物还可包含至少一种佐剂和/或核酸递送系统。在一些实施方式中，该组合物还包含阳离子脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、脂质卷(cochleate)、病毒体、免疫刺激复合物、微粒、微球、纳米球、单层囊泡、多层囊泡、水包油乳液、油包水乳液、乳化体(emulsome)、多阳离子肽、阳离子纳米乳液或其组合。
30.在特定的实施方式中，自复制性rna分子被包封在阳离子脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、脂质卷、病毒体、免疫刺激复合物、微粒、微球、纳米球、单层囊泡、多层囊泡、水包油乳液、油包水乳液、乳化体、多阳离子肽、阳离子纳米乳液和它们的组合中，或者与其结合，或者吸附于其上。
31.在另一方面，本发明涉及使用本文所述的自复制性rna分子和药物组合物的方法，包括治疗或预防疾病如传染病、特别是冠状病毒疾病的医药用途。在一个特定的实施方式中，本发明提供了如本文所述的自复制性rna分子和组合物，用于预防和/或治疗由sars-冠状病毒引起的疾病，特别是由sars-cov-2、更特别是covid-19引起的疾病。因此，本发明还提供了如本文所述的自复制性rna分子和组合物，用于针对sars-cov-2进行疫苗接种。所述方法包括将有效量的如本文所述的自复制性rna分子或组合物施用于有需要的受试者。例如，本发明提供了本发明的编码抗原的自复制性rna分子用于在受试者中诱导免疫响应的用途。
32.本发明还提供了在受试者中诱导sars-cov-2抗原产生的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的自复制性rna分子或组合物。本发明还涉及一种在受试者中诱导免疫响应的方法，包括向受试者施用有效量的本文所述的药物组合物。在另一个实施方式中，本发明还提供了在受试者中诱导产生抗sars-cov-2抗体的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的自复制性rna分子或组合物。
33.本发明还涉及对受试者进行疫苗接种的方法，包括向受试者施用本文所述的药物组合物。
34.本发明还涉及一种诱导哺乳动物细胞产生sars-cov-2和抗原的方法，包括在适合细胞摄取自复制性rna分子的条件下使细胞与本文所述的药物组合物接触的步骤。
35.本发明还涉及用于基因递送的方法，包括施用本文所述的药物组合物。
36.具体地，本发明通过以下实施方式进行定义，但其不是限制本发明：
37.1.一种组合，所述组合包含编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列和编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原的序列，其中，所述编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列和所述编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原的序列包含在一种或多种自复制性rna分子中，并且其中所述一种或多种自复制性rna分子还包含编码非结构性甲病毒蛋白的序列。
38.2.根据实施方式1所述的组合，其中，所述编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列和所述编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原的序列包含在相同的自复制性rna分子中，或者其中所述编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列和所述编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原的序列包含在不同的自复制性rna分子中。
39.3.根据实施方式1或2所述的组合，其中，所述甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒
(veev)，例如tc-83毒株或与其具有至少90％序列同一性、优选至少95％序列同一性、更优选至少97％序列同一性的毒株。
40.4.根据前述实施方式中任一项所述的组合，其中，所述一种或多种自复制性rna分子包含5’utr中的a3g突变和/或非结构蛋白2(nsp2)中的q739l突变。
41.5.根据前述实施方式中任一项所述的组合，其中，所述刺突蛋白抗原是包含受体结合域(rbd)的刺突蛋白的截短形式。
42.6.根据实施方式5所述的组合，其中，所述rbd对应于seq id no：1或与其具有至少95％同一性、优选至少97％序列同一性、更优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。
43.7.根据前述实施方式中任一项所述的组合，其中，所述一种或多种自复制性rna分子包含veev tc-83毒株的非结构蛋白、5’utr中的a3g突变和nsp2中的q739l突变。
44.8.根据前述实施方式中任一项所述的组合，其中，所述编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列包含：5’帽，随后的编码非结构性甲病毒蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的序列，亚基因组启动子以及随后的编码sars-cov-2刺突蛋白抗原或包含受体结合域(rbd)的刺突蛋白的截短形式的序列，以及处于所述sars-cov-2刺突蛋白抗原或截短形式的下游的poly-a尾部。
45.9.根据前述实施方式中任一项所述的组合，其中，所述编码sars-cov-2核衣壳蛋白(n)抗原的序列包含：5’帽，随后的编码非结构性甲病毒蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的序列，亚基因组启动子以及随后的编码sars-cov-2n蛋白抗原的序列，以及处于所述sars-cov-2n蛋白抗原的下游的poly-a尾部。
46.10.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据前述实施方式中任一项所述的组合以及药学上可接受的载体和/或药学上可接受的载剂。
47.11.根据实施方式10所述的药物组合物，所述药物组合物还包含至少一种佐剂。
48.12.根据实施方式10或11所述的药物组合物，所述药物组合物还包含阳离子脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、脂质卷、病毒体、免疫刺激复合物、微粒、微球、纳米球、单层囊泡、多层囊泡、水包油乳液、油包水乳液、乳化体、多阳离子肽或阳离子纳米乳液。
49.13.根据实施方式10至12中任一项所述的药物组合物，其中，所述一种或多种自复制性rna分子被包封在阳离子脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、脂质卷、病毒体、免疫刺激复合物、微粒、微球、纳米球、单层囊泡、多层囊泡、水包油乳液、油包水乳液、乳化体、多阳离子肽、阳离子纳米乳液和它们的组合中，或者与其结合，或者吸附于其上。
50.14.一种疫苗，所述疫苗包含根据前述实施方式中任一项所述的组合，其中，所述rna分子被包封在阳离子脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、脂质卷、病毒体、免疫刺激复合物、微粒、微球、纳米球、单层囊泡、多层囊泡、水包油乳液、油包水乳液、乳化体、多阳离子肽、阳离子纳米乳液和它们的组合中，或者与其结合，或者吸附于其上；并且其中所述疫苗中的所述rna的有效剂量为0.1μg至100μg。
51.15.实施方式1至9中任一项所述的组合或实施方式10至13中任一项所述的药物组合物或实施方式14所述的疫苗，其用作药物。
52.16.实施方式1至9中任一项所述的组合或实施方式10至13中任一项所述的药物组合物或实施方式14所述的疫苗，其用于预防和/或治疗传染性疾病。
53.17.实施方式1至9中任一项所述的组合或实施方式10至13中任一项所述的药物组
合物或根据实施方式14所述应用的疫苗，其用于在受试者中诱导免疫响应。
54.18.实施方式1至9中任一项所述的组合或实施方式10至13中任一项所述的药物组合物或根据实施方式14所述的疫苗，其用于为受试者接种疫苗以抵抗冠状病毒疾病，例如sars-cov、sars-cov-2或mers-cov。
55.19.根据实施方式15至18中任一项所述应用的组合、药物组合物或疫苗，其中，所述rna的有效剂量为0.1μg至100μg。
56.20.根据实施方式15至19中任一项所述应用的组合、药物组合物或疫苗，其中，所述组合、组合物或疫苗通过肌内、皮内或皮下施用。
57.21.根据实施方式15至20中任一项所述应用的组合、药物组合物或疫苗，其中，所述组合、组合物或疫苗作为单剂量或多剂量施用，需要将两次以上的剂量连续地在预先限定的时间跨度内施用。
58.22.根据实施方式15至21中任一项所述应用的组合、药物组合物或疫苗，其中，定期施用所述组合、药物组合物或疫苗，例如每年或每半年施用。
59.23.根据前述实施方式中任一项所述应用的组合、药物组合物或疫苗，其中，所述疫苗的剂量为0.05ml至1ml。
60.24.一种包含自复制性rna分子的冠状病毒疫苗，所述每个自复制性rna分子包含编码非结构性甲病毒蛋白的序列和编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列，其中，所述rna分子被包封在阳离子脂质、脂质纳米颗粒、脂质体、脂质卷、病毒体、免疫刺激复合物、微粒、微球、纳米球、单层囊泡、多层囊泡、水包油乳液、油包水乳液、乳化体、多阳离子肽、阳离子纳米乳液和它们的组合中，或者与其结合，或者吸附于其上。
61.25.根据实施方式24所述的疫苗，其中，所述甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒(veev)，例如tc-83毒株或与其具有至少90％序列同一性、优选至少95％序列同一性、更优选至少97％序列同一性的毒株。
62.26.根据实施方式24或25所述的疫苗，所述疫苗包含5’utr中的a3g突变和/或非结构蛋白2(nsp2)中的q739l突变。
63.27.根据前述实施方式24至26中任一项所述的疫苗，其中，所述刺突蛋白抗原是包含受体结合域(rbd)的刺突蛋白的截短形式，其中所述rbd对应于seq id no：1或与其具有至少95％同一性、优选至少97％序列同一性、更优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。
64.28.根据前述实施方式24至27中任一项所述的疫苗，其中，所述刺突蛋白融合至免疫刺激蛋白，例如c3d-p28。
65.29.根据前述实施方式24至28中任一项所述的疫苗，所述疫苗还包含编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原和/或sars-cov-2膜蛋白抗原的序列。
66.30.根据前述实施方式24至29中任一项所述的疫苗，所述疫苗包含veev tc-83毒株的非结构蛋白、5’utr中的a3g突变和nsp2中的q739l突变，以及编码包含rbd的sars-cov-2刺突蛋白的截短形式的25序列。
67.31.根据前述实施方式中任一项所述的疫苗，其中每个所述自扩增性rna分子包含：5’帽，随后的编码非结构性甲病毒蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的序列，亚基因组启动子以及随后的编码sars-cov-2刺突蛋白抗原或包含受体结合域(rbd)的刺突蛋白的截短形式的序列，以及处于所述sars-cov-2刺突蛋白抗原或截短形式的下游的poly-a尾部。
68.32.根据前述实施方式24至31中任一项所述的疫苗，其中，所述疫苗在被施用于受试者、优选人类受试者时能够在所述受试者中引发或诱导针对sars-cov-2和/或其变体的免疫响应。
69.33.根据前述实施方式24至32中任一项所述的疫苗，其中，所述疫苗被配制成使得所述疫苗的一个剂量包含0.1μg至100μg的rna。
70.34.根据前述实施方式24至33中任一项所述的疫苗，其中，所述疫苗的剂量为0.05ml至1ml。
71.35.根据前述实施方式中任一项所述的疫苗，所述疫苗还包含佐剂。
72.36.一种治疗或预防冠状病毒感染、优选sars-cov-2感染的方法，所述方法包括对受试者、优选人类受试者施用实施方式1至9中任一项所述的组合、实施方式10至13中任一项所述的药物组合物或实施方式14至35中任一项所述的疫苗。
73.37.一种在受试者中诱导针对冠状病毒感染、优选sars-cov-2感染的免疫响应的方法，所述方法包括对受试者、优选人类受试者施用实施方式1至9中任一项所述的组合、实施方式10至13中任一项所述的药物组合物或实施方式14至35中任一项所述的疫苗。
74.38.根据实施方式36或37所述的方法，其中，通过皮下、肌内或皮内注射将所述组合、药物组合物或疫苗施用于所述受试者。
75.39.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，施用的剂量包含0.1μg至100μg rna。
76.40.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述组合、药物组合物或疫苗作为单剂量或多剂量施用，需要将两次以上的剂量连续地在预先限定的时间跨度内施用。
77.41.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，定期施用所述组合、组合物或疫苗，例如每年或每半年施用。
78.42.一种载体，所述载体包括：
[0079]-抗原序列，其中所述抗原序列编码sars-cov-2的抗原，并且其中所述抗原位于启动子序列、优选地甲病毒衍生的亚基因组启动子(sgp)的下游；
[0080]-处于所述抗原序列的下游的poly(a)序列；和
[0081]-编码委内瑞拉马脑炎病毒的非结构蛋白nsp1至nsp4的序列。
[0082]
43.根据实施方式42所述的载体，其中，所述抗原序列编码sars-cov-2刺突蛋白或其截短形式，或者其中所述抗原序列编码sars-cov-2核衣壳蛋白(n)抗原。
[0083]
44.根据实施方式42和43所述的载体，其中，所述刺突蛋白的截短形式包含受体结合域(rbd)。
[0084]
45.根据前述实施方式中任一项所述的载体，其中，nsp2的序列使得其编码具有q739l突变的nsp2蛋白和/或在所述载体的5’utr中的a3g突变。
[0085]
46.根据前述实施方式中任一项所述的载体，其中，所述载体是质粒或线性化dna。
附图说明
[0086]
图1：表明sarna表达s1-rbd蛋白表达能力的western印迹。
[0087]
图2：表明sarna表达n蛋白表达能力的western印迹。
[0088]
图3：皮内注射+电穿孔后的sarna-s1 rbd的免疫原性。
[0089]
图4：sarna-s1 rbd肌内注射的免疫原性。
[0090]
图5显示了体内施用模拟疫苗(荧光素酶)后swiss小鼠的抗原表达。
[0091]
图6显示了在对swiss小鼠进行体内s-rbd和s-rbd+n初免疫苗接种后对sars-cov-2s-特异性结合抗体响应的诱导。数据显示为平均值
±
sd的单个值(n＝6只小鼠/组)；ns＝非显著，*p《0.05，**p》0.01，***p》0.001，****p《0.0001。
[0092]
图7显示了在对swiss小鼠进行体内n和s-rbd+n初免疫苗接种后对sars-cov-2n-特异性结合抗体响应的诱导。数据显示为平均值
±
sd的单个值(n＝6只小鼠/组)；ns＝非显著，*p《0.05，**p》0.01，***p》0.001，****p《0.0001。
[0093]
图8显示了在对swiss小鼠进行体内s-rbd和s-rbd+n初免疫苗接种(经加强免疫增强)后对sars-cov-2s-特异性结合抗体响应的诱导。数据显示为平均值
±
sd的单个值(n＝6只小鼠/组)；ns＝非显著，*p《0.05，**p》0.01，***p》0.001，****p《0.0001。
[0094]
图9显示了在对swiss小鼠进行体内n和s-rbd+n初免疫苗接种(经加强免疫增强)后对sars-cov-2n-特异性结合抗体响应的诱导。数据显示为平均值
±
sd的单个值(n＝6只小鼠/组)；ns＝非显著，*p《0.05，**p》0.01，***p》0.001，****p《0.0001。
[0095]
图10显示用sa-rna-s-rbd以及sa-rna-s-rbd+sa-rna-n组合的疫苗接种在小鼠中诱导了针对野生型sars-co-2(武汉)的中和抗体。
[0096]
图11显示了仓鼠在感染野生型sars-co-2(武汉)之日和处死之日之间的体重变化。
[0097]
图12显示了仓鼠中每毫克肺组织的sars-cov-2rna基因组拷贝数。
[0098]
图13显示了在接种仓鼠血清的50％细胞中产生细胞病变效应所需的病毒量(tcid50)。
[0099]
图14显示用lnp s-rbd+n sarna免疫在仓鼠中诱导了中和抗体(武汉sars-cov毒株)。
[0100]
图15显示低剂量的zip-lnp s-rbd+n sarna(zip1642)免疫降低了经疫苗接种的仓鼠的肺组织中的il-6细胞因子mrna表达。
[0101]
图16显示zip-lnp s-rbd+n sarna(zip1642)免疫降低了经疫苗接种的仓鼠的肺组织中的ip-10趋化因子mrna表达。
[0102]
图17显示1μg和5μg剂量的zip-lnp s-rbd+n sarna(zip1642)免疫降低了感染sars-cov-2的仓鼠肺部的组织病理学特征。
[0103]
图18显示1μg和5μg剂量的zip-lnp s-rbd+n sarna(zip1642)免疫在仓鼠中诱导强烈的sars-cov-2特异性结合抗体响应。
[0104]
图19显示了可用作本文所述疫苗的rna组分的s-rbd+n sarna构建体的实例。
[0105]
图20显示了在对swiss小鼠进行体内s-rbd和s-rbd+n初免疫苗接种后th2、th1和ctl细胞的s-特异性t细胞响应。数据显示为平均值
±
sd的单个值(n＝6只小鼠/组)；ns＝非显著，*p《0.05，**p》0.01，***p》0.001，****p《0.0001。
具体实施方式
[0106]
本发明涉及自复制性rna分子和将自复制性rna用于治疗目的的方法，例如用于免疫或基因治疗。特别是，本发明提供了主动免疫预防由sars-cov-2病毒引起的covid-19的
方法。
[0107]
最近，sa-mrna(rna复制子)疫苗接种被认为是基于纳米技术的创新疫苗接种策略(andries，kitada等，2015)。与病毒复制子颗粒(即包封在病毒衣壳蛋白中的rna)不同，rna复制子只能通过体外转录产生。因此，整个制造过程完全无细胞，从而产生了一种组成被精确限定的治疗剂。rna复制子疫苗具有若干有吸引力的特点，例如与其非复制性对应物相比，持续时间(约2个月)和表达量级延长(kowalski等，2019)。此外，sa-mrna的细胞内复制是短暂的，并且双链rna(dsrna)通过触发模式识别受体诱导干扰素介导的宿主防御机制。这导致针对插入的靶分子的强烈抗原特异性免疫响应。因此，sa-mrna载体系统非常适合疫苗开发，因为它们提供高瞬时转基因表达和固有的佐剂效应(sahin等，2014)。
[0108]
如本文所述的自复制性rna分子(例如，当以裸rna的形式递送时)可以自身扩增并启动宿主细胞中异源基因产物的表达和过表达。与mrna不同，本发明的自复制性rna分子使用它们自己编码的病毒聚合酶来扩增自身。本发明的自复制性rna分子，例如基于甲病毒的那些，产生大量的亚基因组mrna，从中可以表达大量的蛋白质(或小rna)。自复制性rna分子在本文中也称为“复制子(replicon)”。
[0109]
定义
[0110]“核苷酸”是本领域的术语，指含有核苷或脱氧核苷和至少一种磷酸的分子。核苷或脱氧核苷包含与含氮碱基相连的单个5碳糖部分(例如核糖或脱氧核糖)，含氮碱基是取代的嘧啶(例如胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u))或取代的嘌呤(例如，腺嘌呤(a)或鸟嘌呤(g))。如本文所用，“核苷酸类似物”或“经修饰的核苷酸”是指在核苷的含氮碱基(例如，胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u)、腺嘌呤(a)或鸟嘌呤(g))之中或之上含有一个或多个化学修饰(例如，取代)的核苷酸。核苷酸类似物可以在核苷的糖部分(例如，核糖、脱氧核糖、修饰的核糖、修饰的脱氧核糖、六元糖类似物或开链糖类似物)或磷酸之中或之上包含进一步的化学修饰。rna序列可在本文中使用它们的“dna等同物”序列呈现。众所周知，通过用尿嘧啶(u)替换胸腺嘧啶(t)，可以很容易地将dna等效序列转换为它所代表的rna序列。
[0111]“序列同一性”。两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性被定义为在比对序列并在必要时引入空位以获得最大百分比序列同一性后，多肽或核酸序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基或核苷酸在候选序列中的百分比，并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分。可以通过各种常规方式实现用于确定百分比氨基酸或核酸序列同一性的比对，例如，使用包括gcg程序包在内的公开可用的计算机软件(devereux等，nucleic acids research 12(1):387,1984)、blastp、blastn和fasta(altschul等，j.mol.biol.215:403-410,1990)。blast x程序可从ncbi和其他来源公开获得(blast manual altschul等，ncbi nlm nih bethesda,md.20894；altschul等，j.mol.biol.215:403-410,1990)。技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。确定同一性和相似性的方法已编入公开可用的计算机程序中。
[0112]“有效量”的自复制性rna是指足以引发可检测量的sars-cov-2抗原表达、特别是诱导sars-cov-2抗原特异性响应的量，优选为适合产生所需的治疗或预防效果的量。
[0113]
如本文所用，术语“裸”是指基本上不含其他大分子例如脂质、聚合物和蛋白质的
核酸。“裸”核酸，例如自复制性rna，未与其他大分子一起配制以提高细胞摄取。因此，裸核酸不被包封在脂质体、微粒或纳米颗粒和阳离子乳液等中、或吸收于其上、或与其结合。
[0114]
如本文所用，术语“治疗”包括减轻、减少或改善疾病或病症症状、预防额外症状、改善或预防症状的潜在代谢原因、抑制疾病或病症，例如，阻止疾病或病症的发展、缓解疾病或病症、引起疾病或病症的消退、缓解由疾病或病症引起的病症、或停止疾病或病症的症状。术语“治疗”包括但不限于预防性和/或治疗性治疗。
[0115]
如本文所用，术语“冠状病毒疾病”是指与冠状病毒感染相关的疾病，特别是由冠状病毒感染引起的疾病。
[0116]
如本文所用，术语“冠状病毒”包括冠状病毒科(coronaviridae)的任何成员，包括但不限于勒托病毒亚科(letovirinae)和正冠状病毒亚科(orthocoronavirinae)。因此，它们包括甲型冠状病毒属(alphacoronavirus)、乙型冠状病毒属(betacoronavirus)、丙型冠状病毒属(gammacoronavirus)和丁型冠状病毒属(deltacoronavirus)。在本发明的上下文中优选的冠状病毒是乙型冠状病毒，特别是严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒(包括sars-cov-1和sars-cov-2)。sars-cov-2有多种已知突变，称为变体(variant)，其中一个变体可能属于相似特征突变的集合(称为谱系(linage))。第一种变体b1.1.7起源于英国，在编码刺突蛋白的基因中包含三个关键突变：n501y、p681h和h69-v70。第二种变体b.1.351首次在南非被发现，它在刺突蛋白编码区包含三个关键性的取代突变：n501y、k417n和e484k。第三种变体p.1起源于巴西，在编码刺突蛋白的基因中包含与南非变体相同的关键性突变。第四种变体b.1.617首次在印度发现，它在刺突蛋白编码区包含三个关键的替代突变：e484q、l452r、p681r。此处使用的术语sars-cov-2包括迄今为止已知的所有变体，除非特别提及该变体。
[0117]
如本文所用，术语“免疫响应”涉及体内由抗原(＝外来物质)引起的响应，并导致抗体的产生，这些抗体可以通过杀死或抑制致病剂来对抗疾病。
[0118]
如本文所用，术语“甲病毒”包括具有包膜的、单链的、正义rna病毒的披膜病毒科(togaviridae)中的属(alphavirus)，其几乎在世界范围内存在。甲病毒是人畜共患的病原体，主要通过蚊子媒介在啮齿动物、灵长类动物和鸟类中传播，尽管少数会感染鱼类和海豹并且可能没有节肢动物媒介。当人们侵入地方性动物传播栖息地并被受感染的蚊子叮咬时，或者当甲病毒出现导致动物流行和流行时，就会发生人类疾病。
[0119]
如本文所用，术语亚基因组启动子是指那些构成产生亚基因组rna物质所需的功能元件的序列。亚基因组启动子是驱动以rna为模板的基因表达所必需的；亚基因组启动子被rna依赖性rna聚合酶识别，该聚合酶可能是病毒rna复制酶。启动子本身可以是天然存在的或合成的衍生自超过一种来源的片段的复合物。应当注意，亚基因组启动子的定位与亚基因组rna物质或其启动转录的特定基因有关，并且当它包含在正确(-)极性的rna分子内时被rna依赖性rna聚合酶(或病毒rna复制酶)功能性识别。含有亚基因组启动子功能拷贝的(-)正义rna分子包括核心启动子和活化结构域的功能单元，其可以使用(+)正义rna分子作为模板通过rna依赖性rna聚合酶合成，或者可能已被(细胞)rna聚合酶ii合成为由polii启动子启动的转录物。
[0120]
根据本发明，疫苗可具有至少一个5’端帽，并配制在脂质纳米颗粒内。多核苷酸的5
’‑
加帽可以根据制造商方案使用以下化学rna帽类似物在体外转录反应期间同时完成，生
成5
’‑
鸟苷帽结构：3
’‑
o-me-m7g(5’)ppp(5
′
)g[arca帽]；g(5
′
)ppp(5
′
)a；g(5
′
)ppp(5
′
)g；m7g(5
′
)ppp(5
′
)a；m7g(5’)ppp(5’)g(new england biolabs)。修饰rna的5
’‑
加帽可以使用牛痘病毒加帽酶在转录后完成，生成“cap 0”结构：m7g(5’)ppp(5’)g(new england biolabscap)。可以使用牛痘病毒加帽酶和2
’‑
o甲基转移酶生成cap 1结构来生成：m7g(5’)ppp(5’)g-2
’‑
o-甲基。cap 2结构可以从cap 1结构产生，然后使用2
’‑
o甲基转移酶对5
’‑
倒数第三个核苷酸进行2
’‑
o-甲基化。cap3结构可以从cap 2结构产生，然后使用2
’‑
o甲基转移酶对5
’‑
倒数第三个核苷酸进行2
’‑
o-甲基化。酶可以来源于重组来源。或者，可以使用m2 7,3
’‑
ogpppg或m27,2
’‑
ogpppgarca(cellscript inc)、cleancap(trilink biotechnologies llc)、5
’‑
硫代磷酸盐帽类似物(warszawski大学)通过共转录加帽，或使用替代性的帽类似物，从而实现多核苷酸的5
’‑
加帽。
[0121]
如本文所用，术语“3
’‑
poly(a)尾部”或“poly(a)尾部”通常是添加到转录的mrna的3’端的一段腺嘌呤核苷酸。它可以在某些情况下短至150个核苷酸，或包含最多约500个腺嘌呤核苷酸。在某些情况下，3
’‑
poly(a)尾部的长度可能是关于单个mrna稳定性的重要因素。所述长度可以高达约400个腺嘌呤核苷酸，例如约20至约400个、优选约50至约400个、更优选约50至约300个、甚至更优选约50至约250个、最优选约60至约250个腺嘌呤核苷酸。poly(a)序列通常位于mrna的3’端。在本发明的上下文中，poly(a)序列可以位于mrna或任何其他核酸分子内，例如，在载体中，例如，在充当产生rna、优选mrna(例如通过载体的转录)的模板的载体中。
[0122]
如本文所用，5
’‑
帽(5
’‑
cap)是一种实体，通常是修饰的核苷酸实体，其通常将成熟mrna的5
’‑
末端“加帽”。5’帽通常可以由修饰的核苷酸形成，特别是由鸟嘌呤核苷酸的衍生物形成。优选地，5
’‑
帽通过5
’‑5’‑
三磷酸键连接到5
’‑
末端。5
’‑
帽可以被甲基化，例如m7gpppn，其中n是携带5
’‑
帽的核酸的末端5’核苷酸，通常是rna的5
’‑
末端。5’帽结构的其他实例包括甘油基、反向脱氧无碱基残基(部分)、4’,5’亚甲基核苷酸、l-(β-d-呋喃糖基)核苷酸、4
’‑
硫代核苷酸、碳环核苷酸、1,5-脱水己糖醇核苷酸、l-核苷酸、α-核苷酸、修饰碱基核苷酸、苏式戊呋喃糖基(threo-pentofuranosyl)核苷酸、无环3’,4
’‑
seco核苷酸、无环3,4-二羟基丁基核苷酸、无环3,5二羟基戊基核苷酸、3
’‑3’‑
反向核苷酸部分、3
’‑3’‑
反向无碱基部分、3
’‑2’‑
反向核苷酸部分、3
’‑2’‑
反向无碱基部分、1,4-丁二醇磷酸、3
’‑
氨基磷酸、己基磷酸、氨基己基磷酸、3
’‑
磷酸、3’硫代磷酸、二硫代磷酸、或者桥接或非桥接的甲基膦酸部分。可以在本发明的背景下使用的进一步修饰的5
’‑
cap结构是cap1(m7gpppn的相邻核苷酸的核糖的甲基化)、cap2(m7gpppn下游第二个核苷酸的核糖的甲基化)、cap3(m7gpppn下游第3个核苷酸的核糖甲基化)、cap4(m7gpppn下游第4个核苷酸的核糖甲基化)、arca(抗逆cap类似物、修饰的arca(例如硫代磷酸修饰的arca)、肌苷、n1-甲基-鸟苷、2
’‑
氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、lna-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。特别优选的5
’‑
帽是cleancap结构，由trilink提供。
[0123]
如本文所用，术语“5
’‑
utr”通常指信使rna(mrna)的特定部分。它位于mrna开放阅读框的5’。通常，5
’‑
utr起始自转录起始位点，并在开放阅读框的起始密码子前一个核苷酸结束。5
’‑
utr可包含用于控制基因表达的元件，也称为调节元件。这些调节元件可以是例如核糖体结合位点或5
’‑
末端低聚嘧啶片段。5
’‑
utr可以进行转录后修饰，例如通过添加5
’‑
cap。在本发明的上下文中，5
’‑
utr对应于成熟mrna的序列，其位于5
’‑
cap和起始密码子之
间。优选地，5
’‑
utr对应于从位于5
’‑
cap的3’的核苷酸(优选地，位于紧邻5
’‑
cap的3’的核苷酸)延伸至位于蛋白质编码区的起始密码子的5’的核苷酸(优选地，位于紧邻蛋白质编码区的起始密码子的5’的核苷酸)。位于成熟mrna的5
’‑
cap紧邻的3’的核苷酸通常对应于转录起始位点。术语“对应于”是指5
’‑
utr序列可以是rna序列，例如用于定义5
’‑
utr序列的mrna序列，或与这种rna序列相对应的dna序列。在本发明的上下文中，术语“基因的5
’‑
utr”，例如“top基因的5
’‑
utr”，是对应于源自该基因的成熟mrna(即，通过该基因的转录和使成熟前mrna成熟而获得的mrna)的5
’‑
utr的序列。术语“基因的5
’‑
utr”包括5
’‑
utr的dna序列和rna序列。优选地，根据本发明使用的5
’‑
utr与mrna序列的编码区是异源的。虽然优选的是源自天然存在基因的5
’‑
utr，但合成工程化的utr也可用于本发明的上下文中。
[0124]
在本发明的上下文中，3
’‑
utr通常是mrna的一部分，其位于蛋白质编码区(即开放阅读框)和mrna的3
’‑
末端之间。mrna的3
’‑
utr不翻译成氨基酸序列。3
’‑
utr序列一般由在基因表达过程中转录成相应的mrna的基因编码。在本发明的上下文中，3
’‑
utr对应于成熟mrna的序列，其位于蛋白质编码区的终止密码子的3’，优选紧邻蛋白质编码区的终止密码子的3’，并且其延伸至mrna或poly(a)序列的3
’‑
末端的5
’‑
侧，优选延伸至poly(a)序列的5’紧邻的核苷酸。术语“对应于”是指3
’‑
utr序列可以是rna序列，例如用于定义3
’‑
utr序列的mrna序列，或与这种rna序列相对应的dna序列。在本发明的上下文中，术语“基因的3
’‑
utr”，例如“白蛋白基因的3
’‑
utr”，是对应于源自该基因的成熟mrna(即，通过该基因的转录和使成熟前mrna成熟而获得的mrna)的3
’‑
utr的序列。术语“基因的3
’‑
utr”包括3
’‑
utr的dna序列和rna序列。优选地，根据本发明使用的3
’‑
utr与mrna序列的编码区是异源的。虽然优选的是源自天然存在基因的3
’‑
utr，但合成工程化的utr也可用于本发明的上下文中。
[0125]
本发明上下文中的开放阅读框(orf)通常可以是几个核苷酸三联体的序列，其可以被翻译成肽或蛋白质。开放阅读框优选包含起始密码子，即通常编码氨基酸甲硫氨酸的三个连续核苷酸的组合(atg)，位于其5
’‑
末端和随后的区域，其显示的长度通常是3个核苷酸的倍数。orf优选以终止密码子(例如，taa、tag、tga)终止。通常，这是开放阅读框的唯一终止密码子。因此，本发明上下文中的开放阅读框优选为由可被三整除数量的核苷酸组成的核苷酸序列，其以起始密码子(例如atg)开始并且优选以终止密码子终止(例如，taa、tga或tag)。开放阅读框可以是分离的，或者它可以并入更长的核酸序列中，例如载体或mrna。开放阅读框也可称为“蛋白质编码区”。
[0126]
在本发明的上下文中，复制起点(ori)通常可以是染色体、质粒或病毒上启动复制的dna序列。对于小dna，包括细菌质粒和小病毒，单个起点即足够。较大的dna可能有许多起点，并且dna复制在所有这些起点处启动。复制起点决定了载体拷贝数，如果表达载体来源于低拷贝数质粒，拷贝数通常在25至50个拷贝/细胞，如果来源于高拷贝数质粒，拷贝数通常在150至200个拷贝/细胞。拷贝数影响质粒稳定性，即细胞分裂期间质粒在细胞内的维持。当在细胞分裂中发生随机分配时，高拷贝数的积极作用可能是质粒的稳定性更高。另一方面，大量的质粒可能会降低生长速度，因此可能使得质粒较少的细胞由于生长更快而在培养中占主导地位。复制起点也可能决定质粒的相容性：它在同一细菌细胞内与另一个质粒一起进行复制的能力。利用相同复制体系的质粒不能共存于同一细菌细胞中。它们被认为属于同一个相容性组。以来自同一相容性组的第二个质粒的形式引入新的起点，会模仿原住质粒的复制结果。因此，在两个质粒被隔离到不同的细胞中之前阻止任何进一步的复
2抗原的序列。优选地，自复制性rna分子来源于甲病毒，该甲病毒被设计为缺乏产生至少一种结构性甲病毒蛋白的能力。更优选地，自复制性rna分子来源于甲病毒，该甲病毒被设计为缺乏产生至少两种、更优选所有的结构性甲病毒蛋白的能力。在一个特定的实施方式中，本发明的自复制性rna分子以5’到3’的顺序包含：(i)非结构蛋白介导的扩增所需的5’序列，(ii)编码甲病毒、特别是委内瑞拉马脑炎病毒、非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的核苷酸序列，(iii)启动子，其可操作性地连接编码sars-cov-2抗原的异源核酸序列，其中所述异源核酸序列取代了一个或所有的甲病毒结构蛋白基因，(iv)非结构蛋白介导的扩增所需的3’序列，以及(v)poly-a段。
[0134]
因此，可用于本发明的自复制性rna分子可以具有两个开放阅读框。第一个(5’)开放阅读框编码复制酶，特别是甲病毒的非结构蛋白；第二个(3’)开放阅读框编码至少一种sars-cov-2抗原。
[0135]
在一方面，自复制性rna分子源自或基于甲病毒。在其他方面，自复制性rna分子源自或基于甲病毒以外的病毒，优选正链rna病毒，更优选小核糖核酸病毒、黄病毒、风疹病毒、瘟病毒、肝炎病毒或杯状病毒。合适的野生型甲病毒序列是公知的且可从序列保藏中心获得，例如美国典型培养物保藏中心(american type culture collection,rockville,md)。合适的甲病毒的代表性实例包括aura(atccvr-368)、bebaru病毒(atccvr-600、atccvr-1240)、cabassou(atccvr-922)、基孔肯雅病毒(atccvr-64、atccvr-1241)、东部马脑脊髓炎病毒(atccvr-65、atccvr-1242)、fortmorgan(atccvr-924)、getah病毒(atccvr-369、atccvr-1243)、kyzylagach(atccvr-927)、mayaro(atccvr-66)、mayaro病毒(atccvr-1277)、middleburg(atccvr-370)、mucambo病毒(atccvr-580、atccvr-1244)、ndumu(atccvr-371)、pixuna病毒(atccvr-372、atccvr-1245)、罗斯河病毒(atccvr-373、atccvr-1246)、塞姆利基森林病毒(atccvr-67,atccvr-1247)、辛德比斯病毒(atccvr-68、atccvr-1248)、tonate(atccvr-925)、triniti(atccvr-469)、una(atccvr-374)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(atccvr-69、atccvr-923、atccvr-1250、atccvr-1249、atccvr-532)、西部马脑脊髓炎病毒(atccvr-70、atccvr-1251、atccvr-622、atccvr-1252)、whataroa(atccvr-926)和y-62-33(atccvr-375)。在一个具体实施方式中，甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒(veev)。在一个更具体的实施方式中，甲病毒是活的减毒委内瑞拉马脑炎病毒(veev)，例如tc-83毒株或具有至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％的序列同一性的毒株。菌株tc-83是公开可获得的，其基因组存在于genbank中，登录号为l01443.1。
[0136]
已经产生了甲病毒的各种基因修饰变体，这些变体改善了它们在自复制性rna分子产生和疫苗接种中的用途，例如在us2015299728a1、wo1999018226a2和us7332322b2中公开的那些，所有这些都通过引用并入本文。特别是，已发现将鸟嘌呤作为复制子5’utr中的第三个核苷酸和/或在非结构蛋白2(nsp2)中进行q739l突变是有益的。因此，在本发明的一个特定实施方式中，自复制性rna分子在5’utr中包含a3g突变。在另一个特定的实施方式中，自复制性rna分子包含非结构蛋白2(nsp2)中的q739l突变。在一个优选的实施方式中，自复制性rna分子包含编码甲病毒、特别是veev、更具体地veevtc-83的非结构蛋白的序列，其中自复制性rna分子包含5’utr中的a3g突变和nsp2中的q739l突变。在甚至更优选的实施方式中，自复制性rna分子编码veevtc-83的非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4，其中优选地在nsp2中存在q739l突变。在一个实施方式中，自复制性rna分子编码一种蛋白质，该蛋白
质包含选自由seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13或seq id no:14组成的组的序列，或在每种情况下与其具有至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的蛋白质。在其它实施方式中，自复制性rna分子编码包含seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13和seq id no:14的序列的蛋白质，或在每种情况下与其具有至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的蛋白质。在其它实施方式中，自复制性rna分子编码包含seq id no:11、seq id no:15、seq id no:13和seq id no:14的序列的蛋白质，或在每种情况下与其具有至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的蛋白质。在nsp3和nsp4之间可能有一个较少被通读(read-through)的终止密码子。这可能导致形成nsp1-3或nsp1-4的非结构蛋白的各种前体形式。因此，在本发明的一些实施方式中，包含seq id no:18(存在于nsp1-4前体中的nsp3)的蛋白质包含seq id no:13(存在于nsp1-3前体中的nsp3，由于较少被通读的终止密码子之故)。
[0137]
在一个具体实施方式中，本发明的自复制性rna分子包含seq id no:10的rna等同物或与其具有至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的序列，其任选地被一个或多个额外序列打断。在另一个实施方式中，本发明的自复制性rna分子包含seq id no:10的rna等同物或与其具有至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的序列，其中所述序列被具有一个或多个编码sars-cov-2抗原的序列(例如，seq id no:1、seq id no：2、seq id no：8和seq id no：9中的任何一个)打断，优选在所述序列的7567位核苷酸附近。
[0138]
从本文的公开内容可以明确，优选至少一种sars-cov-2抗原是sars-cov-2刺突蛋白抗原。因此，在一个特定的实施方式中，本发明的自复制性rna分子包含seq id no:10的rna等同物或与其具有至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的序列，其中所述序列被编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列打断。在一个优选的实施方式中，本发明的自复制性rna分子包含seq id no:7的rna等同物或与其具有至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的序列，其中所述序列任选地被一个或多个额外序列打断。这些额外序列可以编码不同的sars-cov-2抗原，例如核衣壳蛋白抗原和/或膜蛋白抗原。具体而言，所述额外序列可编码包含seq id no:8或seq id no:9的序列的蛋白质。在另一个实施方式中，所述额外序列可包含seq id no:5或seq id no:6的rna等同物。
[0139]
在一个特定的实施方式中，本发明的自复制性rna分子包含seq id no:7的rna等同物或与其具有至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的序列，其中所述序列被编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原的序列打断，例如编码包含seq id no：8序列或其抗原片段的蛋白质的序列。在另一个具体实施方式中，本发明的自复制性rna分子包含seq id no:7的rna等同物或与其具有至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的序列，其中所述序列被编码sars-cov-2膜蛋白抗原的序列(例如编码包含seq id no:9序列或其抗原片段的蛋白质的序列)打断。
[0140]
本文所述的自复制性rna分子可以被设计为从两个以上的开放阅读框表达多个核苷酸序列，从而允许蛋白质共表达，例如两种以上的抗原以及细胞因子或其他免疫调节剂，这可以增强免疫响应的产生。这种自复制性rna分子可能特别有用，例如，同时生产各种基
因产物(例如蛋白质)，例如作为二价或多价疫苗，或用于基因治疗应用。
[0141]
sars-cov-2抗原
[0142]
为了在本发明中使用，可以使用任何sars-cov-2蛋白抗原，这意味着自复制性rna分子包含编码sars-cov-2蛋白抗原的序列。特别关注的是刺突蛋白(也称s蛋白)、膜蛋白(也称m蛋白)或核衣壳蛋白(也称n蛋白)的sars-cov-2蛋白抗原。术语“抗原”包括抗原片段。例如，sars-cov-2刺突蛋白抗原包括全长刺突蛋白及其抗原片段，例如刺突蛋白的受体结合域(rbd)和包含此类抗原片段的融合分子。
[0143]
从本文的公开内容可以理解，自复制性rna分子优选包含sars-cov-2刺突蛋白抗原。在其它实施方式中，sars-cov-2刺突蛋白抗原是刺突蛋白的截短形式。在一个特定的实施方式中，sars-cov-2刺突蛋白抗原包含seq id no:16的至少15个、特别是至少20个、更特别是至少25个连续的氨基酸。在另一个特定的实施方式中，sars-cov-2刺突蛋白抗原包含seq id no:16或与seq id no:16具有至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列包含seq id no:17的rna等同物或与seq id no:17的rna等同物具有至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的核苷酸序列。
[0144]
在另一个实施方式中，sars-cov-2刺突蛋白抗原包含受体结合域(rbd)。在另一个特定的实施方式中，sars-cov-2刺突蛋白抗原是包含rbd的刺突蛋白的截短形式。在其它实施方式中，sars-cov-2刺突蛋白抗原基本上由rbd组成，其任选地与另一种肽融合。因此，在一个特定的实施方式中，sars-cov-2刺突蛋白抗原包含seq id no:1或与seq id no:1具有至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。在其它实施方式中，sars-cov-2刺突蛋白抗原基本上由seq id no:1(其任选地与另一个肽融合)或与seq id no:1具有至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。在另一个实施方式中，编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列编码seq id no:1的序列或与seq id no:1具有至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列编码以下氨基酸序列：该氨基酸序列基本上由seq id no:1(其任选地与另一个肽融合)或与seq id no:1具有至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。在另一个实施方式中，编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列包含seq id no:3的rna等同物或与seq id no:3的rna等同物具有至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的核苷酸序列。根据本发明，编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列可以前置有前导肽，例如但不限于人组织纤溶酶原激活物前导肽(与seq id no:19具有至少95％序列同一性的氨基酸序列)和iggκ轻链前导序列。
[0145]
在其它实施方式中，刺突蛋白任选地通过接头序列与免疫刺激蛋白融合。不同的免疫刺激蛋白可用于本发明的应用。用于本发明的优选免疫刺激蛋白是c3d-p28，特别是c3d-p28.6，如zhang等(vaccine 2011,29:629-635)所述。因此，在一个特定的实施方式中，sars-cov-2刺突蛋白抗原包含与c3d-p28融合的受体结合域(rbd)。在另一个特定的实施方式中，sars-cov-2刺突蛋白抗原是刺突蛋白的截短形式，包含与c3d-p28融合的rbd。在其它实施方式中，sars-cov-2刺突蛋白抗原基本上由与c3d-p28融合的rbd组成，其任选地与另一个肽融合。因此，在一个具体实施方式中，sars-cov-2刺突蛋白抗原包含seq id no:2或
与seq id no:2具有至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。在其它实施方式中，sars-cov-2刺突蛋白抗原基本上由seq id no:2(其任选地与另一个肽融合)或与seq id no:2具有至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。在另一个实施方式中，编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列编码seq id no:2的序列或与seq id no:2具有至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列编码以下氨基酸序列：该氨基酸序列基本上由seq id no:2(其任选地与另一个肽融合)或与seq id no:2具有至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。在另一个实施方式中，编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列包含seq id no:4的rna等同物或与seq id no:4的rna等同物具有至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少99％序列同一性的核苷酸序列。
[0146]
优选地，sars-cov-2刺突蛋白抗原与另一种sars-cov-2抗原组合。已经发现这能够具有更高的疫苗接种功效。sars-cov-2抗原可以如下进行组合，例如，将它们提供在不同的本文所述的自复制性rna分子中，或通过提供编码不同抗原的本文所述的单个自复制性rna分子。
[0147]
因此，在本发明的一个方面，提供了一种组合，其包含编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列和编码另一种sars-cov-2蛋白抗原的序列。优选地，所述另一种sars-cov-2抗原是sars-cov-2核衣壳蛋白抗原。
[0148]
根据本发明组合的一个实施方式，编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列和编码另一种sars-cov-2蛋白抗原的序列包含在相同的自复制性rna分子中。在一个特定的实施方式中，本发明的自复制性rna分子编码两种sars-cov-2抗原，优选为(a)sars-cov-2刺突蛋白抗原和(b)sars-cov-2核衣壳蛋白抗原和/或sars-cov-2膜蛋白抗原。在一个特定的实施方式中，本发明的自复制性rna分子编码(a)sars-cov-2刺突蛋白抗原和(b)sars-cov-2核衣壳蛋白抗原。在另一个具体实施方式中，本发明的自复制性rna分子编码(a)sars-cov-2刺突蛋白抗原和(b)sars-cov-2膜蛋白抗原。
[0149]
根据本发明组合的另一个实施方式，编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列和编码另一种sars-cov-2蛋白抗原的序列包含在单独的自复制性rna分子中。在一个特定的实施方式中，该组合包含两种不同的自复制性rna分子，每种分子编码一种sars-cov-2抗原，优选地(a)sars-cov-2刺突蛋白抗原和(b)sars-cov-2核衣壳蛋白抗原和/或sars-cov-2膜蛋白抗原。在一个特定的实施方式中，该组合包含一种编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的自复制性rna分子和编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原的第二自复制性rna分子。在另一个特定的实施方式中，该组合包含一种编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的自复制性rna分子和编码sars-cov-2膜蛋白抗原的第二自复制性rna分子。
[0150]
自复制性rna分子的递送
[0151]
根据常见的分类，可使用两种类型的载体将遗传物质递送至靶细胞。一方面，使用模仿其前体病毒行为的病毒载体。已经采用了不同类型的载体，包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒，甚至在欧洲被批准用于临床。另一方面，有一些非病毒载体可以根据其组成进行描述。引用最多的是脂质复合物(脂质+dna或rna)和聚合物复合物(聚合物+dna或rna)(perez ruiz de garibay，2016)。遗传物质也可以通过电穿孔插入。这种从细胞中
引入外来物质的过程通过向细胞施加电场以增加细胞膜的渗透性来起作用。本项目将专注于研究非病毒递送体系。
[0152]
本发明的自复制性rna适用于以多种方式递送，包括裸rna递送或与脂质、聚合物或其他促进进入细胞的化合物结合。可以使用任何合适的技术，例如通过直接注射、显微注射、电穿孔、脂质转染、生物溶解等，将本发明的自复制性rna分子引入靶细胞或受试者中。
[0153]
自复制性rna可以作为裸rna(例如仅作为rna的水溶液)递送，但是为了增强进入细胞和随后的细胞间效应，优选将自复制性rna与递送系统例如脂质体或其他纳米颗粒组合施用。
[0154]
为了创建脂质体，可以将各种两亲性脂质在水性环境中形成双层以包封含有rna的水性芯。这些脂质可以具有阴离子、阳离子或两性离子亲水性头基。一些磷脂是阴离子性的，而另一些是两性离子性的。
[0155]
脂质体可由单一脂质或脂质混合物形成。混合物可包含(i)阴离子脂质的混合物、(ii)阳离子脂质的混合物、(iii)两性离子脂质的混合物、(iv)阴离子脂质和阳离子脂质的混合物、(v)阴离子脂质和两性离子脂质的混合物、(vi)两性离子脂质和阳离子脂质的混合物或(vii)阴离子脂质、阳离子脂质和两性离子脂质的混合物。类似地，混合物可包含饱和脂质和不饱和脂质。例如，混合物可包含dspc(两性离子性的，饱和的)、dlindma(阳离子性的，不饱和的)和/或dmpg(阴离子性的，饱和的)。在使用脂质混合物的情况下，并非混合物中的所有组分脂质都需要是两亲性的，例如可以将一种或多种两亲性脂质与胆固醇混合。rna优选被包封在脂质体中，因此脂质体在含有rna的水性芯周围形成外层。
[0156]
将mrna配制成纳米颗粒的高效递送系统可以增加细胞摄取，并保护mrna免受rna酶作用。如果通过使mrna与诸如血液或粘液等生物流体接触的途径来施用mrna，则后者尤为重要。基于脂质的载体、基于聚合物的载体以及混合型和其他纳米制剂，例如碳纳米管(cnt)或树状复合物(树状聚合物+dna/rna)，已在体内进行了评估(perez ruiz de garibay，2016)。大多数使用的mrna脂质制剂相当简单，涉及脂质与mrna的普通混合。此外，由此产生的mrna-脂质体复合物在生理ph值下通常带正电荷，因此容易与生物体液中存在的带负电荷的(大)分子相互作用。此外，这种带电荷的mrna复合物会被免疫细胞迅速捕获(zhong等，2018)。
[0157]
脂质纳米颗粒(lnp)作为一种更先进的mrna脂质制剂被引入(moss等，2007；islam等，2015；kauffman等，2016；granot和peer，2017；hajj和whitehead，2017；b.li等，2019)，它们被认为是体内递送mrna疗法的理想候选。lnp的特征在于，其将mrna包裹在纳米颗粒中，这些纳米颗粒在生理ph值下呈准中性，但在酸性ph值下呈阳性。这可以防止生物体液中带电的(大)分子例如白蛋白大量结合至lnp。另一方面，酸性内体中的ph响应性脂质的质子化促进了mrna的内体逃逸。lnp的ph响应性是由于存在具有适当pka的可电离脂质，即脂质在低ph值下带正电荷，但在生理ph值附近呈中性。结合专门的混合程序，这些ph响应性脂质可以有效包封mrna。
[0158]
基于lnp-cmrna的系统可以代表一种强大的平台技术，用于纠正囊性纤维化和其他单基因病症。作为一种非侵入性工具，可以通过气溶胶吸入/雾化将lnp-cmrna施用于肺部。johler等(2015)已表明，阳离子ivt mrna复合物的雾化既不影响蛋白质持续时间也不影响阳离子复合物的毒性，构成了一种潜在的强大手段，可以转染肺部细胞以用于针对囊
性纤维化等遗传疾病的蛋白置换，同时与作为转染剂的pdna相比带来ivt mrna的优势(johler等，2015)。robinson等(2018)证实，鼻内施用编码野生型囊性纤维化跨膜传导调节因子(cftr)的mrna-lnp可恢复cftr敲除小鼠的传导性气道中cftr介导的氯化物分泌(robinson等，2018b)。此外，对于某些应用，需要靶向特定的细胞类型或组织。例如，最近，一种罕见的细胞类型foxi1+肺离子细胞被确定为小鼠(cftr)和人类(cftr)中囊性纤维化跨膜传导调节因子的转录本的主要来源(montoro等，2018)。这一新细胞类型可能是mrna治疗的理想靶点，因为mrna治疗的靶向递送有望成为mrna递送领域的热门话题，提供了重大的创新机遇。
[0159]
此外，基于脂质的微米/纳米颗粒可以具有令人关注的用于疫苗接种的抗原(ag)递送系统的若干期望特性，因为它们具有生物相容性，可以克服粘膜的生理屏障，促进上皮的ag交叉和apc的摄取，保护相关的有效载荷，适于引入佐剂并可显示粘膜粘附特性(corth
é
sy合bioley，2018)。geall等(2012)表明，脂质纳米颗粒包封的sa-mrna疫苗可引发针对来自hiv和呼吸道合胞病毒的抗原的功能性免疫响应(geall等，2012)。
[0160]
本公开的脂质纳米颗粒可以使用本领域公知的组分、组合物和方法产生，参见例如pct/us2016/052352；pct/us2016/068300；pct/us2017/037551；pct/us2015/027400；pct/us2016/047406；pct/us2016000129；pct/us2016/014280；pct/us2016/014280；pct/us2017/038426；pct/us2014/027077；pct/us2014/055394；pct/us2016/52117；pct/us2012/069610；pct/us2017/027492；pct/us2016/059575和pct/us2016/069491，其均通过引用整体并入本文。
[0161]
在一个特别优选的实施方式中，本发明的自复制性rna分子被包封在脂质纳米颗粒中。
[0162]
如上所述的用于递送自复制性rna分子的所有实施方式同样适用于递送若干不同的如上所述的自复制性rna分子的组合。特别是，当要递送包含在单独的自复制性rna分子中的编码多种sars-cov-2蛋白抗原的序列时，这些可以在一个脂质体中或在不同的脂质体中递送。任选地，所述不同的脂质体可以在递送之前进行混合，以有助于制剂的进一步操控。所述不同的脂质体可以具有相同的组成或不同的组成，以便有效包封、结合或吸附不同的自复制性rna分子。
[0163]
因此，本发明的一个特定实施方式涉及如上所述的组合，其中编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列和编码另一种sars-cov-2蛋白抗原的序列包含在不同的自复制性rna分子，其中两种自复制性rna分子被包封在一个脂质体中、与其结合或吸附于其上。当在本发明中使用两种以上的不同的自复制性rna分子时，包封不同自复制性rna分子的脂质体可以具有相同或不同的组成。因此，在一个特定的实施方式中，本发明提供了包含编码第一sars-cov-2蛋白抗原的序列的第一自复制性rna分子和包含编码第二sars-cov-2蛋白抗原的序列的第二自复制性rna分子，其中第一自复制性rna分子被包封在第一脂质体中、与其结合或吸附于其上，第二自复制性rna分子被包封在第二脂质体中、与之结合或吸附于之上。第一和第二脂质体可具有相同或不同的组成，特别是它们可包含相同或不同的脂质。在优选的实施方式中，第一自复制性rna分子被包封在第一lnp中并且第二自复制性rna分子被包封在第二lnp中。在一个特定实施方式中，第一lnp的组成不同于第二lnp的组成。这可以如下实现，例如，通过将第一自复制性rna分子包封在第一lnp包封混合物中，并将第二自
复制性rna分子包封在第二lnp包封混合物中。此后，可以将第一和第二种包封的自复制性rna分子提供在不同的组合物中，或者可以将它们组合以获得包含两种包封的自复制性rna分子的组合物。
[0164]
在另一个具体实施方式中，本发明涉及如上所述，其中编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列和编码另一种sars-cov-2蛋白抗原的序列包含在不同的自复制性rna分子中，并且其中包含编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列的sa-rna分子和包含编码另一种sars-cov-2蛋白抗原的序列的sa-rna分子被包封在不同的脂质体中、与其结合或吸附于其上。所述不同的脂质体可以在两种不同的组合物中递送。任选地，所述不同的脂质体也可以在递送前组合成单一组合物。
[0165]
药物组合物
[0166]
本发明涉及药物组合物，其包含编码s、n或m蛋白的自复制性rna序列或两种或三种编码蛋白的自复制性rna序列的组合。因此，在一个特定的实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的自复制性rna分子以及一种或多种药学上可接受的载体。通常包括药学上可接受的载体和合适的递送系统或载剂，例如脂质体。然而，mrna也可以在有或没有电穿孔的情况下裸递送。药物组合物中可包含至少一种佐剂，并且必要时可包含其他佐剂或其他药物成分，例如赋形剂。这些成分可用作抗病毒疫苗。如果在不同的自复制性rna分子中提供sars-cov-2抗原，则这些分子可能以相同或不同的组成存在。
[0167]
药学上可接受的载体部分地取决于所施用的特定组合物，以及用于施用该组合物的特定方法。相应地，存在多种合适的本发明药物组合物的制剂。自复制性rna分子可以包封在阳离子脂质、脂质纳米颗粒、脂质体、脂质卷、病毒体、免疫刺激复合物、微粒、微球、纳米球、单层囊泡、多层囊泡、水包油乳液、油包水乳液、乳化体、多阳离子肽、阳离子纳米乳液和它们的组合中、与其结合或吸附于其上。
[0168]
药物组合物优选是无菌的并且可以通过常规灭菌技术灭菌。
[0169]
组合物可包含药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如ph调节剂和/或缓冲剂和张力调节剂，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。
[0170]
药物组合物的ph值优选为5.0至9.5，例如6.0至8.0。
[0171]
本发明的药物组合物的张力(tonicity)可能必须用钠盐例如氯化钠来调节。用于肠胃外施用的药物组合物的张力通常为0.9％或9mg/ml nacl。
[0172]
本发明的药物组合物可以具有200mosm/kg至400mosm/kg的渗透压，例如240mosm/kg至360mosm/kg或290mosm/kg至310mosm/kg。
[0173]
优选不含防腐剂的疫苗。然而，如果需要，本发明的药物组合物可以包含一种或多种防腐剂，例如苯酚和2-苯氧基乙醇。硫柳汞是一种含汞防腐剂，应避免使用，因为优选不含汞的组合物。
[0174]
本发明的药物组合物优选是非热原性的(non-pyrogenic)，例如每剂含《1eu(内毒素单位，标准量度)，最好每剂《0.1eu。本发明的药物组合物优选不含麸质。
[0175]
药物组合物中自复制性rna的浓度可以变化，并将根据特定施用方式根据液体体积、粘度、体重和其他考虑因素进行选择。药物组合物中自复制性rna的浓度应已被证明对预防有效，无论是单剂量还是作为一系列剂量的一部分。量根据待治疗个体的健康、身体状况、年龄和分类群(例如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体免疫系统对抗原编码的蛋白
质或肽的反应能力、待治疗的病况和其他相关因素而变化。本发明组合物的自复制性rna含量通常以每剂的rna量表示。优选剂量具有0.1μg至100μg自复制性rna，优选0.5μg至90μg自复制性rna，优选0.1μg至75μg自复制性rna，优选0.1μg至50μg自复制性rna，优选0.5μg至50μg自复制性rna，优选0.5μg至25μg自复制性rna，更优选0.5μg至10μg自复制性rna，更优选1μg至10μg、甚至更优选1μg至5μg自复制性rna，并且表达在低得多的水平上可见(例如在体外使用中0.05μg自复制性rna/剂)。
[0176]
合适的施用途径包括肠内、肠胃外和局部施用。
[0177]
肠胃外施用包括关节内、静脉内、腹膜内、肌内、皮内或皮下注射。优选肌内、皮内或皮下施用。适用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性、等渗、无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质。
[0178]
适用于肠胃外施用的制剂，例如但不限于，关节内、静脉内、腹膜内、肌内、皮内或皮下注射，包括水性和非水性、等渗无菌注射液或混悬液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，
[0179]
自复制性rna分子的制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿和小瓶。注射液和混悬液可由无菌粉剂、颗粒剂和片剂制成。也可以静脉内或肠胃外施用被自复制性rna分子转染的细胞。
[0180]
所述制剂或疫苗可以作为单剂量或多剂量施用，需要一系列的两个以上的剂量，在预定的时间跨度内施用。所述时间跨度可以是一周、两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周、九周、十周、十一周直到一年。
[0181]
在一个实施方式中，定期施用制剂或疫苗，例如每年或每半年一次。
[0182]
合适的剂量可以为0.05ml至1ml，更优选为0.25ml至0.75ml，例如0.5ml。
[0183]
如果药物制剂由乳液组成，自复制性rna分子和乳液可以通过简单的摇动混合。其他技术，例如将乳液和溶液或悬浮液和自复制性rna分子的混合物快速通过小开口(例如皮下注射针头)，可用于混合药物制剂。
[0184]
适用于口服施用的制剂可以包括(a)液体溶液，(b)胶囊剂、袋剂或片剂，其各自含有预定量的作为液体、固体、颗粒剂或明胶的活性成分，(c)在合适的液体中的悬浮液，和(d)合适的乳液。液体溶液由悬浮在稀释剂(例如水、盐水或peg400)中的有效量的包装核酸组成。片剂形式可以包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、黄芪胶、微晶纤维素、阿拉伯树胶、明胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸中的一种或多种，以及其它赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药学上相容的载体。锭剂(lozenge)形式可以将活性成分包含在调味剂中，通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶，以及软锭剂(pastille)将活性成分包含在惰性基质中，例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶乳剂、凝胶等，其除活性成分外含有本领域已知的载剂。为了保护口服施用的自复制性rna分子，将所述分子与组合物复合以使其对酸性和酶促水解具有抗性，或者将自复制性rna分子包装在适当的抗性载体(例如脂质体)中。此外，药物组合物可以包封在例如脂质体或提供活性成分的缓释的制剂中。
[0185]
也可以制备局部组合物，包括通过吸入施用的气溶胶制剂。合适的组合物由自复制性rna分子组成，单独或与其他合适的组分组合。可将气溶胶制剂放入加压的可接受的推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。
[0186]
合适的栓剂制剂含有自复制性rna分子和栓剂基质。合适的栓剂基质包括天然或合成的甘油三酯或石蜡烃。也可以使用填充有自复制性rna与合适的基质例如液体甘油三酯、聚乙二醇和石蜡烃的组合的明胶直肠胶囊。
[0187]
如上所述的包含自复制性rna分子的药物组合物的所有实施方式同样适用于包含几种不同的如上所述的自复制性rna分子的组合的药物组合物。特别是，当编码多种sars-cov-2蛋白抗原的序列包含在不同的自复制性rna分子中时，它们可以存在于单一制剂中，或存在于不同的制剂中。优选地，当包含在不同的自复制性rna分子中的编码多种sars-cov-2蛋白抗原的序列存在于不同的制剂中时，这些不同制剂可以在递送前混合以有助于进一步操控。所述不同的制剂可以包含相同的药学上可接受的载体。或者，所述不同的制剂可以包含不同的药学上可接受的载体。
[0188]
如上所述的不同的制剂可以使用相同的施用途径或使用不同的施用途径施用。优选地，两种制剂使用相同的施用途径施用。
[0189]
治疗方法和医药用途
[0190]
可以将本发明的自复制性rna分子递送至脊椎动物，例如哺乳动物(包括人)以用于各种治疗或预防目的，例如诱导治疗或预防性免疫响应。本发明还涉及在受试者中刺激免疫响应或治疗受试者的方法，包括以实现所需治疗效果的有效量向受试者施用如本文所述的一种或多种自复制性rna分子，例如产生足以诱导免疫响应、调节内源基因表达或提供治疗益处的量的编码的外源基因产物的足够的量。受试者优选是动物、哺乳动物、鱼、鸟，并且更优选是人。合适的动物受试者包括，例如，牛、猪、马、鹿、绵羊、山羊、野牛、兔、猫、狗、鸡、鸭、火鸡等。
[0191]
本发明还涉及在宿主动物中诱导免疫响应的方法，包括以诱导免疫响应的有效量向动物施用一种或多种本文所述的自复制性rna分子。优选地，在受试者中引发所述免疫响应以抵抗冠状病毒、优选sars-cov-2感染。优选地，自复制性rna分子编码病原体抗原。宿主动物优选为哺乳动物，更优选为人。优选的施用途径如上所述。这些方法可用于提高加强剂响应。本文所述的自复制性rna分子和组合物可以与其他预防性或治疗性化合物一起施用。作为非限制性实例，所述预防性或治疗性化合物可以是佐剂或增强剂。如本文所用，当提及预防性组合物例如疫苗时，术语“加强剂(booster)”是指预防性(疫苗)组合物的额外施用。可以在较早施用预防性组合物之后给予加强剂(或加强剂疫苗)。如上所述，rna复制子疫苗的有吸引力的特点之一是宿主动物对已施用疫苗的免疫响应的持续时间延长。因此，预防性组合物的初次施用与加强剂之间的施用时间可以是但不限于1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年。优选地，预防性组合物的初次施用和加强剂之间的施用时间为2或3个月。本发明涉及针对sars-cov-2对受试者进行免疫的方法，包括以诱导保护性免疫响应的有效量向受试者施用一种或多种编码sars-cov-2抗原的自复制性rna分子。宿主动物优选为哺乳动物，更优选为人。
[0192]
优选地，本发明的编码sars-cov-2抗原的自复制性rna分子在施用于受试者时诱导保护性免疫或免疫响应。
[0193]
优选的施用途径包括但不限于肌内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内和眼内注射。口服和透皮施用，以及通过吸入或栓剂施用也被考虑在内。特别优选的施用途径包括肌内、皮内和皮下注射。特别优选的是肌内注射。根据本发明的一些实施方式，使用公知且广
泛可用的无针注射装置将自复制性rna分子施用于宿主动物。本发明的自复制性rna分子也可以离体递送至细胞，例如从个体患者移植的细胞(例如，淋巴细胞、骨髓抽吸物、组织活检物)或通用供体造血干细胞，然后通常在选出已被自复制性rna分子转染的细胞后，将所述细胞重新植入患者。递送至患者的适当细胞数量将随患者状况和所需效果而变化，这可由技术人员确定。
[0194]
自复制性rna分子，例如那些编码病原体抗原并因此适用于诱导免疫响应的分子，可以直接引入组织，例如肌肉。根据本发明，诸如“基因枪(biolistic)”或颗粒介导的转化的其他方法也适用于将自复制性rna引入哺乳动物的细胞中。这些方法不仅可用于将rna体内引入哺乳动物，而且可用于体外修饰细胞以重新引入哺乳动物。
[0195]
本发明的自复制性rna分子被认为可以与全细胞或病毒免疫原性组合物以及纯化的抗原、免疫原或蛋白质亚基或肽免疫原性组合物结合使用。有时使用靶向靶细胞类型的自复制性rna疫苗是有利的。
[0196]
根据本文所述的方法将有效量的自复制性rna以单次剂量或作为一系列剂量的一部分给予受试者。如本文所述，该量根据待治疗个体的健康和身体状况、待治疗的病症和其他相关因素而变化。预期该量将落在相对宽范围内，其可由熟练临床医生基于本文讨论的因素和其他相关因素确定。
[0197]
表达多肽的本发明的自复制性rna分子疫苗可以包装在包装、分配器装置和试剂盒中。例如，提供包含一个或多个单位剂型的包装或分配器装置。通常，施用说明将与包装一起提供，并在标签上适当说明自复制性rna分子适用于治疗指定病症。例如，标签可以说明包装内的自复制性rna分子可用于治疗特定的传染病、自身免疫性疾病、肿瘤，或用于预防或治疗由哺乳动物的免疫响应所介导、或者可能对其易感的其他疾病或病症。
[0198]
载体和rna构建体
[0199]
本发明的载体可包含抗原，其中所述抗原序列编码sars-cov-2刺突蛋白或其截短形式，或其中所述抗原序列编码sars-cov-2核衣壳蛋白(n)抗原，并且其中所述抗原处于启动子序列、优选甲病毒衍生的亚基因组启动子(sgp)的下游。
[0200]
载体可包含基本元件，包括帽、5’utr、3’utr和抗原序列下游的可变长度的poly(a)尾部。载体还可以包含复制起点和启动子序列，例如t7或sp6启动子，以及选择基因(例如编码抗生素的选择基因)，目的是在表达系统中产生所述载体。
[0201]
在一个实施方式中，载体可包含委内瑞拉马脑炎病毒(veev)，其携带用作复制子主链的tc-83毒株基因组以驱动自扩增rna表达。自扩增rna(sarna)可以编码四种非结构蛋白(nsp1
–
4)和亚基因组启动子序列。nsp1-4编码负责扩增sarna的复制酶，使得剂量可以低于非复制性的mrna。
[0202]
前述载体可进一步包含5’帽(例如，7mg(5’)ppp(5’)nlmpnp)。根据本发明的非结构蛋白优选包含5’utr中的a3g突变和/或非结构蛋白2(nsp2)中的q739l突变。
[0203]
编码刺突蛋白抗原的序列可以被克隆在sgp启动子之后，由此刺突蛋白抗原可以是包含受体结合域(rbd)的刺突蛋白的截短形式。或者，可以在sgp启动子之后克隆编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原的序列。优选地，在递送到细胞质后，sarna的翻译可产生非结构蛋白1-4(nsp1-4)，其形成rna依赖性rna聚合酶(rdrp)。rdrp负责sarna的复制，产生sarna的拷贝。因此，从最初递送的每种sarna产生了亚基因组rna的多个拷贝。与非扩增性
rna相比，这会导致翻译更多的抗原拷贝。根据本发明的载体可以是质粒dna或线性化dna。为此目的，质粒可包含允许所述质粒线性化的限制酶(re)位点。
[0204]
在一个实施方式中，抗原序列编码sars-cov-2刺突蛋白或其截短形式，其中所述刺突蛋白或刺突蛋白的截短形式包含受体结合域(rbd)，或编码sars-cov-2核衣壳(n)抗原。
[0205]
本发明优选的自复制性rna分子编码rna依赖性rna聚合酶，该酶可以从自复制性rna分子和sars-cov-2抗原转录rna，如本文所述。聚合酶可以是甲病毒复制酶，例如包含甲病毒蛋白nsp4。
[0206]
在一个实施方式中，本发明的自复制性rna分子包含编码非结构性甲病毒蛋白的序列和编码sars-cov-2抗原的序列。更具体地，本发明的自复制性rna分子包含编码四种非结构性甲病毒蛋白的序列和编码sars-cov-2抗原的序列。所述sars-cov-2抗原优选选自sars-cov-2刺突蛋白、包含受体结合域(rbd)的sars-cov-2刺突蛋白的截短形式、与c3d-p28.6融合的sars-cov-2刺突蛋白受体结合域、sars-cov-2膜蛋白(m)或sars-cov-2核衣壳蛋白(n)。
[0207]
优选地，自复制性rna分子来源于甲病毒，该甲病毒经工程化而缺乏产生至少一种结构性甲病毒蛋白的能力。更优选地，自复制性rna分子来源于甲病毒，该甲病毒经工程化而缺乏产生至少两种、更优选所有结构性甲病毒蛋白的能力。在一个具体实施方式中，本发明的自复制性rna分子包含编码甲病毒、特别是委内瑞拉马脑炎病毒、非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4、优选包含在5’utr中的a3g突变和/或非结构蛋白2(nsp2)中的q739l突变的核苷酸序列。
[0208]
用于本发明和实施例中实际使用的优选序列：
[0209]
seq id no:1.sars-cov-2受体结合域的氨基酸序列(s-rbd)，前置有人组织纤溶酶原激活物前导肽：
[0210]
mdamkrglccvlllcgavfvsprvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnf
[0211]
seq id no:2.与c3d-p28.6融合的sars-cov-2受体结合域的氨基酸序列(s-rbd-c3d-p28.6)，前置有人组织纤溶酶原激活物前导肽：
[0212]
mdamkrglccvlllcgavfvsprvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfggggsggggskflttakdknrwedpgkqlynveatsyaggggsggggskflttakdknrwedpgkqlynveatsyaggggsggggskflttakdknrwedpgkqlynveatsyaggggsggggskflttakdknrwedpgkqlynveatsyaggggsggggskflttakdknrwedpgkqlynveatsyaggggsggggskflttakdknrwedpgkqlynveatsya
[0213]
seq id no:3.rna序列中的sars-cov-2s-rbd蛋白编码序列的dna等同物(所有序列以“dna格式”给出。在rna载体中的所有t变为u)：
[0214]
atggatgctatgaagaggggcctgtgctgcgtgctgcttctgtgtggcgctgtgttcgtgtcccctaga
gtgcagcctaccgagagcatcgtgcggttccccaacatcaccaatctgtgccctttcggcgaggtgttcaacgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactacagcgtgctgtacaacagcgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcacccaccaagctgaacgacctgtgcttcaccaacgtgtacgccgacagcttcgtgatcagaggcgacgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaagatcgccgattacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggacagcaaagtcggcggcaactacaactacctgtaccggctgttccggaagtccaacctgaagcctttcgagcgggacatcagcaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgcaatggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggcttccagcctacaaacggcgtgggctaccagccttacagagtggtggtgctgagcttcgagctgctgcatgctcctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaacctggtcaagaacaaatgcgtgaacttctga
[0215]
seq id no:4.rna序列中的sars-cov-2s-rbd-c3d-p28.6蛋白编码序列的dna等同物：
[0216]
atggatgctatgaagaggggcctgtgctgcgtgctgcttctgtgtggcgctgtgttcgtgtcccctagagtgcagcctaccgagagcatcgtgcggttccccaacatcaccaatctgtgccctttcggcgaggtgttcaacgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactacagcgtgctgtacaacagcgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcacccaccaagctgaacgacctgtgcttcaccaacgtgtacgccgacagcttcgtgatcagaggcgacgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaagatcgccgattacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggacagcaaagtcggcggcaactacaactacctgtaccggctgttccggaagtccaacctgaagcctttcgagcgggacatcagcaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgcaatggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggcttccagcctacaaacggcgtgggctaccagccttacagagtggtggtgctgagcttcgagctgctgcatgctcctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaacctggtcaagaacaaatgcgtgaacttcggcggaggcggaagtggtggcggcggatctaagtttctgaccaccgccaaggacaagaacagatgggaagatcccggcaagcagctgtacaatgtggaagccacaagctacgcaggcggcggaggaagcggaggcggaggtagtaaatttctgacaacggctaaagataagaatcgctgggaagatcctgggaaacagctctataacgtcgaggccaccagctatgctggcggtggcggatctggcggcggtggttcaaaattcctgactacagccaaggataagaatcgttgggaagatccaggcaagcaactctataatgttgaggctacctcttacgctggtggcggaggttctggcggcggaggctctaaatttctcacaacagcaaaggacaagaatcgatgggaagatccgggaaaacaactgtacaacgttgaggcaacatcctatgcaggcggaggtggcagtggcggaggtggaagcaagtttctgactactgcaaaagataagaatagatgggaagatcccgggaagcaactctacaacgtcgaagctactagttatgccggtggcggtggatctggcggaggcggcagcaaattcctgaccaccgctaaagacaagaatcgttgggaagatcccggaaagcagttgtataacgttgaagctacgtcctacgcctga
[0217]
seq id no:5.rna序列中的sars-cov-2核衣壳蛋白的蛋白编码序列的dna等同物
[0218]
atgagcgacaacggccctcagaaccagagaaacgcccctcggatcacatttggcggccctagcgatagcaccggcagcaatcagaatggcgagagaagcggcgccagaagcaagcagagaaggcctcaaggcctgcctaacaacaccgccagctggttcacagccctgacacagcacggcaaagaggacctgaagttccctagaggacagggcgtgcccatcaacaccaacagcagccccgatgaccagatcggctactacagacgggccaccagaagaatcagaggcggcgacggcaagatgaaggatctgagccccagatggtacttctactacctcggcacaggacccgaagccggacttccttatggcgccaacaaggacggcatcatctgggttgcaacagaaggcgccctgaacacccctaaggaccacatcggcaccagaaatcccgccaacaatgccgccattgtgctgcagttgcctcagggcacaacactgcccaagggcttttacgccgagggctctagaggcggatctcaggccagcagcagaagcagctccagatccagaaacagctcccggaatagcacccctggctccagcag
aggaacaagccctgctagaatggccggcaacggcggagatgctgctctggcacttctcctgctggaccggctgaatcagctggaaagcaagatgagcggcaagggacagcagcagcagggccagaccgtgacaaaaaagtctgccgccgaggccagcaagaagcccagacagaaaagaaccgccaccaaggcctacaacgtgacccaggcctttggcagaagaggccctgagcagacccagggcaatttcggcgatcaagagctgatcagacagggcaccgactacaagcactggcctcagatcgcccagtttgccccatctgccagcgcctttttcggcatgagccggatcggcatggaagtgacacctagcggcacctggctgacatacacaggcgccatcaagctggacgacaaggaccccaacttcaaggaccaagtgatcctgctgaacaagcacatcgacgcctacaagacattccctccaaccgagcctaagaaggacaagaagaagaaggccgacgagacacaggccctgcctcagcgccagaaaaagcagcagacagtgacactgctgccagccgccgacctggacgatttttctaagcagctgcagcagagcatgagcagcgccgattctacacaggcctga
[0219]
seq id no:6.rna序列中的sars-cov-2膜蛋白(m)的蛋白编码序列的dna等同物
[0220]
atggccgatagcaatggcaccatcaccgtggaagaactgaagaaactgctggaacagtggaacctcgtgatcggcttcctgttcctgacctggatctgcctgctgcagttcgcctacgccaaccggaacagattcctgtatattatcaagctgatcttcctgtggctgctgtggcccgtgacactggcctgttttgtgctggccgccgtgtaccggatcaactggatcacaggcggaatcgccattgccatggcctgtctcgttggcctgatgtggctgagctactttatcgccagcttccggctgttcgcccggaccagatccatgtggtccttcaatcccgagacaaacatcctgctgaacgtgcccctgcacggcaccatccttacaagacctctgctggaaagcgagctggtcatcggagccgtgatcctgagaggccacctgagaattgccggacaccacctgggcagatgcgacatcaaggacctgcctaaagaaatcacagtggccaccagcagaaccctgtcctactataagctgggcgccagccagagagtggccggcgattctggatttgccgcctacagcagataccggatcggcaactacaagctgaacaccgaccacagctccagcagcgacaatatcgcactgctggtgcagtga
[0221]
seq id no:7.表达sars-cov-2s-rbd-c3d-p28.6的非细胞病变性vee复制子的rna序列的dna等同物。下划线的是编码s-rbd-c3d-p28.6的序列。本发明的自复制性rna分子可以通过将下划线的s-rbd-c3d-p28.6用对应的sars-cov-2抗原(例如，seq id no:3、5或6)代替来生成：
[0222]
atgggcggcgcatgagagaagcccagaccaattacctacccaaaatggagaaagttcacgttgacatcgaggaagacagcccattcctcagagctttgcagcggagcttcccgcagtttgaggtagaagccaagcaggtcactgataatgaccatgctaatgccagagcgttttcgcatctggcttcaaaactgatcgaaacggaggtggacccatccgacacgatccttgacattggaagtgcgcccgcccgcagaatgtattctaagcacaagtatcattgtatctgtccgatgagatgtgcggaagatccggacagattgtataagtatgcaactaagctgaagaaaaactgtaaggaaataactgataaggaattggacaagaaaatgaaggagctcgccgccgtcatgagcgaccctgacctggaaactgagactatgtgcctccacgacgacgagtcgtgtcgctacgaagggcaagtcgctgtttaccaggatgtatacgcggttgacggaccgacaagtctctatcaccaagccaataagggagttagagtcgcctactggataggctttgacaccaccccttttatgtttaagaacttggctggagcatatccatcatactctaccaactgggccgacgaaaccgtgttaacggctcgtaacataggcctatgcagctctgacgttatggagcggtcacgtagagggatgtccattcttagaaagaagtatttgaaaccatccaacaatgttctattctctgttggctcgaccatctaccacgagaagagggacttactgaggagctggcacctgccgtctgtatttcacttacgtggcaagcaaaattacacatgtcggtgtgagactatagttagttgcgacgggtacgtcgttaaaagaatagctatcagtccaggcctgtatgggaagccttcaggctatgctgctacgatgcaccgcgagggattcttgtgctgcaaagtgacagacacattgaacggggagagggtctcttttcccgtgtgcacgtatgtgccagctacattgtgtgaccaaatgactggcatactggcaacagatgtcagtgcggacgacgcgcaaaaactgctggttgggctcaaccagcgtatagtcgtcaacggtcgcacccagagaaacaccaataccatgaaaaattaccttttgcccgtagtggcccaggcatttgctaggt
gggcaaaggaatataaggaagatcaagaagatgaaaggccactaggactacgagatagacagttagtcatggggtgttgttgggcttttagaaggcacaagataacatctatttataagcgcccggatacccaaaccatcatcaaagtgaacagcgatttccactcattcgtgctgcccaggataggcagtaacacattggagatcgggctgagaacaagaatcaggaaaatgttagaggagcacaaggagccgtcacctctcattaccgccgaggacgtacaagaagctaagtgcgcagccgatgaggctaaggaggtgcgtgaagccgaggagttgcgcgcagctctaccacctttggcagctgatgttgaggagcccactctggaagccgatgtcgacttgatgttacaagaggctggggccggctcagtggagacacctcgtggcttgataaaggttaccagctacgatggcgaggacaagatcggctcttacgctgtgctttctccgcaggctgtactcaagagtgaaaaattatcttgcatccaccctctcgctgaacaagtcatagtgataacacactctggccgaaaagggcgttatgccgtggaaccataccatggtaaagtagtggtgccagagggacatgcaatacccgtccaggactttcaagctctgagtgaaagtgccaccattgtgtacaacgaacgtgagttcgtaaacaggtacctgcaccatattgccacacatggaggagcgctgaacactgatgaagaatattacaaaactgtcaagcccagcgagcacgacggcgaatacctgtacgacatcgacaggaaacagtgcgtcaagaaagaactagtcactgggctagggctcacaggcgagctggtggatcctcccttccatgaattcgcctacgagagtctgagaacacgaccagccgctccttaccaagtaccaaccataggggtgtatggcgtgccaggatcaggcaagtctggcatcattaaaagcgcagtcaccaaaaaagatctagtggtgagcgccaagaaagaaaactgtgcagaaattataagggacgtcaagaaaatgaaagggctggacgtcaatgccagaactgtggactcagtgctcttgaatggatgcaaacaccccgtagagaccctgtatattgacgaagcttttgcttgtcatgcaggtactctcagagcgctcatagccattataagacctaaaaaggcagtgctctgcggggatcccaaacagtgcggtttttttaacatgatgtgcctgaaagtgcattttaaccacgagatttgcacacaagtcttccacaaaagcatctctcgccgttgcactaaatctgtgacttcggtcgtctcaaccttgttttacgacaaaaaaatgagaacgacgaatccgaaagagactaagattgtgattgacactaccggcagtaccaaacctaagcaggacgatctcattctcacttgtttcagagggtgggtgaagcagttgcaaatagattacaaaggcaacgaaataatgacggcagctgcctctcaagggctgacccgtaaaggtgtgtatgccgttcggtacaaggtgaatgaaaatcctctgtacgcacccacctcagaacatgtgaacgtcctactgacccgcacggaggaccgcatcgtgtggaaaacactagccggcgacccatggataaaaacactgactgccaagtaccctgggaatttcactgccacgatagaggagtggcaagcagagcatgatgccatcatgaggcacatcttggagagaccggaccctaccgacgtcttccagaataaggcaaacgtgtgttgggccaaggctttagtgccggtgctgaagaccgctggcatagacatgaccactgaacaatggaacactgtggattattttgaaacggacaaagctcactcagcagagatagtattgaaccaactatgcgtgaggttctttggactcgatctggactccggtctattttctgcacccactgttccgttatccattaggaataatcactgggataactccccgtcgcctaacatgtacgggctgaataaagaagtggtccgtcagctctctcgcaggtacccacaactgcctcgggcagttgccactggaagagtctatgacatgaacactggtacactgcgcaattatgatccgcgcataaacctagtacctgtaaacagaagactgcctcatgctttagtcctccaccataatgaacacccacagagtgacttttcttcattcgtcagcaaattgaagggcagaactgtcctggtggtcggggaaaagttgtccgtcccaggcaaaatggttgactggttgtcagaccggcctgaggctaccttcagagctcggctggatttaggcatcccaggtgatgtgcccaaatatgacataatatttgttaatgtgaggaccccatataaataccatcactatcagcagtgtgaagaccatgccattaagcttagcatgttgaccaagaaagcttgtctgcatctgaatcccggcggaacctgtgtcagcataggttatggttacgctgacagggccagcgaaagcatcattggtgctatagcgcggctgttcaagttttcccgggtatgcaaaccgaaatcctcacttgaagagacggaagttctgtttgtattcattgggtacgatcgcaaggcccgtacgcacaatccttacaagctttcatcaaccttgaccaacatttatacaggttccagactccacgaagccggatgtgcaccctcatatcatgtggtgcgaggggatattgccacggccaccgaaggagtgattataaatgctgctaacagcaaaggacaacctggcggaggggtgtgcggagcgctgtataagaaattcccggaaagcttcgatttacagccgatcgaagtaggaaaagcgcgactggtcaaaggtgcagctaaacatatca
ttcatgccgtaggaccaaacttcaacaaagtttcggaggttgaaggtgacaaacagttggcagaggcttatgagtccatcgctaagattgtcaacgataacaattacaagtcagtagcgattccactgttgtccaccggcatcttttccgggaacaaagatcgactaacccaatcattgaaccatttgctgacagctttagacaccactgatgcagatgtagccatatactgcagggacaagaaatgggaaatgactctcaaggaagcagtggctaggagagaagcagtggaggagatatgcatatccgacgactcttcagtgacagaacctgatgcagagctggtgagggtgcatccgaagagttctttggctggaaggaagggctacagcacaagcgatggcaaaactttctcatatttggaagggaccaagtttcaccaggcggccaaggatatagcagaaattaatgccatgtggcccgttgcaacggaggccaatgagcaggtatgcatgtatatcctcggagaaagcatgagcagtattaggtcgaaatgccccgtcgaagagtcggaagcctccacaccacctagcacgctgccttgcttgtgcatccatgccatgactccagaaagagtacagcgcctaaaagcctcacgtccagaacaaattactgtgtgctcatcctttccattgccgaagtatagaatcactggtgtgcagaagatccaatgctcccagcctatattgttctcaccgaaagtgcctgcgtatattcatccaaggaagtatctcgtggaaacaccaccggtagacgagactccggagccatcggcagagaaccaatccacagaggggacacctgaacaaccaccacttataaccgaggatgagaccaggactagaacgcctgagccgatcatcatcgaagaggaagaagaggatagcataagtttgctgtcagatggcccgacccaccaggtgctgcaagtcgaggcagacattcacgggccgccctctgtatctagctcatcctggtccattcctcatgcatccgactttgatgtggacagtttatccatacttgacaccctggagggagctagcgtgaccagcggggcaacgtcagccgagactaactcttacttcgcaaagagtatggagtttctggcgcgaccggtgcctgcgcctcgaacagtattcaggaaccctccacatcccgctccgcgcacaagaacaccgtcacttgcacccagcagggcctgctcgagaaccagcctagtttccaccccgccaggcgtgaatagggtgatcactagagaggagctcgaggcgcttaccccgtcacgcactcctagcaggtcggtctcgagaaccagcctggtctccaacccgccaggcgtaaatagggtgattacaagagaggagtttgaggcgttcgtagcacaacaacaatgacggtttgatgcgggtgcatacatcttttcctccgacaccggtcaagggcatttacaacaaaaatcagtaaggcaaacggtgctatccgaagtggtgttggagaggaccgaattggagatttcgtatgccccgcgcctcgaccaagaaaaagaagaattactacgcaagaaattacagttaaatcccacacctgctaacagaagcagataccagtccaggaaggtggagaacatgaaagccataacagctagacgtattctgcaaggcctagggcattatttgaaggcagaaggaaaagtggagtgctaccgaaccctgcatcctgttcctttgtattcatctagtgtgaaccgtgccttttcaagccccaaggtcgcagtggaagcctgtaacgccatgttgaaagagaactttccgactgtggcttcttactgtattattccagagtacgatgcctatttggacatggttgacggagcttcatgctgcttagacactgccagtttttgccctgcaaagctgcgcagctttccaaagaaacactcctatttggaacccacaatacgatcggcagtgccttcagcgatccagaacacgctccagaacgtcctggcagctgccacaaaaagaaattgcaatgtcacgcaaatgagagaattgcccgtattggattcggcggcctttaatgtggaatgcttcaagaaatatgcgtgtaataatgaatattgggaaacgtttaaagaaaaccccatcaggcttactgaagaaaacgtggtaaattacattaccaaattaaaaggaccaaaagctgctgctctttttgcgaagacacataatttgaatatgttgcaggacataccaatggacaggtttgtaatggacttaaagagagacgtgaaagtgactccaggaacaaaacatactgaagaacggcccaaggtacaggtgatccaggctgccgatccgctagcaacagcgtatctgtgcggaatccaccgagagctggttaggagattaaatgcggtcctgcttccgaacattcatacactgtttgatatgtcggctgaagactttgacgctattatagccgagcacttccagcctggggattgtgttctggaaactgacatcgcgtcgtttgataaaagtgaggacgacgccatggctctgaccgcgttaatgattctggaagacttaggtgtggacgcagagctgttgacgctgattgaggcggctttcggcgaaatttcatcaatacatttgcccactaaaactaaatttaaattcggagccatgatgaaatctggaatgttcctcacactgtttgtgaacacagtcattaacattgtaatcgcaagcagagtgttgagagaacggctaaccggatcaccatgtgcagcattcattggagatgacaatatcgtgaaaggagtcaaatcggacaaattaatggcagacaggtgcgccacctggttgaatatggaagtcaagattatagatgctgtggtgggcgagaaagcgccttatttctgtggagggtttattt
tgtgtgactccgtgaccggcacagcgtgccgtgtggcagaccccctaaaaaggctgtttaagcttggcaaacctctggcagcagacgatgaacatgatgatgacaggagaagggcattgcatgaagagtcaacacgctggaaccgagtgggtattctttcagagctgtgcaaggcagtagaatcaaggtatgaaaccgtaggaacttccatcatagttatggccatgactactctagctagcagtgttaaatcattcagctacctgagaggggcccctataactctctacggctaacctgaatggactacgacatagtctagtccgccaaggccaccatggatgctatgaagaggggcctgtgctgcgtgctgcttctgtgtggcgctgtgttcgtgtcccctagagtgcagcctaccgagagcatcgtgcggttccccaacatcaccaatctgtgccctttcggcgaggtgttcaacgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactacagcgtgctgtacaacagcgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcacccaccaagctgaacgacctgtgcttcaccaacgtgtacgccgacagcttcgtgatcagaggcgacgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaagatcgccgattacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggacagcaaagtcggcggcaactacaactacctgtaccggctgttccggaagtccaacctgaagcctttcgagcgggacatcagcaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgcaatggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggcttccagcctacaaacggcgtgggctaccagccttacagagtggtggtgctgagcttcgagctgctgcatgctcctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaacctggtcaagaacaaatgcgtgaacttcggcggaggcggaagtggtggcggcggatctaagtttctgaccaccgccaaggacaagaacagatgggaagatcccggcaagcagctgtacaatgtggaagccacaagctacgcaggcggcggaggaagcggaggcggaggtagtaaatttctgacaacggctaaagataagaatcgctgggaagatcctgggaaacagctctataacgtcgaggccaccagctatgctggcggtggcggatctggcggcggtggttcaaaattcctgactacagccaaggataagaatcgttgggaagatccaggcaagcaactctataatgttgaggctacctcttacgctggtggcggaggttctggcggcggaggctctaaatttctcacaacagcaaaggacaagaatcgatgggaagatccgggaaaacaactgtacaacgttgaggcaacatcctatgcaggcggaggtggcagtggcggaggtggaagcaagtttctgactactgcaaaagataagaatagatgggaagatcccgggaagcaactctacaacgtcgaagctactagttatgccggtggcggtggatctggcggaggcggcagcaaattcctgaccaccgctaaagacaagaatcgttgggaagatcccggaaagcagttgtataacgttgaagctacgtcctacgcctgaggcgcgcctatgttacgtgcaaaggtgattgtcaccccccgaaagaccatattgtgacacaccctcagtatcacgcccaaacatttacagccgcggtgtcaaaaaccgcgtggacgtggttaacatccctgctgggaggatcagccgtaattattataattggcttggtgctggctactattgtggccatgtacgtgctgaccaaccagaaacataattgaatacagcagcaattggcaagctgcttacatagaactcgcggcgattggcatgccgccttaaaatttttattttatttttcttttcttttccgaatcggattttgtttttaatatttcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaataggg
[0223]
seq id no:8.sars-cov-2核衣壳蛋白(n)的氨基酸序列，也在genbank中以登录号yp_009724397.2存在：
[0224]
msdngpqnqrnapritfggpsdstgsnqngersgarskqrrpqglpnntaswftaltqhgkedlkfprgqgvpintnsspddqigyyrratrrirggdgkmkdlsprwyfyylgtgpeaglpygankdgiiwvategalntpkdhigtrnpannaaivlqlpqgttlpkgfyaegsrggsqassrsssrsrnssrnstpgssrgtsparmagnggdaalalllldrlnqleskmsgkgqqqqgqtvtkksaaeaskkprqkrtatkaynvtqafgrrgpeqtqgnfgdqelirqgtdykhwpqiaqfapsasaffgmsrigmevtpsgtwltytgaiklddkdpnfkdqvillnkhidayktfpptepkkdkkkkadetqalpqrqkkqqtvtllpaadlddfskqlqqsmssadstqa
[0225]
seq id no:9.sars-cov-2膜蛋白(m)的氨基酸序列，也在genbank中以登录号yp_009724393.1存在：
[0226]
madsngtitveelkklleqwnlvigflfltwicllqfayanrnrflyiikliflwllwpvtlacfvlaa
vyrinwitggiaiamaclvglmwlsyfiasfrlfartrsmwsfnpetnillnvplhgtiltrplleselvigavilrghlriaghhlgrcdikdlpkeitvatsrtlsyyklgasqrvagdsgfaaysryrignyklntdhssssdniallvq
[0227]
seq id no:10.不带抗原orf的非细胞病理性vee复制子的rna序列的dna等同物：
[0228]
atgggcggcgcatgagagaagcccagaccaattacctacccaaaatggagaaagttcacgttgacatcgaggaagacagcccattcctcagagctttgcagcggagcttcccgcagtttgaggtagaagccaagcaggtcactgataatgaccatgctaatgccagagcgttttcgcatctggcttcaaaactgatcgaaacggaggtggacccatccgacacgatccttgacattggaagtgcgcccgcccgcagaatgtattctaagcacaagtatcattgtatctgtccgatgagatgtgcggaagatccggacagattgtataagtatgcaactaagctgaagaaaaactgtaaggaaataactgataaggaattggacaagaaaatgaaggagctcgccgccgtcatgagcgaccctgacctggaaactgagactatgtgcctccacgacgacgagtcgtgtcgctacgaagggcaagtcgctgtttaccaggatgtatacgcggttgacggaccgacaagtctctatcaccaagccaataagggagttagagtcgcctactggataggctttgacaccaccccttttatgtttaagaacttggctggagcatatccatcatactctaccaactgggccgacgaaaccgtgttaacggctcgtaacataggcctatgcagctctgacgttatggagcggtcacgtagagggatgtccattcttagaaagaagtatttgaaaccatccaacaatgttctattctctgttggctcgaccatctaccacgagaagagggacttactgaggagctggcacctgccgtctgtatttcacttacgtggcaagcaaaattacacatgtcggtgtgagactatagttagttgcgacgggtacgtcgttaaaagaatagctatcagtccaggcctgtatgggaagccttcaggctatgctgctacgatgcaccgcgagggattcttgtgctgcaaagtgacagacacattgaacggggagagggtctcttttcccgtgtgcacgtatgtgccagctacattgtgtgaccaaatgactggcatactggcaacagatgtcagtgcggacgacgcgcaaaaactgctggttgggctcaaccagcgtatagtcgtcaacggtcgcacccagagaaacaccaataccatgaaaaattaccttttgcccgtagtggcccaggcatttgctaggtgggcaaaggaatataaggaagatcaagaagatgaaaggccactaggactacgagatagacagttagtcatggggtgttgttgggcttttagaaggcacaagataacatctatttataagcgcccggatacccaaaccatcatcaaagtgaacagcgatttccactcattcgtgctgcccaggataggcagtaacacattggagatcgggctgagaacaagaatcaggaaaatgttagaggagcacaaggagccgtcacctctcattaccgccgaggacgtacaagaagctaagtgcgcagccgatgaggctaaggaggtgcgtgaagccgaggagttgcgcgcagctctaccacctttggcagctgatgttgaggagcccactctggaagccgatgtcgacttgatgttacaagaggctggggccggctcagtggagacacctcgtggcttgataaaggttaccagctacgatggcgaggacaagatcggctcttacgctgtgctttctccgcaggctgtactcaagagtgaaaaattatcttgcatccaccctctcgctgaacaagtcatagtgataacacactctggccgaaaagggcgttatgccgtggaaccataccatggtaaagtagtggtgccagagggacatgcaatacccgtccaggactttcaagctctgagtgaaagtgccaccattgtgtacaacgaacgtgagttcgtaaacaggtacctgcaccatattgccacacatggaggagcgctgaacactgatgaagaatattacaaaactgtcaagcccagcgagcacgacggcgaatacctgtacgacatcgacaggaaacagtgcgtcaagaaagaactagtcactgggctagggctcacaggcgagctggtggatcctcccttccatgaattcgcctacgagagtctgagaacacgaccagccgctccttaccaagtaccaaccataggggtgtatggcgtgccaggatcaggcaagtctggcatcattaaaagcgcagtcaccaaaaaagatctagtggtgagcgccaagaaagaaaactgtgcagaaattataagggacgtcaagaaaatgaaagggctggacgtcaatgccagaactgtggactcagtgctcttgaatggatgcaaacaccccgtagagaccctgtatattgacgaagcttttgcttgtcatgcaggtactctcagagcgctcatagccattataagacctaaaaaggcagtgctctgcggggatcccaaacagtgcggtttttttaacatgatgtgcctgaaagtgcattttaaccacgagatttgcacacaagtcttccacaaaagcatctctcgccgttgcactaaatctgtgacttcggtcgtctcaaccttgttttacgacaaaaaaatgagaacgacgaatccgaaagagactaagattgtgattgacactaccggcagtaccaaacctaagcaggacgatctcattctcacttgtttcagagggtgggtgaagcagttgcaaatagattacaaagg
caacgaaataatgacggcagctgcctctcaagggctgacccgtaaaggtgtgtatgccgttcggtacaaggtgaatgaaaatcctctgtacgcacccacctcagaacatgtgaacgtcctactgacccgcacggaggaccgcatcgtgtggaaaacactagccggcgacccatggataaaaacactgactgccaagtaccctgggaatttcactgccacgatagaggagtggcaagcagagcatgatgccatcatgaggcacatcttggagagaccggaccctaccgacgtcttccagaataaggcaaacgtgtgttgggccaaggctttagtgccggtgctgaagaccgctggcatagacatgaccactgaacaatggaacactgtggattattttgaaacggacaaagctcactcagcagagatagtattgaaccaactatgcgtgaggttctttggactcgatctggactccggtctattttctgcacccactgttccgttatccattaggaataatcactgggataactccccgtcgcctaacatgtacgggctgaataaagaagtggtccgtcagctctctcgcaggtacccacaactgcctcgggcagttgccactggaagagtctatgacatgaacactggtacactgcgcaattatgatccgcgcataaacctagtacctgtaaacagaagactgcctcatgctttagtcctccaccataatgaacacccacagagtgacttttcttcattcgtcagcaaattgaagggcagaactgtcctggtggtcggggaaaagttgtccgtcccaggcaaaatggttgactggttgtcagaccggcctgaggctaccttcagagctcggctggatttaggcatcccaggtgatgtgcccaaatatgacataatatttgttaatgtgaggaccccatataaataccatcactatcagcagtgtgaagaccatgccattaagcttagcatgttgaccaagaaagcttgtctgcatctgaatcccggcggaacctgtgtcagcataggttatggttacgctgacagggccagcgaaagcatcattggtgctatagcgcggctgttcaagttttcccgggtatgcaaaccgaaatcctcacttgaagagacggaagttctgtttgtattcattgggtacgatcgcaaggcccgtacgcacaatccttacaagctttcatcaaccttgaccaacatttatacaggttccagactccacgaagccggatgtgcaccctcatatcatgtggtgcgaggggatattgccacggccaccgaaggagtgattataaatgctgctaacagcaaaggacaacctggcggaggggtgtgcggagcgctgtataagaaattcccggaaagcttcgatttacagccgatcgaagtaggaaaagcgcgactggtcaaaggtgcagctaaacatatcattcatgccgtaggaccaaacttcaacaaagtttcggaggttgaaggtgacaaacagttggcagaggcttatgagtccatcgctaagattgtcaacgataacaattacaagtcagtagcgattccactgttgtccaccggcatcttttccgggaacaaagatcgactaacccaatcattgaaccatttgctgacagctttagacaccactgatgcagatgtagccatatactgcagggacaagaaatgggaaatgactctcaaggaagcagtggctaggagagaagcagtggaggagatatgcatatccgacgactcttcagtgacagaacctgatgcagagctggtgagggtgcatccgaagagttctttggctggaaggaagggctacagcacaagcgatggcaaaactttctcatatttggaagggaccaagtttcaccaggcggccaaggatatagcagaaattaatgccatgtggcccgttgcaacggaggccaatgagcaggtatgcatgtatatcctcggagaaagcatgagcagtattaggtcgaaatgccccgtcgaagagtcggaagcctccacaccacctagcacgctgccttgcttgtgcatccatgccatgactccagaaagagtacagcgcctaaaagcctcacgtccagaacaaattactgtgtgctcatcctttccattgccgaagtatagaatcactggtgtgcagaagatccaatgctcccagcctatattgttctcaccgaaagtgcctgcgtatattcatccaaggaagtatctcgtggaaacaccaccggtagacgagactccggagccatcggcagagaaccaatccacagaggggacacctgaacaaccaccacttataaccgaggatgagaccaggactagaacgcctgagccgatcatcatcgaagaggaagaagaggatagcataagtttgctgtcagatggcccgacccaccaggtgctgcaagtcgaggcagacattcacgggccgccctctgtatctagctcatcctggtccattcctcatgcatccgactttgatgtggacagtttatccatacttgacaccctggagggagctagcgtgaccagcggggcaacgtcagccgagactaactcttacttcgcaaagagtatggagtttctggcgcgaccggtgcctgcgcctcgaacagtattcaggaaccctccacatcccgctccgcgcacaagaacaccgtcacttgcacccagcagggcctgctcgagaaccagcctagtttccaccccgccaggcgtgaatagggtgatcactagagaggagctcgaggcgcttaccccgtcacgcactcctagcaggtcggtctcgagaaccagcctggtctccaacccgccaggcgtaaatagggtgattacaagagaggagtttgaggcgttcgtagcacaacaacaatgacggtttgatgcgggtgcatacatcttttcctccgacaccggtcaagggcatttacaacaaaaatcagtaaggcaaacggtgct
atccgaagtggtgttggagaggaccgaattggagatttcgtatgccccgcgcctcgaccaagaaaaagaagaattactacgcaagaaattacagttaaatcccacacctgctaacagaagcagataccagtccaggaaggtggagaacatgaaagccataacagctagacgtattctgcaaggcctagggcattatttgaaggcagaaggaaaagtggagtgctaccgaaccctgcatcctgttcctttgtattcatctagtgtgaaccgtgccttttcaagccccaaggtcgcagtggaagcctgtaacgccatgttgaaagagaactttccgactgtggcttcttactgtattattccagagtacgatgcctatttggacatggttgacggagcttcatgctgcttagacactgccagtttttgccctgcaaagctgcgcagctttccaaagaaacactcctatttggaacccacaatacgatcggcagtgccttcagcgatccagaacacgctccagaacgtcctggcagctgccacaaaaagaaattgcaatgtcacgcaaatgagagaattgcccgtattggattcggcggcctttaatgtggaatgcttcaagaaatatgcgtgtaataatgaatattgggaaacgtttaaagaaaaccccatcaggcttactgaagaaaacgtggtaaattacattaccaaattaaaaggaccaaaagctgctgctctttttgcgaagacacataatttgaatatgttgcaggacataccaatggacaggtttgtaatggacttaaagagagacgtgaaagtgactccaggaacaaaacatactgaagaacggcccaaggtacaggtgatccaggctgccgatccgctagcaacagcgtatctgtgcggaatccaccgagagctggttaggagattaaatgcggtcctgcttccgaacattcatacactgtttgatatgtcggctgaagactttgacgctattatagccgagcacttccagcctggggattgtgttctggaaactgacatcgcgtcgtttgataaaagtgaggacgacgccatggctctgaccgcgttaatgattctggaagacttaggtgtggacgcagagctgttgacgctgattgaggcggctttcggcgaaatttcatcaatacatttgcccactaaaactaaatttaaattcggagccatgatgaaatctggaatgttcctcacactgtttgtgaacacagtcattaacattgtaatcgcaagcagagtgttgagagaacggctaaccggatcaccatgtgcagcattcattggagatgacaatatcgtgaaaggagtcaaatcggacaaattaatggcagacaggtgcgccacctggttgaatatggaagtcaagattatagatgctgtggtgggcgagaaagcgccttatttctgtggagggtttattttgtgtgactccgtgaccggcacagcgtgccgtgtggcagaccccctaaaaaggctgtttaagcttggcaaacctctggcagcagacgatgaacatgatgatgacaggagaagggcattgcatgaagagtcaacacgctggaaccgagtgggtattctttcagagctgtgcaaggcagtagaatcaaggtatgaaaccgtaggaacttccatcatagttatggccatgactactctagctagcagtgttaaatcattcagctacctgagaggggcccctataactctctacggctaacctgaatggactacgacatagtctagtccgccaaggccaccggcgcgcctatgttacgtgcaaaggtgattgtcaccccccgaaagaccatattgtgacacaccctcagtatcacgcccaaacatttacagccgcggtgtcaaaaaccgcgtggacgtggttaacatccctgctgggaggatcagccgtaattattataattggcttggtgctggctactattgtggccatgtacgtgctgaccaaccagaaacataattgaatacagcagcaattggcaagctgcttacatagaactcgcggcgattggcatgccgccttaaaatttttattttatttttcttttcttttccgaatcggattttgtttttaatatttcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaataggg
[0229]
seq id no:11.tc-83nsp1的氨基酸序列:
[0230]
mekvhvdieedspflralqrsfpqfeveakqvtdndhanarafshlasklietevdpsdtildigsaparrmyskhkyhcicpmrcaedpdrlykyatklkknckeitdkeldkkmkelaavmsdpdletetmclhddescryegqvavyqdvyavdgptslyhqankgvrvaywigfdttpfmfknlagaypsystnwadetvltarniglcssdvmersrrgmsilrkkylkpsnnvlfsvgstiyhekrdllrswhlpsvfhlrgkqnytcrcetivscdgyvvkriaispglygkpsgyaatmhregflcckvtdtlngervsfpvctyvpatlcdqmtgilatdvsaddaqkllvglnqrivvngrtqrntntmknyllpvvaqafarwakeykedqederplglrdrqlvmgccwafrrhkitsiykrpdtqtiikvnsdfhsfvlprigsntleiglrtrirkmleehkepsplitaedvqeakcaadeakevreaeelraalpplaadveeptleadvdlmlqeaga
[0231]
seq id no:12.tc-83nsp2的氨基酸序列:
[0232]
gsvetprglikvtsydgedkigsyavlspqavlkseklscihplaeqvivithsgrkgryavepyhgkvvvpeghaipvqdfqalsesativynerefvnrylhhiathggalntdeeyyktvkpsehdgeylydidrkqcvkkelvtglgltgelvdppfhefayeslrtrpaapyqvptigvygvpgsgksgiiksavtkkdlvvsakkencaeiirdvkkmkgldvnartvdsvllngckhpvetlyideafachagtlraliaiirpkkavlcgdpkqcgffnmmclkvhfnheictqvfhksisrrctksvtsvvstlfydkkmrttnpketkividttgstkpkqddliltcfrgwvkqlqidykgneimtaaasqgltrkgvyavrykvnenplyaptsehvnvlltrtedrivwktlagdpwiktltakypgnftatieewqaehdaimrhilerpdptdvfqnkanvcwakalvpvlktagidmtteqwntvdyfetdkahsaeivlnqlcvrffgldldsglfsaptvplsirnnhwdnspspnmyglnkevvrqlsrrypqlpravatgrvydmntgtlrnydprinlvpvnrrlphalvlhhnehpqsdfssfvsklkgrtvlvvgeklsvpgkmvdwlsdrpeatfrarldlgipgdvpkydiifvnvrtpykyhhyqqcedhaiklsmltkkaclhlnpggtcvsigygyadrasesiigaiarqfkfsrvckpkssleetevlfvfigydrkarthnpyklsstltniytgsrlheagc
[0233]
seq id no:13.如nsp1-3前体中所存在的tc-83nsp3的氨基酸序列：
[0234]
apsyhvvrgdiatategviinaanskgqpgggvcgalykkfpesfdlqpievgkarlvkgaakhiihavgpnfnkvsevegdkqlaeayesiakivndnnyksvaipllstgifsgnkdrltqslnhlltaldttdadvaiycrdkkwemtlkeavarreaveeicisddssvtepdaelvrvhpksslagrkgystsdgktfsylegtkfhqaakdiaeinamwpvateaneqvcmyilgesmssirskcpveeseastppstlpclcihamtpervqrlkasrpeqitvcssfplpkyritgvqkiqcsqpilfspkvpayihprkylvetppvdetpepsaenqstegtpeqpplitedetrtrtpepiiieeeeedsisllsdgpthqvlqveadihgppsvsssswsiphasdfdvdslsildtlegasvtsgatsaetnsyfaksmeflarpvpaprtvfrnpphpaprtrtpslapsracsrtslvstppgvnrvitreelealtpsrtpsrsvsrtslvsnppgvnrvitreefeafvaqqq
[0235]
seq id no:14.tc-83nsp4的氨基酸序列:
[0236]
yifssdtgqghlqqksvrqtvlsevvlerteleisyaprldqekeellrkklqlnptpanrsryqsrkvenmkaitarrilqglghylkaegkvecyrtlhpvplysssvnrafsspkvaveacnamlkenfptvasyciipeydayldmvdgasccldtasfcpaklrsfpkkhsyleptirsavpsaiqntlqnvlaaatkrncnvtqmrelpvldsaafnvecfkkyacnneywetfkenpirlteenvvnyitklkgpkaaalfakthnlnmlqdipmdrfvmdlkrdvkvtpgtkhteerpkvqviqaadplataylcgihrelvrrlnavllpnihtlfdmsaedfdaiiaehfqpgdcvletdiasfdkseddamaltalmiledlgvdaelltlieaafgeissihlptktkfkfgammksgmfltlfvntviniviasrvlrerltgspcaafigddnivkgvksdklmadrcatwlnmevkiidavvgekapyfcggfilcdsvtgtacrvadplkrlfklgkplaaddehdddrrralheestrwnrvgilselckavesryetvgtsiivmamttlassvksfsylrgapitlyg
[0237]
seq id no:15.具有q739l突变的tc-83nsp2蛋白的氨基酸序列：
[0238]
gsvetprglikvtsydgedkigsyavlspqavlkseklscihplaeqvivithsgrkgryavepyhgkvvvpeghaipvqdfqalsesativynerefvnrylhhiathggalntdeeyyktvkpsehdgeylydidrkqcvkkelvtglgltgelvdppfhefayeslrtrpaapyqvptigvygvpgsgksgiiksavtkkdlvvsakkencaeiirdvkkmkgldvnartvdsvllngckhpvetlyideafachagtlraliaiirpkkavlcgdpkqcgffnmmclkvhfnheictqvfhksisrrctksvtsvvstlfydkkmrttnpketkividttgstkpkqddliltcfrgwvkqlqidykgneimtaaasqgltrkgvyavrykvnenplyaptsehvnvlltrtedrivwktlagdpwiktltakypgnftatieewqaehdaimrhilerpdptdvfqnkanvcwakalvpvlktagidmtteqwntvdyfetdkahsaeivlnqlcvrffgldldsglfsaptvplsirnnhwdnspspnmyglnkevvrqlsrrypqlpravatgrvydmntgtlrnydprinlvpvnrrlphalvlhhnehpqsdfssfvsklkgrtvlvvgeklsvpgkmvdwlsdrpeatfrarldlgipgdvpkydiifvnvrtpy
kyhhyqqcedhaiklsmltkkaclhlnpggtcvsigygyadrasesiigaiarlfkfsrvckpkssleetevlfvfigydrkarthnpyklsstltniytgsrlheagc
[0239]
seq id no:16.sars-cov-2刺突蛋白的氨基酸序列：
[0240]
mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrarsvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldkveaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt
[0241]
seq id no:17.sars-cov-2刺突蛋白的rna序列的dna等同物：
[0242]
atgttcgtgttcctggtgctgctgcctctggtgtccagccagtgtgtgaacctgaccaccagaacacagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagaggcgtgtactaccccgacaaggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgtccggcaccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacggggtgtactttgccagcaccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactggacagcaagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccagttctgcaacgaccccttcctgggcgtctactaccacaagaacaacaagagctggatggaaagcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtcccagcctttcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgtttaagaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacacccctatcaacctcgtgcgggatctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtggatctgcccatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacctggcgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcctagaaccttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatcctctgagcgagacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtcca
atctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagagagcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatatcgccgataccacagacgccgttagagatccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccaggacgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgccgatcagctgacacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtctgatcggagccgagcacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctgtgccagctaccagacacagacaaacagccccagacgggccagatctgtggccagccagagcatcattgcctacacaatgtctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaacaactctatcgctatccccaccaacttcaccatcagcgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgattccaccgagtgctccaacctgctgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaatagagccctgacagggatcgccgtggaacaggacaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctacaagacccctcctatcaaggacttcggcggcttcaatttcagccagattctgcccgatcctagcaagcccagcaagcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactggccgacgccggcttcatcaagcagtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctgatttgcgcccagaagtttaacggactgacagtgctgcctcctctgctgaccgatgagatgatcgcccagtacacatctgccctgctggccggcacaatcacaagcggctggacatttggagctggcgccgctctgcagatcccctttgctatgcagatggcctaccggttcaacggcatcggagtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgccatcggcaagatccaggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggtcaaccagaatgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgccatcagctctgtgctgaacgatatcctgagcagactggacaaggtggaggccgaggtgcagatcgacagactgatcacaggcagactgcagagcctccagacatacgtgacccagcagctgatcagagccgccgagattagagcctctgccaatctggccgccaccaagatgtctgagtgtgtgctgggccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctaccacctgatgagcttccctcagtctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatatgtgcccgctcaagagaagaatttcaccaccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttcctagagaaggcgtgttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacacagcggaacttctacgagccccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcattgtgaacaataccgtgtacgaccctctgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactggacaagtactttaagaaccacacaagccccgacgtggacctgggcgatatcagcggaatcaatgccagcgtcgtgaacatccagaaagagatcgaccggctgaacgaggtggccaagaatctgaacgagagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatggtcacaatcatgctgtgttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcagctgctgcaagttcgacgaggacgattctgagcccgtgctgaagggcgtgaaactgcactacacctga
[0243]
seq id no:18.如在nsp1-4中所存在的tc-83nsp3的氨基酸序列：
[0244]
apsyhvvrgdiatategviinaanskgqpgggvcgalykkfpesfdlqpievgkarlvkgaakhiihavgpnfnkvsevegdkqlaeayesiakivndnnyksvaipllstgifsgnkdrltqslnhlltaldttdadvaiycrdkkwemtlkeavarreaveeicisddssvtepdaelvrvhpksslagrkgystsdgktfsylegtkfhqaakdiaeinamwpvateaneqvcmyilgesmssirskcpveeseastppstlpclcihamtpervqrlkasrpeqitvcssfplpkyritgvqkiqcsqpilfspkvpayihprkylvetppvdetpepsaenqstegtpeqpplitedetrtrtpepiiieeeeedsisllsdgpthqvlqveadihgppsvsssswsiphasdfdvdslsildtlegasvtsgatsaetnsyfaksmef
larpvpaprtvfrnpphpaprtrtpslapsracsrtslvstppgvnrvitreelealtpsrtpsrsvsrtslvsnppgvnrvitreefeafvaqqqrfdaga
[0245]
seq id no:19.人组织纤溶酶原激活物前导肽的氨基酸序列：
[0246]
mdamkrglccvlllcgavfvsp
[0247]
实施例
[0248]
实施例1：通过sa-rna的疫苗抗原表达
[0249]
将sars-cov-2病毒的刺突蛋白(s-rbd，seq id no：3)和核衣壳蛋白(n，seq id no：5)的受体结合域克隆到自扩增rna(sarna)分子中，其源自委内瑞拉马脑炎病毒tc-83疫苗株，包含5’utr中的a3g取代和nsp2 q739l突变。将sarna-s-rbd和sarna-n转染到幼仓鼠肾21(bhk-21)细胞中。从用表达sars-cov-2s-rbd或n抗原的sarna转染的bhk细胞或未转染的对照细胞中分离总蛋白，并用于进行western印迹。图1：用1μg sarna-s1rbd转染的幼仓鼠肾(bhk)-21细胞(50000)，细胞中sars-cov-2-s1 rbd蛋白(约35kda)的表达(由条带指示)使用市售的特异性多克隆抗体(raybiotech，代码：130-10759)通过western印迹检测。未转染的bhk细胞也作为对照进行了测试，其中未鉴定出特异性条带。结果表明了sarna-s1rbd表达编码蛋白的特异性。
[0250]
在图2中：
[0251]
幼仓鼠肾(bhk)-21细胞(50000)当用1μg sarna-n蛋白转染时，细胞中sars-cov-2-n蛋白(约55kda)的表达(由条带指示)使用市售特异性多克隆抗体(raybiotech，代码：130-10760)通过western印迹检测。未转染的bhk细胞也作为对照进行了测试，其中未鉴定出特异性条带。结果表明了sarna-n表达编码蛋白质的特异性。
[0252]
实施例2：疫苗特异性适应性免疫响应
[0253]
sarna-s-rbd通过肌内注射(im)或皮内电穿孔(id)递送至swiss小鼠。以相同方式递送表达荧光素酶的sarna并用作对照。注射后7天分离接种疫苗和模拟对照小鼠(n＝3)的脾脏。用sarscov-2s肽混合物刺激脾细胞，以评估细胞毒性t细胞(cd3+cd8+)和t辅助细胞(cd3+cd4+)的响应。在sarna-s-rbd处理小鼠的细胞毒性t细胞和t辅助细胞(im和id)中均观察到了高百分比(3倍于模拟物对照)的il-4+(体液响应，th2/tc2)细胞。与sarna-荧光素酶组相比，治疗小鼠组中的inf+(th1/tc1，细胞免疫)细胞也显示出升高的水平(图3和4)。
[0254]
皮内注射
[0255]
swiss远交小鼠皮内注射1μg sarna-s1 rbd，然后在第0天进行电穿孔。在第7天分离脾细胞，并使用流式细胞术检查t细胞特异性细胞毒性(cd8+)和体液响应(cd4+)。所有样品都经过sars-cov-2s蛋白编码肽混合物的刺激。注射了luc-sarna的小鼠用作比较对照。il-4和ifn-g cd4+细胞的升高以及cd8+细胞的升高都表明诱导了辅助和细胞毒性适应性t细胞介导的响应。结果如图3所示。
[0256]
肌肉注射
[0257]
swiss远交系小鼠在第0天肌内注射1μg sarna-s1 rbd。在第7天分离脾细胞并使用流式细胞术检查t细胞特异性细胞毒性(cd8+)和体液响应(cd4+)。所有样品都经过sars-cov-2s蛋白编码肽混合物的刺激。注射了luc-sarna的小鼠用作比较对照。il-4和ifn-gcd4+细胞的升高以及cd8+细胞的升高都表明诱导了辅助和细胞毒性适应性t细胞介导的响应。结果如图4所示。
[0258]
实施例3：lnp配制的sa-rna的疫苗抗原表达
[0259]
为了增强稳定性和细胞内递送，将sars-cov-2抗原sarna构建体配制在脂质纳米颗粒(lnp)中。
[0260]
简言之，在ignite
tm
系统(precision nanosytems，pni)上制备含有包封的sarna的lnp。通过将脂质溶解在100％乙醇中制备脂质溶液(复合脂质c12-200、胆固醇、dope、dmg-peg 2000)。通过将所述脂质溶液与体外转录的sarna构建体以在柠檬酸盐缓冲液中3:1的比例加载到ignite
tm
装置中来制备lnp。总共使用1μg sarna制备lnp制剂，用pbs将其稀释至总体积为40μl。对于组合疫苗，将包含s-rbd sarna的lnp制剂与包含n sarna的lnp制剂(0.5μg sarna-s-rbd+0.5μgsarna-n)以1:1的比例混合。还在相同条件下制备了荧光素酶编码sarna(模拟)lnp制剂。
[0261]
sarnalnp制剂的体内表达
[0262]
如上所述制备荧光素酶编码sarna(模拟)lnp制剂，并用于评估sarna平台在swiss小鼠中的体内表达。雌性swiss小鼠(6-8周龄)获自janvier(法国)，并饲养在单独通风的笼中，可随意获取食物和水。使用异氟醚麻醉小鼠。将1微克编码荧光素酶的sarna(模拟)lnp制剂注射到6只小鼠的腓肠肌中。根据间隔21天的初免-加强(prime-boost)疫苗接种方案对小鼠进行免疫。在皮下d-荧光素注射后12分钟，在疫苗接种方案的几个时间点，通过非侵入性体内成像系统(ivis)lumia iii扫描确定总通量荧光素酶诱导的生物发光。该评估的结果如图5所示。
[0263]
第一次施用模拟疫苗后(第0天，基线)，生物发光信号迅速增加(从大约2.0
×
104p/s到1
×
108p/s)并保持高水平，然后在注射后十天缓慢下降。在第二次施用(加强)后检测到类似的快速生物发光信号。相比之下，使用类似的实验条件，pardi等(2015)观察到接种后7天生物发光信号的诱导比本文报告的信号低十倍(约2.0
×
106p/s)。同样，dealwis等(2020)报告，使用arcturus平台需要2μg sarna才能获得本文报告的生物发光信号。
[0264]
这些数据证实，本文开发的sarna平台在施用于swiss小鼠时能够产生延长的抗原表达。
[0265]
实施例4：初免接种疫苗后小鼠的结合抗体响应
[0266]
通过使用elisa(n＝6)在第21天收集的雌性swiss小鼠血清来表征初免注射1μgsarnalnp制剂进行肌内免疫后的sars-cov-2特异性体液响应。
[0267]
如上文实施例3所述进行体内抗原表达。在初免注射前(第0天)、加强注射前(第21天)和处死时(第35天)从尾静脉采集血样。通过颈椎脱臼对小鼠施安乐死，并收集支气管肺泡灌洗(bal)液和脾脏。在血液凝固后通过离心收集血清并等分以在进一步使用前于-80℃下储存。
[0268]
使用涂有1μg/ml重组sars-cov-2s1亚基蛋白rbd(s-rbd)、重组sars-cov-2核衣壳蛋白(n)的corning
tm costar
tm
酶联免疫吸附测定(elisa)板评估小鼠血清中的抗原特异性总igg滴度。封闭elisa板，与预稀释的血清样品一起温育，并添加hrp偶联的检测抗体以获得总igg滴度。洗涤板，使用tmb底物溶液显影并在分光光度计上在450nm(570nm背景)下读数。该评估的结果如图6和图7所示。
[0269]
使用lnp配制的s-rbd抗原(sarna-s-rbd)和n抗原(sarna-n)作为单独的疫苗进行的免疫在初免接种后3周诱导了100％的血清转化，并具有与模拟疫苗接种相比显著强烈的
总s抗原结合igg抗体响应(6.29
×
104，p《0.0001，图6)以及n抗原结合igg抗体响应(2.97
×
104，p《0.05)(图7)。此外，联合疫苗接种(sarna-s-rbd+sarna-n)还在初免后3周诱导s和n抗原特异性结合igg滴度水平升高(分别为1.56
×
104，p《0.0001，和2.85
×
104，p《0.0001)，分别如图6和图7所示。
[0270]
这些数据表明，用lnp配制的sarna-s-rbd和sarna-n初免疫苗接种在swiss小鼠中无论是在单独还是联合疫苗接种方案中都诱导了强烈的结合抗体响应。
[0271]
实施例5：小鼠在加强疫苗接种后的结合抗体响应
[0272]
使用elisa通过加强疫苗接种两周(即初免疫苗接种后五周，第一次免疫后第35天)后收集的swiss小鼠血清，表征加强注射1μg sarna lnp制剂进行肌内免疫后的sars-cov-2特异性体液响应。实验方法与上述实施例4相似。这些评估的结果如图8和9所示。
[0273]
从接种sarna-s-rbd疫苗的小鼠以及接种sarna-s-rbd和sarna-n的组合疫苗的小鼠初免注射后21天收集的样品的平均s特异性igg滴度保持同样地升高(分别为6.55
×
104和3.13
×
104)，如图8所示。从用sarna-s-rbd和sarna-n的组合接种疫苗的小鼠中获得了类似的结果(3.42
×
104)，如图9所示。
[0274]
在初免注射后35天(即加强疫苗接种后两周)收集的样品中，在用sarna-s-rbd和sarna-n的组合疫苗接种的组中，s特异性和n特异性igg滴度都失去了统计显著性。这是因为事实上在初免注射后第35天收集的许多样品中含有的igg滴度太高，无法使用常规样品稀释进行测量(igg滴度》2
×
105)。
[0275]
这些实验表明，使用单独和组合的sarna lnp制剂进行的初免疫苗接种会诱导重要的sars-cov-2结合抗体响应，该响应可以在加强免疫后得到增强。与其他sars-cov疫苗开发人员公布的数据相比，使用本文描述的sarna平台获得的s特异性igg滴度表现出色。事实上，根据vogel等(2020)，使用1μg常规mrna疫苗对balb/c小鼠的仅初免疫苗接种产生《102s特异性结合igg滴度。使用30μg的相同疫苗对非人初免者(primers)(nhp)进行初免和加强疫苗接种仅能诱导至多约1.5
×
104的s特异性结合igg滴度。另一方面，使用corbett等(2020)描述的1μg mrna疫苗对三种不同的小鼠品系进行初免和加强疫苗接种能够诱导更高的s特异性igg滴度，达到105至106的水平。使用与本文所述不同的sarna平台，dealwis等(2020)报告在使用2μg的其sarna构建体对balb/c和c57bl/6小鼠进行初免疫苗接种30天后产生约106的s特异性igg水平。类似地，两个不同的组报告了在使用约1μg的替代性sarna构建体对balb/c小鼠进行初免和加强疫苗接种后的s特异性igg滴度为约106(mckay等，2020)和《103(erasmus等，2020)。最后，一组能够在对balb/c小鼠仅进行初免疫苗接种后12周内诱导高达1.3
×
105的s特异性igg滴度，但需要10μg sarna才能获得这样的结果。
[0276]
实施例6：用lnp配制的sa-rna-s-rbd免疫在小鼠体内中和野生型sars-cov-2感染
[0277]
为了评估通过加强免疫产生的特异性sars-cov-2抗体中和野生型sars-cov-2病毒感染的能力，进行了野生型病毒中和试验(wtvnt)(使用武汉sars-cov-2株)。
[0278]
将培养基中的血清稀释液与3xtcid100的sars-cov-2一起温育，并将样品-病毒混合物添加到含有vero细胞的96孔板的细胞悬浮液中。在5天的温育期后，评估每个孔的细胞病变效应(cpe)，并在显微镜下对病毒生长进行阴性或阳性评分。使用reed-muench方法计算将感染细胞数减少50％(nt
50
)或90％(nt
90
)的中和滴度(nt)。
[0279]
虽然在单独接种lnp配制的sa-rna-n的小鼠中可以观察到中和抗体，但在这些组
中仅达到与对照小鼠相似的nt
50
滴度(》50)。相比之下，对于接种lnp配制的sa-rna-s-rbd和联合sa-rna-s-rbd+sa-rna-n的小鼠，观察到高效的病毒中和，平均nt
50
滴度分别达到4.8
×
103和4.9
×
103。每个接种组的平均nt
90
滴度分别达到3.5
×
103和2.4
×
103的值。该评估的结果如图10所示。
[0280]
应谨慎解读上述结果。事实上，错误的解读可能表明，将lnp配制的sa-rna-n添加到疫苗制剂中(除了lnp配制的sa-rna-s-rbd之外)在预防sars-cov-2方面没有任何益处，因为nt50和nt90滴度在s-rba和s-rbd+n疫苗组之间没有显著差异。事实上，这一观察结果源于野生型vnt测定的实验设计的局限性。在这类测定中，将接种疫苗的小鼠的血清稀释液与sars-cov-2共同温育一定量的时间，然后将该混合物添加到平板接种了细胞的96孔板中温育5天。然后，计算能够将感染孔数减少50％(nt
50
)或90％(nt90)的样品稀释度。血清样品含有s特异性和n特异性结合抗体，如elisa所观察到的(参见图6-9)。然而，只有s特异性抗体能够结合(并因此中和)sars-cov-2，因为s抗原位于病毒颗粒的表面，而n抗原隐藏在内部核衣壳中。因此，与s-rbd sarna疫苗相比，s-rbd+n sarna疫苗实际上无法达到更高的nt
50
/nt
90
水平。
[0281]
此外，已提出两种sarna构建体的细胞掺入可能导致复制竞争，因为由于复制酶复合物的优先复制，一种构建体将胜过另一种构建体(wroblewska等，2015)。这可能会扰乱或阻碍抗原的个体免疫作用，因为两种抗原中的一种将更少被表达。因此，s-rbd+n sarna候选疫苗能够诱导与s-rbd sarna疫苗一样高(而不是更低，因为没有相互显著性差异)的中和抗体响应(图10)这一事实是很有前景的。
[0282]
相比之下，传统rna或sarna制造商公布的数据均无法达到与本文公开的联合疫苗候选物(4.9
×
103)一样高的nt
50
滴度。具体而言，vogel等(2020)仅用1μg的所描述的疫苗对balb/c小鼠进行初免疫苗接种，诱导的nt50特异性滴度低于102。同样，在nhp中使用30μg相同疫苗的初免和加强疫苗接种只能诱导至多约9.62
×
102的nt
50
滴度。另一方面，corbett等(2020)描述的1μg mrna构建体在3种不同小鼠品系的初免和加强疫苗接种后诱导的nt
50
水平在89至1119之间。
[0283]
用各种其他sa-rna疫苗候选物获得了类似的结果。dealwis等(2020)报告了使用2μg sarna(wtvnt)进行初免疫苗接种的nt
50
滴度为320。另一方面，gritstone oncology报道了使用10μg sarna进行初免疫苗接种的nt
50
滴度为1910(参见https://ir.gritstoneoncology.com/static-files/6a7c26ca-06a6-4295-bf76-83948a341397)。同样对于使用1μg sa-rna的初免-加强疫苗接种，mckay等(2020)和erasmus等(2020)报告的nt
50
滴度分别为2560和320。
[0284]
实施例7：用lnp配制的sa-rna-s-rbd和sa-rna-n联合免疫在仓鼠中引发针对体内野生型sars-cov-2感染的保护
[0285]
在鼻内sg仓鼠激发实验中评估了sa-rna-s-rbd+sa-rna-n联合疫苗接种对抗sars-cov-2的体内功效。
[0286]
实验按照sanchez-felipe等(2021)的描述进行。简言之，将6至8周龄雌性sg仓鼠(体重90g至120g)贴上耳标并随机分配到不同的治疗组，同时饲养在单独通风的笼中。在第0天，仓鼠被抽血以确定抗原特异性结合(iifa；总igg)和中和(伪型病毒血清中和试验-psvnt)抗体滴度。每只动物还接受了肌肉内(大腿肌肉)注射(每条腿100μl)三种不同剂量
(0.1μg，1μg和5μg)的包含lnp配制的sa-rna-s-rbd+sa-rna-n的联合疫苗(如上所述)。对照组注射相同量的荧光素酶-sarna或假手术pbs/lnp稀释剂。每种实验条件处理6只动物，总共30只动物。
[0287]
在第21天，再次采集血液(加强前)，仓鼠接受第二次im(大腿肌肉)注射(加强)，使用三种不同剂量的联合疫苗或荧光素酶sarna或假手术/pbs/lnp稀释剂(n＝6/情形)。
[0288]
在第35天，采血样并用sars-cov-2(武汉sars-cov-2毒株，第3次传代，10e4tcid50/ml的veroe6-生长betacov/比利时/ghb-03021/2020)鼻内感染仓鼠。简言之，通过腹膜内注射甲苯噻嗪、氯胺酮和阿托品溶液麻醉仓鼠。通过在两个鼻孔中加入50μl病毒原液液滴，对每只仓鼠进行鼻内接种。在实践中，&150cm
2 vero细胞培养瓶以1/1000的最终稀释度感染了之前的低传代sars-cov-2原液[betacov/比利时/ghb-03021/2020]。第3天，在cpe感染后，收集含有病毒的上清液，等分并储存在-80℃。感染性病毒载量通过噬菌斑测定来确定。
[0289]
此外在第35天和激发前，对接种1μg和5μg s-rbd+n sarna的仓鼠观察到有效的假病毒中和(武汉sars-cov-2毒株)，平均nt
50
中和滴度分别达到5.4
×
102和9.2
×
102。结果如图14所示。
[0290]
激发后，每天给仓鼠称重并每天监测疾病迹象(嗜睡、呼吸沉重或皮毛皱褶)、活动能力、自我维护和人道终点(后肢麻痹、驼背、眼睛发酸(souring))。
[0291]
在第39天，即激发后4天，通过腹膜内施用500μl dolethal(200mg/ml戊巴比妥钠)对动物施安乐死，以收集血清和肺。收获肺用于(i)通过实时定量pcr(rt-qpcr)量化病毒载量，(ii)通过过滤量化感染性病毒含量，(iii)组织学检查，和(iv)肺中的细胞因子分析(il-6,ip-10)。收集血液并储存血清用于进一步分析。
[0292]
初免施用后五周(即加强后两周)，仓鼠鼻内感染了野生型sars-cov-2(武汉毒株)。激发后，仓鼠在处死前每天称重。接种疫苗的仓鼠的体重仍然高于那些假手术或载剂处理的动物(图11)。
[0293]
传染性病毒含量被量化并报告为每毫克肺组织的sars-cov-2rna基因组拷贝数(图12)。此外，确定50％组织培养感染剂量(tcid50)作为感染病毒滴度的量度。该终点稀释测定量化了在接种仓鼠血清的50％细胞中产生细胞病变效应所需的病毒量(图13)。对于这两种测定，在接种0.1μg s-rbd+n sarna后观察到较低的病毒载量，并且在接种1μg和5μg s-rbd+n sarna联合疫苗后病毒显著减少。
[0294]
处死后(激发后)，通过rt-qpcr分析肺组织中的细胞因子和趋化因子mrna表达。在接种1μg和5μg s-rbd+n疫苗的仓鼠肺组织中，与模拟接种对照组相比，对于il-6在0.1μg和1μg剂量条件下和对于il-10在1μg和5μg剂量条件下，il-6和ip-10(cxcl10)的mrna表达水平降低(参见图15和16)。这非常重要，因为巨噬细胞产生的il-6细胞因子在covid-19患者中升高，从而诱导促炎响应。同样，趋化因子ip10也与covid-19感染患者的有害细胞因子风暴有关。
[0295]
处死后(激发后)，取出肺组织进行组织病理学分析，以评估疫苗接种对肺部疾病严重程度的影响(图17)。基于肺泡损伤(水肿和出血)、支气管壁中凋亡小体的存在和坏死性细支气管炎、血管周围水肿和炎症、支气管周围炎症、内皮炎、支气管肺炎和受累肺的百分比计算肺组织病理学总分。激发后，未接种疫苗和模拟(以及0.1μg)接种疫苗的仓鼠肺部
病变恶化。这通过采用1μg和5μg初免-加强剂量方案的sa-rna-s-rbd+sa-rna-n(zip1642)疫苗接种得以预防。
[0296]
通过血清elisa测量总结合igg抗体响应，以评估用zip1642初免和加强疫苗接种后体液免疫的诱导。使用1μg和5μg s-rbd+n sarna的初免和加强免疫均显著诱导了sars-cov-2特异性结合抗体(图18)。
[0297]
实施例8：用lnp配制的sa-rna-s-rbd和sa-rna-n联合免疫在小鼠中引发t细胞和细胞因子响应
[0298]
针对sars-cov-2的体液免疫响应可能会受到sars-cov-2特异性t细胞免疫的影响，这可能会在covid-19患者的康复过程中产生保护或破坏作用，这取决于动员的t细胞的性质。活化的cd4+t细胞对于b细胞活化和抗体产生至关重要，并且可以根据它们的细胞因子产生分为功能性亚群。最近的研究表明，th1 cd4+t细胞响应与有效解决sars-cov-2感染有关，而cd4+th2细胞的诱导与免疫病理学有关。此外，已经证明，当在没有th2响应的情况下发生cd4+th1响应时，通常不会观察到疫苗相关的增强型呼吸系统疾病(vaerd)。因此，疫苗接种策略应引发针对sars-cov-2的th1偏向cd4+t细胞免疫。
[0299]
在加强疫苗接种后，与单独针对s-rbd抗原的免疫相比，联合抗原s-rbd+nsarna(zip1642)免疫能够诱导更优的cd4+th1偏向s特异性t细胞响应。此外，预期会诱导cd8+ctl响应。这种cd8+ctl响应最近被认为在轻型covid-19疾病中发挥保护作用。两种cmi响应都预计会在没有长期细胞因子表达的情况下发生。
[0300]
进行cd8+ctl毒性测定。流式细胞术实验基于细胞计数证明了cd8+ctl响应的诱导。t细胞功能测定证明了这些cd8+细胞的细胞毒性潜力(以及有效性)。s特异性t细胞响应如图20所示。
[0301]
总结来说，
[0302]
流式细胞术和功能测定表明，cd8+ctl响应对sars-cov-2感染具有功能性。
[0303]
细胞因子响应是诱导非特异性先天免疫的指标。接种疫苗后，高细胞因子响应会导致副作用，例如发烧和肌肉疼痛。优选对这些进行限制。初步数据(未公开)表明接种疫苗后细胞因子水平降低。
[0304]
最后，接种疫苗的小鼠的igg2/igg1比率更高，表明优选的th1偏向响应。il-4调节b细胞分泌igg1抗体，而干扰素-γ刺激igg2a抗体的表达，因此使任一同种型成为小鼠中潜在th2(il-4)或th1(ifnγ)响应的指标。
[0305]
总结来说，接种疫苗的小鼠的结果显示出有效的响应，并表明可以长期保护免受sars-cov-2感染。
[0306]
实施例9：基于veev的sarna平台
[0307]
图19显示了在本发明的上下文中使用的载体的可能实施方式以及可用于生产特定rna疫苗的两条自扩增rna链的组合。sars-cov-2受体结合域与携带tc-83毒株基因组的c3d-p28.6融合，用作复制子主链以驱动自扩增rna表达(图19)。常规和自扩增性mrna共享基本原件，包括帽、5’utr、3’utr和可变长度的poly(a)尾部。自扩增性rna(sarna)还编码源自甲病毒基因组的四种非结构蛋白(nsp1
–
4)和亚基因组启动子(sgp)。nsp1-4编码负责扩增sarna的复制酶，使剂量可以低于非复制性mrna。上述主链还可包含5’帽(例如7mg(5’)ppp(5’)nlmpnp)。根据本发明的主链优选包含5’utr中的a3g突变和/或非结构蛋白2(nsp2)
中的q739l突变。在sgp启动子之后克隆编码刺突蛋白抗原的序列，其中刺突蛋白抗原是包含受体结合域(rbd)的刺突蛋白的截短形式。或者，在sgp启动子之后克隆编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原的序列。递送到细胞质后，sarna的翻译产生非结构蛋白1-4(nsp1-4)，其形成rna依赖性rna聚合酶(rdrp)。rdrp负责sarna的复制，产生sarna的拷贝。因此，从最初递送的每个sarna中产生了多个亚基因组rna拷贝。与非扩增性rna相比，这会导致翻译更多的抗原拷贝。用于产生rna的载体同样如图19所示。所述载体优选包含抗原，其中所述抗原序列编码sars-cov-2刺突蛋白或其截短形式，或其中所述抗原序列编码sars-cov-2核衣壳(n)抗原，并且其中所述抗原位于启动子序列、优选甲病毒衍生的亚基因组启动子(sgp)的下游。
[0308]
所述载体进一步包含所述抗原序列下游的poly(a)序列；和编码委内瑞拉马脑炎病毒非结构蛋白nsp1至4的序列。优选地，nsp2的序列使得其编码在5’utr中具有a3g突变和/或q739l突变的nsp2蛋白。
[0309]
所述载体还可以包含复制起点和启动子序列，例如t7或sp6启动子。出于在表达系统中产生载体的目的，载体可以包含选择基因，例如编码抗生素的选择基因。
[0310]
载体可以是质粒dna或线性化dna。为此目的，质粒可包含允许所述质粒线性化的限制酶(re)位点。
[0311]
实施例10：根据本发明的实施方式的载体和构建体
[0312]
图19显示了在本发明的上下文中使用的载体的可能实施方式的示意图，以及可用于生产特定rnasars-cov-2疫苗的自扩增性rna链。该疫苗允许使用与多个鉴定变体相关的几种sars-cov-2抗原进行免疫。因此，获得了更有效和更好的针对疾病的保护。
[0313]
rna链可以通过诸如质粒等dna载体来产生。所述载体可以配备常规调节区，例如用于允许复制的复制起点，例如在原核细胞体系中。该载体可以进一步提供编码允许选择的蛋白质的核苷酸序列，例如编码抗性基因的序列。可以进一步为载体提供限制酶位点，以用于克隆目的和允许载体线性化。可以存在诸如t7(或sp6，未显示)的启动子区域以允许体外rna转录。
[0314]
在图19给出的实例中，并且在t7启动子下游，载体以5’到3’的顺序包含：(i)5’utr序列，(ii)编码委内瑞拉马脑炎病毒、非结构蛋白质nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的核苷酸序列，(iii)sgp启动子区域，其可操作地与编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原的核酸序列或编码包含rbd区域的(截短的)sars-cov-2刺突蛋白抗原连接，(iv)3’utr和(v)poly-a束。
[0315]
如图19所示的载体用于mrna链的体外转录。所述mrna链在其5’utr处加帽并进一步包含(按5’至3’的顺序)：
[0316]-5’utr；
[0317]-编码委内瑞拉马脑炎病毒、非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的序列；
[0318]-亚基因组启动子区域
[0319]-编码sars-cov-2抗原的序列
[0320]-3’utr
[0321]-poly-a束
[0322]
将多个这些mrna链配制成疫苗，并可通过常规途径递送给受试者。一旦施用于所述受试者，并在原位翻译后，nsp1-4蛋白将形成rna依赖性rna聚合酶(rdrp)复合物，该复合
物随即将开始从mrna中的sgp区域扩增mrna转录物。后者从最初递送的每个sarna产生多个亚基因组rna拷贝。
[0323]
亚基因组rna转录物(5)将在其5’区域被复制酶中存在的加帽活性加帽。转录物中存在的n蛋白或s蛋白的编码序列将被翻译，导致细胞中产生n或s抗原。

技术特征：
1.一种组合，所述组合包含编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列和编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原的序列，其中，所述编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列和所述编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原的序列包含在一种或多种自复制性rna分子中，并且其中所述一种或多种自复制性rna分子还包含编码非结构性甲病毒蛋白的序列。2.根据权利要求1所述的组合，其中，所述编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列和所述编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原的序列包含在相同的自复制性rna分子中，或者其中所述编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列和所述编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原的序列包含在不同的自复制性rna分子中。3.根据权利要求1或2所述的组合，其中，所述甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒(veev)，例如tc-83毒株或与其具有至少90％序列同一性、优选至少95％序列同一性、更优选至少97％序列同一性的毒株。4.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中，所述一种或多种自复制性rna分子包含5’utr中的a3g突变和/或非结构蛋白2(nsp2)中的q739l突变。5.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中，所述刺突蛋白抗原是包含受体结合域(rbd)的刺突蛋白的截短形式。6.根据权利要求5所述的组合，其中，所述rbd对应于seq id no：1或与其具有至少95％同一性、优选至少97％序列同一性、更优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。7.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中，所述一种或多种自复制性rna分子包含veev tc-83毒株的非结构蛋白、5’utr中的a3g突变和nsp2中的q739l突变。8.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中，所述编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列包含：5’帽，随后的编码非结构性甲病毒蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的序列，亚基因组启动子以及随后的编码sars-cov-2刺突蛋白抗原或包含受体结合域(rbd)的刺突蛋白的截短形式的序列，以及处于所述sars-cov-2刺突蛋白抗原或截短形式的下游的poly-a尾部。9.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中，所述编码sars-cov-2核衣壳蛋白(n)抗原的序列包含：5’帽，随后的编码非结构性甲病毒蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的序列，亚基因组启动子以及随后的编码sars-cov-2n蛋白抗原的序列，以及处于所述sars-cov-2n蛋白抗原的下游的poly-a尾部。10.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据前述权利要求中任一项所述的组合以及药学上可接受的载体和/或药学上可接受的载剂。11.根据权利要求10所述的药物组合物，所述药物组合物还包含至少一种佐剂。12.根据权利要求10或11所述的药物组合物，所述药物组合物还包含阳离子脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、脂质卷、病毒体、免疫刺激复合物、微粒、微球、纳米球、单层囊泡、多层囊泡、水包油乳液、油包水乳液、乳化体、多阳离子肽或阳离子纳米乳液。13.根据权利要求10至12中任一项所述的药物组合物，其中，所述一种或多种自复制性rna分子被包封在阳离子脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、脂质卷、病毒体、免疫刺激复合物、微粒、微球、纳米球、单层囊泡、多层囊泡、水包油乳液、油包水乳液、乳化体、多阳离子肽、阳离子纳米乳液和它们的组合中，或者与其结合，或者吸附于其上。14.一种疫苗，所述疫苗包含根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中，所述rna分
子被包封在阳离子脂质、脂质纳米颗粒、脂质体、脂质卷、病毒体、免疫刺激复合物、微粒、微球、纳米球、单层囊泡、多层囊泡、水包油乳液、油包水乳液、乳化体、多阳离子肽、阳离子纳米乳液和它们的组合中，或者与其结合，或者吸附于其上；并且其中所述疫苗中的所述rna的有效剂量为0.1μg至100μg。15.权利要求1至9中任一项所述的组合或权利要求10至13中任一项所述的药物组合物或权利要求14所述的疫苗，其用作药物。16.权利要求1至9中任一项所述的组合或权利要求10至13中任一项所述的药物组合物或权利要求14所述的疫苗，其用于预防和/或治疗传染性疾病。17.权利要求1至9中任一项所述的组合或权利要求10至13中任一项所述的药物组合物或根据权利要求14所述应用的疫苗，其用于在受试者中诱导免疫响应。18.权利要求1至9中任一项所述的组合或权利要求10至13中任一项所述的药物组合物或根据权利要求14所述的疫苗，其用于为受试者接种疫苗以抵抗冠状病毒疾病，例如sars-cov、sars-cov-2或mers-cov。19.根据权利要求15至18中任一项所述应用的组合、药物组合物或疫苗，其中，所述rna的有效剂量为0.1μg至100μg。20.根据权利要求15至19中任一项所述应用的组合、药物组合物或疫苗，其中，所述组合、组合物或疫苗通过肌内、皮内或皮下施用。21.根据权利要求15至20中任一项所述应用的组合、药物组合物或疫苗，其中，所述组合、组合物或疫苗作为单剂量或多剂量施用，需要将两次以上的剂量连续地在预先限定的时间跨度内施用。22.根据权利要求15至21中任一项所述应用的组合、药物组合物或疫苗，其中，定期施用所述组合、药物组合物或疫苗，例如每年或每半年施用。23.根据前述权利要求中任一项所述应用的组合、药物组合物或疫苗，其中，所述疫苗的剂量为0.05ml至1ml。24.一种包含自复制性rna分子的冠状病毒疫苗，所述每个自复制性rna分子包含编码非结构性甲病毒蛋白的序列和编码sars-cov-2刺突蛋白抗原的序列，其中，所述rna分子被包封在阳离子脂质、脂质纳米颗粒、脂质体、脂质卷(cochleate)、病毒体、免疫刺激复合物、微粒、微球、纳米球、单层囊泡、多层囊泡、水包油乳液、油包水乳液、乳化体、多阳离子肽、阳离子纳米乳液和它们的组合中，或者与其结合，或者吸附于其上。25.根据权利要求24所述的疫苗，其中，所述甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒(veev)，例如tc-83毒株或与其具有至少90％序列同一性、优选至少95％序列同一性、更优选至少97％序列同一性的毒株。26.根据权利要求24或25所述的疫苗，所述疫苗包含5’utr中的a3g突变和/或非结构蛋白2(nsp2)中的q739l突变。27.根据前述权利要求24至26中任一项所述的疫苗，其中，所述刺突蛋白抗原是包含受体结合域(rbd)的刺突蛋白的截短形式，其中所述rbd对应于seq id no：1或与其具有至少95％同一性、优选至少97％序列同一性、更优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。28.根据前述权利要求24至27中任一项所述的疫苗，其中，所述刺突蛋白融合至免疫刺激蛋白，例如c3d-p28。
29.根据前述权利要求24至28中任一项所述的疫苗，所述疫苗还包含编码sars-cov-2核衣壳蛋白抗原和/或sars-cov-2膜蛋白抗原的序列。30.根据前述权利要求24至29中任一项所述的疫苗，所述疫苗包含veev tc-83毒株的非结构蛋白、5’utr中的a3g突变和nsp2中的q739l突变，以及编码包含rbd的sars-cov-2刺突蛋白的截短形式的25序列。31.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中每个所述自扩增性rna分子包含：5’帽，随后的编码非结构性甲病毒蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的序列，亚基因组启动子以及随后的编码sars-cov-2刺突蛋白抗原或包含受体结合域(rbd)的刺突蛋白的截短形式的序列，以及处于所述sars-cov-2刺突蛋白抗原或截短形式的下游的poly-a尾部。32.根据前述权利要求24至31中任一项所述的疫苗，其中，所述疫苗在被施用于受试者、优选人类受试者时能够在所述受试者中引发或诱导针对sars-cov-2和/或其变体的免疫响应。33.根据前述权利要求24至32中任一项所述的疫苗，其中，所述疫苗被配制成使得所述疫苗的一个剂量包含0.1μg至100μg的rna。34.根据前述权利要求24至33中任一项所述的疫苗，其中，所述疫苗的剂量为0.05ml至1ml。35.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，所述疫苗还包含佐剂。36.一种治疗或预防冠状病毒感染、优选sars-cov-2感染的方法，所述方法包括对受试者、优选人类受试者施用权利要求1至9中任一项所述的组合、权利要求10至13中任一项所述的药物组合物或权利要求14至35中任一项所述的疫苗。37.一种在受试者中诱导针对冠状病毒感染、优选sars-cov-2感染的免疫响应的方法，所述方法包括对受试者、优选人类受试者施用权利要求1至9中任一项所述的组合、权利要求10至13中任一项所述的药物组合物或权利要求14至35中任一项所述的疫苗。38.根据权利要求36或37所述的方法，其中，通过皮下、肌内或皮内注射将所述组合、药物组合物或疫苗施用于所述受试者。39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，施用的剂量包含0.1μg至100μg rna。40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述组合、药物组合物或疫苗作为单剂量或多剂量施用，需要将两次以上的剂量连续地在预先限定的时间跨度内施用。41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，定期施用所述组合、组合物或疫苗，例如每年或每半年施用。42.一种载体，所述载体包括：-抗原序列，其中所述抗原序列编码sars-cov-2的抗原，并且其中所述抗原位于启动子序列、优选地甲病毒衍生的亚基因组启动子(sgp)的下游；-处于所述抗原序列的下游的poly(a)序列；和-编码委内瑞拉马脑炎病毒的非结构蛋白nsp1至nsp4的序列。43.根据权利要求42所述的载体，其中，所述抗原序列编码sars-cov-2刺突蛋白或其截短形式，或者其中所述抗原序列编码sars-cov-2核衣壳蛋白(n)抗原。44.根据权利要求42和43所述的载体，其中，所述刺突蛋白的截短形式包含受体结合域
(rbd)。45.根据前述权利要求中任一项所述的载体，其中，nsp2的序列使得其编码具有q739l突变的nsp2蛋白和/或在所述载体的5’utr中的a3g突变。46.根据前述权利要求中任一项所述的载体，其中，所述载体是质粒或线性化dna。

技术总结
本发明涉及自复制性RNA分子，其包含编码非结构性甲病毒蛋白的序列和编码SARS-CoV-2蛋白抗原的序列。蛋白抗原的序列。


技术研发人员：I
受保护的技术使用者：纪费亚斯疫苗公司
技术研发日：2021.06.18
技术公布日：2023/7/7