用于通过基因疗法治疗诸如阿尔茨海默病的Tau蛋白病的病毒颗粒的制作方法

用于通过基因疗法治疗诸如阿尔茨海默病的tau蛋白病的病毒颗粒
技术领域
1.本公开内容涉及用于通过基因疗法治疗tau蛋白病特别是阿尔茨海默病的病毒颗粒。更具体而言，本发明涉及用于通过基因疗法治疗有需要的受试者的tau蛋白病的病毒颗粒，所述病毒颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因。


背景技术：

2.神经退行性疾病是以错误折叠蛋白的病理聚集作为特征的持续性脑部失调的异质性群组，目前被总体上视为神经退行性蛋白质病(neurodegenerative proteinopathy)。神经退行性疾病可概括地被分类成两种主要群组，即突触核蛋白病和tau蛋白病，其随着在这些疾病中通常发现的蛋白质聚集体的类型而变化(参见下方表1)。
3.表1：典型的蛋白质病的实例
[0004][0005]
改编自：bayer t.a..european neuropsychopharmacology(2015)25,713
–
724
[0006]
除了α-突触核蛋白和tau蛋白，代表神经退行性疾病的主要神经病理标志的蛋白聚集体也被针对亨廷顿舞蹈症(亨廷顿蛋白质聚集体)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als；泛素聚集体)进行描述。值得注意的是，这些疾病大多有两个共同特征：第一，初始的退化性损伤限于大脑的具体区域，例如帕金森氏症(pd)中的黑质致密部和当考虑阿尔茨海默病(ad)时迈纳特基底核、蓝斑和内嗅皮质。随着病情发展，蛋白质聚集体(pd中的α-突触核蛋白，ad中的tau蛋白)通过利用皮质回路以“朊蛋白样”方式散布到更广泛的脑部区域中，最终导致整个大脑更广泛的蛋白质病，为通常以神经退行性疾病为特征的症状和体征的临床进展奠定了基础。尽管目前tau蛋白聚集促进神经元死亡的最终机制仍有待充分表征，神经元死亡大致上被视作一种两步骤现象，初始由神经纤维缠结形式的tau蛋白的细胞内聚集而引发，
随后是小神经胶质细胞的活化。活化的小神经胶质细胞释放促炎性细胞因子，进一步提升并持续神经元死亡。换句话说，当要设计任何潜在疾病改善治疗时，要实行的方法需要同时靶向两个并行过程，即有效清除错误折叠的tau蛋白，同时减弱小神经胶质细胞驱使的促炎性现象。
[0007]
除了极少比例的家族性病例，ad和其相关的tau蛋白病在很大程度上被视为偶发性疾病，意味着它们是随机发生的并且不能归因于遗传原因。对于偶发性ad，已描述了遗传敏感性，特别是关于已经在偶发性ad病例的显著比例中被描述的apoe4等位基因的遗传。估计大约有0.1％的ad病例是体染色体显性遗传的家族性形式，其可以归因于编码淀粉样前体蛋白(app)和早老素-1和2的基因的突变。神经元在错误折叠的tau蛋白的进行性细胞内聚集时死亡，这些聚集体是已知的神经纤维缠结。ad中的神经纤维缠结分布由braak分期(braak and braak,acta neuropathol 1991；82:239-259)定义。对于i期和ii期，神经纤维缠结限于离散的脑部区域，例如基底前脑和内嗅皮质。边缘区域在iii期和iv期开始参与，而v期和vi期有更大规模的新皮质病理。尽管ad的成因很大程度上仍是未知的(例如ad被视为特发性疾病)，已经考虑了引起事件的疾病级联的两个主要假说，即淀粉样蛋白假说和tau蛋白假说。淀粉样蛋白假说假定细胞外淀粉样蛋白斑块(由β淀粉样蛋白的聚集体形成)的存在是ad的主要病理特征。此假说受到apoe4等位基因是最熟知的遗传风险因子的事实所支持，并且事实上apoe4等位基因在分解β淀粉样蛋白方面效率不高。相较之下，tau蛋白假说提议具有神经纤维缠结形式的过度磷酸化tau蛋白的病理性聚集是该疾病的主要病因，其造成神经元传输机制的损害并最终引起神经元死亡。其中神经纤维缠结最先变得明显的脑部区域之一是迈纳特基底核(由胆碱能神经元构成的脑部区域)的事实提供了对tau蛋白假说的支持。众所周知的是，在ad中存在胆碱能神经传递的减少，并且在ad早期使用乙酰胆碱酯酶抑制剂确实具有一些有益的医学效果。
[0008]
目前，ad的一般可用的药物治疗展现轻微的症状缓解效果并且大部分被认为本质上仅仅是姑息治疗。因此，主要未满足的医疗需求是开发用于ad和相关的tau蛋白病的改变疾病的策略，目的是减缓或甚至理想情况下阻止这些破坏性的大脑疾病的持续性进展过程。一种理想的候选物必须是能够进行展现神经保护效果的tau蛋白聚集体的有效清除并且最终阻碍tau蛋白的跨神经元通道的方法(朊蛋白样散布；maxan and cicchetti,j exp neurosci 2018；12:1-4)。
[0009]
考虑tau蛋白病以外的神经退行性疾病，例如以错误折叠的α-突触核蛋白的细胞内聚集作为特征的那些，例如帕金森氏症(pd)和路易氏体型痴呆(dlb)，最近已表征了编码被称作葡萄糖脑苷脂酶(gcase)的溶酶体酶的gba1基因中的纯合和杂合突变两者均在数值上代表pd和dlb的主要遗传风险因子。gba1突变造成溶酶体中葡萄糖脑苷脂酶的活性丧失，最终经由某些未知机制引发α-突触核蛋白的病理性聚集。关于偶发性ad，gba1突变在造成错误折叠的tau蛋白的病理性聚集的机制中的潜在参与仍未阐明。
[0010]
作为溶酶体酶，葡萄糖脑苷脂酶泛在地在整个大脑中表达，尽管近期已经在猕猴(macaque)中鉴定了其中神经元展现出丰富的葡萄糖脑苷酶含量许多脑部区域(dopeso-reyes等人,2018)。
[0011]
us2015/0284472报告了防止哺乳动物的神经元功能丧失的方法，包括施用治疗上有效剂量的增加葡萄糖脑苷酶活性的药剂。
[0012]
当考虑针对ad和相关的tau蛋白病使用aav实行改变疾病的疗法时，为了适当地达到需要的终点，仍然需要提供满足数个主要目标的疗法：
[0013]-基于aav的基因疗法诱导神经元中tau蛋白清除的原理证明，
[0014]-tau蛋白负荷的减少发挥神经保护效果的证明。
[0015]
概述
[0016]
本发明提供逆向运输的病毒颗粒，用于基因疗法以用于在疾病末期治疗患者的阿尔茨海默病和相关的tau蛋白病，其中tau蛋白病遍布于整个大脑，特别是当蔓延至大脑皮质时。目前的治疗策略符合上述需求，尤其是鉴于在偶发性阿尔茨海默病的小鼠模型中获得的结果；以及利用经修饰以进一步增强给定编码的转基因的逆向传播的aav衣壳。
[0017]
在第一方面中，本公开内容涉及病毒颗粒以及它在有需要的受试者中通过基因疗法治疗tau蛋白病的用途，所述病毒颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因。
[0018]
在一个实施方案中，所述转基因包含人葡萄糖脑苷脂酶的编码序列，其选自seq id no：5、6、8、17和18，通常所述转基因包含选自seq id no：1、7、11、12和19的序列。
[0019]
在具体的实施方案中，所述核酸构建体还包含可操作地连接至编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因的启动子，并且其中所述启动子允许至少在黑质致密部(snc)的神经细胞和小神经胶质细胞中的所述转基因的表达；和优选地也允许其他脑部区域的神经细胞的所述转基因的表达，其他脑部区域至少包括黑质致密部、大脑皮质、杏仁核和丘脑的尾状板内侧核。通常，所述核酸构建体可包含在泛在启动子的控制下的编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因，泛在启动子例如是gusb启动子尤其是seq id no：2或20的启动子、seq id no：9或21的cag启动子或是seq id no：13的人突触蛋白1启动子(hsyn)。
[0020]
在具体的实施方案中，所述病毒颗粒选自至少同时靶向神经元和神经胶质细胞的病毒血清型，优选位于大脑皮质和亚细胞结构例如迈纳特基底核、黑质致密部、蓝斑、海马结构和内嗅皮质中的神经元和神经胶质细胞。在更具体的实施方案中，所述病毒颗粒至少同时靶向神经元和小神经胶质细胞。更具体而言，所述病毒颗粒可选自至少同时靶向黑质致密部中多巴胺能神经元和小神经胶质细胞的病毒颗粒。
[0021]
在某些实施方案中，所述病毒颗粒选自raav颗粒，优选地包括选自aav2、aav5、aav9、aav-mnm004、aav-mnm008和aav tt血清型的衣壳蛋白。
[0022]
在更具体的实施方案中，所述病毒颗粒包含aav tt衣壳蛋白，优选地aav tt衣壳蛋白包含seq id no：14的序列，或与seq id no：14具有至少98.5％同一性，优选99％或99.5％同一性的序列。
[0023]
在某些实施方案中，所述病毒颗粒包含选自逆向运输的病毒变异血清型(aavretro)的病毒衣壳蛋白。
[0024]
通常，所述aavretro能够逆向散布于大脑皮质中，优选地在非人灵长类的尾状核或壳核中的脑实质内注射之后至少散布于黑质致密部和大脑皮质，如在体内散布测定中确定的。有利地，注射至非人灵长类的尾状壳核中的aavretro也能够逆向散布于神经支配尾状壳核的其他脑部区域，至少包括黑质致密部、大脑皮质、杏仁核和丘脑的尾状板内侧核。
[0025]
另一方面，本公开内容涉及包括以下步骤的体内散布测定：
[0026]
a)将包含编码gfp(绿色荧光蛋白)的转基因的测试raav(raav-gfp)通过所述
raav-gfp的脑实质内注射的方式注射至非人灵长类的连合后壳核中，以及
[0027]
b)在注射后一个月，计算大脑皮质中表达gfp的神经元的数量，优选地在神经支配尾状壳核的脑部区域中表达gfp的神经元的数量，更具体地至少在黑质致密部、大脑皮质、杏仁核和丘脑的尾状板内侧核中表达gfp的神经元的数量。
[0028]
在其他实施方案中，所述体内散布测定还包括步骤c)：将大脑皮质中优选神经支配尾状核壳的脑部区域中被标记的神经元的百分比与用aav-tt-gfp进行的对照实验进行比较。
[0029]
在某些实施方案中，根据本公开内容的病毒颗粒有利地选自能够散布于大脑皮质中的aavretro颗粒，优选至少能够散布至黑质致密部和大脑皮质，并且至少达到与在前述体内散布测定所确定的aav-tt相同的水平。
[0030]
在具体的实施方案中，所述aavretro衣壳蛋白选自以下变异血清型：aav-mnm004、aav-mnm008和aav-tt。
[0031]
在更具体的实施方案中，所述aavretro颗粒包含aav tt血清型衣壳蛋白，优选包含seq id no：14的序列，或与seq id no：14具有至少98.5％同一性，优选99％或99.5％同一性的序列。
[0032]
在具体的实施方案中，所述病毒颗粒的核酸构建体还包含多腺苷酸化信号序列，尤其是seq id no：3的多腺苷酸化信号序列。
[0033]
在具体的实施方案中，所述核酸构建体包含在病毒载体中，所述病毒载体还包含5’itr序列和3’itr序列，优选腺相关病毒的5’itr序列和3’itr序列，更优选来自aav2血清型的5’itr序列和3’itr序列，所述5’itr序列和3’itr序列包含seq id no：15和/或16的序列，或与seq id no：15和/或16具有至少80％或至少90％同一性的序列或由其组成。
[0034]
在具体的实施方案中，所述核酸构建体包含seq id no：4的核酸序列，或与seq id no：4具有至少80％或至少90％同一性的核酸序列。
[0035]
在具体的实施方案中，所述核酸构建体包含在启动子控制下的人葡萄糖脑苷脂酶的编码序列，所述启动子允许至少在多巴胺能神经元和小神经胶质细胞两者中人葡萄糖脑苷脂酶的表达，并且所述病毒颗粒选自至少靶向黑质致密部的多巴胺能神经元和小神经胶质细胞的病毒颗粒，通常是包含选自aav2、aav5、aav9、aav-mnm004、aav-mnm008和aav tt血清型的衣壳蛋白的腺相关病毒颗粒。
[0036]
另一方面，本公开内容涉及如上文所述的病毒颗粒在疗法中的用途，优选在有需要的受试者中通过基因疗法治疗tau蛋白病中的用途。在具体的实施方案中，所述tau蛋白病是人偶发性tau蛋白病。在更具体的实施方案中，所述tau蛋白病是阿尔茨海默病，通常是偶发性阿尔茨海默病。
[0037]
在其他实施方案中，所述tau蛋白病是阿尔茨海默病以外的临床实体，其包括但不限于进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、额颞叶痴呆和皮克病。
[0038]
在具体的实施方案中，所述病毒载体通过鞘内施用或脑实质内施用的方式施用至所述受试者，后者优选施用至例如大脑皮质和亚细胞结构的脑部区域，例如迈纳特基底核、黑质致密部、蓝斑、海马结构或内嗅皮质。
[0039]
所述病毒载体可优选地通过脑实质内施用的方式施用至所述受试者，更优选施用至黑质致密部、尾状壳核或海马结构的齿状回的脑部区域。
[0040]
附图的简要说明
[0041]
图1是aav-tt衣壳蛋白序列和aav-2的氨基酸序列比对。
[0042]
图2是aav-tt衣壳蛋白序列和aav-9的氨基酸序列比对。
[0043]
图3是小鼠中进行实验计划的示意图。
[0044]
图4是小鼠脑部冠状切面中tau蛋白的免疫组织化学检测，显示gcase增强对tau蛋白清除的效果。小鼠首先被双侧注射raav2/9-tau301l。4周后右侧纹状体接受raav2/9-gba1的脑实质内注射，而对照空病毒载体(raav2/9-空)注射至左侧纹状体内。递送raav2/9-gba1后4周处死动物(即注射raav2/9-tau301l后8周)。获得的初步数据表明病毒介导的gcase活性的增强诱使tau蛋白聚集体在右侧大脑皮质和纹状体两者(分别是第3个图和第4个图)中广泛清除，由此如左侧大脑皮质和纹状体两者(分别是第1个图和第2个图)中观察到的，对照载体对于tau蛋白病理没有展现任何效果。
[0045]
图5是显示在心室摄影辅助的立体定位手术中所有aav的注射位点的矢状rx切面。
[0046]
图6是显示出所有aav的注射位点的代表显微照片。
[0047]
图7是示出所有动物的注射位点的卡通图(a：m295和m296，b：m297和m298)。
[0048]
图8是在动物m295(a)和m296(b)(被注射aav-tt-gfp)中gfp+神经元的生物分布和估计强度。小尺寸的点(标注为“低”)表示1至200个gfp+细胞，中等尺寸的点(标注为“中等”)表示201至400个gfp+细胞，以及大尺寸的点(标注为“高”)表示超过401个gfp+细胞。
[0049]
图9是在动物m297(a)和m298(b)(被注射aav-9-gfp)中gfp+神经元的生物分布和估计强度。小尺寸的点(标注为“低”)表示1至200个gfp+细胞，中等尺寸的点(标注为“中等”)表示201至400个gfp+细胞，以及大尺寸的点(标注为“高”)表示超过401个gfp+细胞。
[0050]
图10是显示所有动物的gfp+神经元总数的定量直方图。
[0051]
图11是显示所有动物的多个感兴趣区域中的gfp+神经元数量的定量直方图。缩写说明：带状前回(acgg)、额上回(sfg)、中央前回(prg)、中央后回(pog)、岛叶回(ing)、中央中核-束旁核复合体(cm-pf)、黑质致密部(snc)。
[0052]
图12是显示所有动物的左半球的多个感兴趣区域中的gfp+神经元的喙尾轴生物分布的直方图。缩写说明：带状前回(acgg)、额上回(sfg)、中央前回(prg)、中央后回(pog)、岛叶回(ing)、中央中核-束旁核复合体(cm-pf)、黑质致密部(snc)。
[0053]
图13是显示所有动物的右半球的多个感兴趣区域中的gfp+神经元的喙尾轴生物分布的直方图。缩写说明：带状前回(acgg)、额上回(sfg)、中央前回(prg)、中央后回(pog)、黑质致密部(snc)。
[0054]
详述
[0055]
本发明人已鉴定通过基因疗法治疗tau蛋白病的新的治疗策略，并且更具体是阿尔茨海默病，特别是偶发性阿尔茨海默病。
[0056]
因此，本公开内容涉及一种病毒颗粒，以及其在有需要的受试者中通过基因疗法治疗tau蛋白病的用途，所述病毒颗粒包含病毒载体或含有编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因的核酸构建体。
[0057]
本文所使用的术语“病毒颗粒”涉及有传染性并且通常有复制缺陷的病毒颗粒，其包含(i)病毒载体和(ii)衣壳，其中病毒载体包装于衣壳中，并视情况而定包含(iii)围绕衣壳的脂质包膜。
[0058]
本文所使用的术语“病毒载体”通常是指如本文公开的病毒颗粒的核酸部分，其包装于衣壳中。
[0059]
所述病毒载体因此通常至少包含(i)核酸构建体，其包含转基因以及其在通过基因疗法治疗的宿主中表达所需的适当的核酸元件，以及(ii)全部或部分的病毒基因组，例如病毒基因组的至少反向末端重复序列。
[0060]
本文所使用的术语“核酸构建体”是指利用重组dna技术产生的非天然存在的核酸。特别地，核酸构建体是经修饰以包含核酸序列片段(其以自然界中不会存在的方式结合或相邻)的核酸分子。
[0061]
本文所使用的术语“转基因”是指编码在基因疗法中作为活性成分使用的基因产物的核酸分子、dna或cdna。基因产物可是rna、胜肽或蛋白质。
[0062]
术语“核酸”和“多核苷酸”或“核苷酸序列”可互换地使用并且指包含单体核苷酸或由其组成的任何分子。核酸可以是寡核苷酸或多核苷酸。核苷酸序列可以是dna或rna。核苷酸序列可经化学修饰或是人工的。核苷酸序列包含肽核酸(pna)、吗啉和锁核酸(lna)以及乙二醇核酸(gna)和苏糖核酸(tna)。这些序列各自通过分子主链的变化而不同于天然存在的dna或rna。此外，也可以使用硫代磷酸酯核苷酸。其它脱氧核苷酸类似物包括甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸脂、n3'p5'-氨基磷酸酯和寡核糖核苷酸硫代磷酸酯以及其2'-0-烯丙基类似物和2'-0-甲基核糖核苷酸甲基膦酸酯，它们可用于本发明的核苷酸。
[0063]
本文所使用的术语“反向末端重复序列(itr)”是指位于病毒的5’端的核苷酸序列(5’itr)和位于病毒的3’端的核苷酸序列(3’itr)，其包含回文序列并可折叠而形成t型发夹结构，其在dna复制的起始阶段作为引物。他们对于病毒基因组整合至宿主基因组中；对于从宿主基因组复原；以及对于将病毒核酸衣壳化到成熟病毒粒子中也是被需要的。对于载体基因组复制和其包装至病毒颗粒中顺式需要itr。
[0064]
本文所使用的术语“包含”不排除其他元件。为了本公开内容的目的，术语“由......所组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。
[0065]
本文所使用的术语“尤其”、“通常”或“特别”可互换地使用并且指在多个实施方案的中的任一个，术语“优选”是指优选实施方案。
[0066]
本文所使用的“snc”是黑质致密部(snc)的字首缩写。
[0067]
本公开内容的核酸构建体
[0068]
根据本公开内容的核酸构建体包含转基因以及用于其在通过使用本公开内容的病毒载体的基因疗法来治疗的所述宿主中表达的至少适当的核酸元件。
[0069]
举例来说，所述核酸构建体包含转基因，所述转基因由葡萄糖脑苷脂酶的编码序列以及在相关细胞类型或组织中表达此编码序列所需要的一个或多个控制序列组成。一般来说，核酸构建体包含编码序列，以及在编码序列之前的调控序列(5'非编码序列)和在编码序列之后的调控序列(3'非编码序列)，其对于所选的基因产物的表达是必需的。因此，在具体的实施方案中，所述核酸构建体至少包含(i)编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因、(ii)启动子和(iii)3'非翻译区，其中编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因处在启动子的控制下，并且非翻译区通常包含多腺苷酸化位置和/或转录终止子。核酸构建体也可包含其他调控元件，例如增强序列、内含子、微小rna靶向序列、有助于在载体中插入dna片段的多接头序列和/或剪接信号序列。
[0070]
具体的核酸构建体包含选自seq id no：1、7、11、12和19的核酸序列，或如下文公开的选自seq id no：1、7、11、12和19的部分的核酸序列，并且包含这样的具体核酸构建体的载体或颗粒也是本公开内容的一部分。
[0071]
编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因
[0072]
具体而言，根据本公开内容的核酸构建体包含编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因，优选编码选自seq id no：5、6、8、17和18的人葡萄糖脑苷脂酶，优选编码seq id no：5、6或8的人葡萄糖脑苷脂酶同种型1。
[0073]
本文所使用的术语“葡萄糖脑苷脂酶”指β-葡萄糖脑苷脂酶(也称为酸性β葡萄糖苷酶、d-葡糖基-n-酰基鞘氨醇葡萄糖水解酶或gcase)，其是具有葡萄糖脑苷酰胺酶活性的酶(ec 3.2.1.45)，其在通过水解切割化学葡萄糖脑苷脂的β-糖苷键中是必需的，葡萄糖脑苷脂是细胞膜(尤其是皮肤细胞)中含量丰富的糖脂代谢的中间体。术语“葡萄糖脑苷脂酶”是指此酶和任何其他共翻译或翻译后修饰物。
[0074]
人葡萄糖脑苷脂酶由人体中gba1基因天然编码，该gba1基因产生五个可变剪接的mrna，其编码葡萄糖脑苷脂酶的三种不同的同种型(同种型1(seq id no：5)、同种型2(seq id no：17)和同种型3(seq id no：18))。本文所使用的术语“葡萄糖脑苷脂酶”指葡萄糖脑苷脂酶的三种同种型。对应人gba1 mrna同种型1(genebank ref.m19285.1:123-1733)的编码序列部分cds的核苷酸序列以seq id no：7表示。
[0075]
在具体的实施方案中，所述核酸构建体包含具有与天然存在的或重组的葡萄糖脑苷脂酶的编码序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同一性的编码核酸序列的全部或一部分(至少1000、1100、1500、2000、2500或至少1500个核苷酸)。天然存在的葡萄糖脑苷脂酶包含人、灵长类、鼠或其他哺乳动物已知的葡萄糖脑苷脂酶，通常是seq id no：5、17或18的葡萄糖脑苷脂酶。
[0076]
重组的葡萄糖脑苷脂酶的实例包括imiglucerase(cerezyme)、velaglucerase(vpriv)和taliglucerase(elelyso)。
[0077]
在优选实施方案中，所述核酸构建体包含编码人葡萄糖脑苷脂酶的转基因，所述人葡萄糖脑苷脂酶选自seq id no：5、6、8、17和18，例如选自seq id no：1、7、11、12和19的序列所表示的编码序列，或由与选自seq id no：1、7、11、12和19的序列具有至少75％、至少80％或至少90％同一性的编码序列组成的变异转基因。优选地，所述转基因包含选自seq id no：1、7、11、12和19的序列的编码核酸部分，例如优化的序列seq id no：1、seq id no：7或19的区域58至1551、seq id no：7或19的区域58至1611和seq id no：7或19的区域118至1611。在一个实施方案中，编码seq id no：5、6、8、17或18的一部分或由与选自seq id no：1、7、11、12和19的序列具有至少75％、至少80％或至少90％同一性的编码序列组成的所述变异转基因与人葡萄糖脑苷脂酶实质上具有相同的葡萄糖脑苷脂酶活性。具体而言，变异核酸构建体编码截短的葡萄糖脑苷脂酶，其中一个或多个氨基酸残基缺失。
[0078]
本文所使用的术语“序列同一性”或“同一性”指来自两个多核苷酸或多肽序列的比对的位置的匹配(相同核酸或氨基酸残基)数量。通过在比对时比较序列以使重叠和同一性最大化同时使序列间隙最小化来确定序列同一性。具体而言，取决于两个序列的长度，可使用多种数学上整体或区域比对算法的任一种来确定序列同一性。长度相似的序列优选地使用在整个长度上最佳化比对序列的整体比对算法(例如needleman和wunsch算法；
needleman and wunsch,1970,j mol biol.；48(3):443-53)来比对，而长度实质上不同的序列优选地使用区域比对算法(例如smith和waterman算法(smith and waterman,1981,jtheor biol.；91(2):379-80)或altschul算法(altschul sf等人,1997,nucleic acids res.；25(17):3389-402.；altschul sf等人,2005,bioinformatics.；21(8):1451-6))来比对。用于确定核酸或氨基酸序列同一性的百分比的比对可以以本领域中熟知的多种方式来实现，例如使用可从网站(例如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/tools/emboss/)取得的公众可用的计算软件。本领域技术人员可决定用于量测比对的适当的参数，包括在比较的序列的全长实现最大比对所需的任何算法。为了本发明的目的，核酸或氨基酸序列同一性值的百分比是指使用成对序列比对程序emboss needle所产生的值，emboss needle使用needleman-wunsch算法产生两个序列的最佳整体比对，其中所有搜寻参数设定为预设值，即scoring matrix＝blosum62,gap open＝10,gap extend＝0.5,end gap penalty＝false,end gap open＝10和end gap extend＝0.5。
[0079]
用于与本公开内容的核酸构建体一起使用的启动子
[0080]
在一个实施方案中，核酸构建体包含启动子。所述启动子在被引入宿主细胞后启动转基因的表达。
[0081]
本文所使用的术语“启动子”指这样的调控元件，该调控元件引导可操作地连接至启动子的核酸的转录。启动子可调控可操作地连接的核酸的转录的速率和效率。启动子也可以可操作地连接至可增强核酸的与启动子相关的转录(“增强子”)或抑制核酸的与启动子相关的转录(“抑制子”)的其他调控元件。这些调控元件包括但不限于转录因子结合位点、抑制蛋白或活化蛋白结合位点以及对于本领域技术人员而言已知直接或间接用于调控启动子的转录量的任何其他核苷酸序列，包含例如弱化子、增强子和沉默子。启动子在相同的链上和dna序列的上游(朝向正义链的5'区域)位于靠近与其可操作地连接的基因或编码序列的转录起始位置。启动子的长度可以是约100至1000个碱基对。启动子中的位置相对于具体基因的转录起始位置(即，上游位置是从-1起算的负数，例如-100是上游100个碱基对的位置)设计。
[0082]
本文所使用的术语“可操作地连接”指是指在功能关系上多核苷酸(或多肽)元件的链接。当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，此核酸是“可操作地连接的”。举例而言，如果启动子或转录调控序列影响编码序列的转录，则其是可操作地连接。可操作地连接是指连接的dna序列通常是邻接的；当需要连接两个蛋白质编码区域时，他们是邻接的并且位于读框中。
[0083]
在具体的实施方案中，本公开内容的核酸构建体还包含可操作地连接至编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因的启动子，其中所述启动子引导所述转基因至少在神经元和神经胶质细胞(通常是在大脑皮质和亚细胞结构(例如有迈纳特基底核、黑质致密部、蓝斑、海马结构和内嗅皮质)中的神经元和神经胶质细胞，更优选黑质致密部的多巴胺能神经元和小神经胶质细胞，以及优选在其他脑部区域中的神经细胞，其他脑部区域至少包括黑质致密部、大脑皮质、杏仁核和丘脑的尾状板内侧核)中表达。
[0084]
通常，此类启动子可以是组织或细胞类型特异性的启动子或器官特异性的启动子或对多种器官具有特异性的启动子或者系统性或泛在启动子。
[0085]
本文所使用的术语“泛在启动子”更具体来说涉及在脑部的多种不同细胞或组织
(例如在神经元和神经胶质细胞两者中，通常是是在大脑皮质和亚细胞结构中的神经元和神经胶质细胞，例如在迈纳特基底核、黑质致密部、蓝斑、海马结构和内嗅皮质，更具体来说至少在黑质致密部的多巴胺能神经元和小神经胶质细胞，以及更优选在其他脑部区域的神经细胞，其他脑部区域至少包括黑质致密部、大脑皮质、杏仁核和丘脑的尾状板内侧核)中具有活性的启动子。
[0086]
适用于使转基因至少在神经元细胞和神经胶质细胞中表达的启动子，优选在黑质致密部的小神经胶质细胞中表达的启动子的实例包括但不限于cmv启动子(kaplitt 1994,nat.genet.8:148-154)、sv40启动子(hamer 1979,cell 17:725-735)、鸡β肌动蛋白(cba)启动子(miyazaki 1989,gene 79:269-277)、cag启动子(niwa 1991,gene108:193-199)、β葡萄糖醛酸酶启动子(gusb)(shipley 1991,genetics10:1009-1018)、延长因子1α启动子(ef1α)(nakai 1998,blood91:4600-4607)、人突触蛋白1基因启动子(hsyn)(kugler s.等人gene ther.2003.10(4):337-47)或磷酸甘油酸激酶1启动子(pgk1)(hannan1993,gene 130:233-239)。
[0087]
在具体的实施方案中，所述泛在启动子可选自人泛素c(ubc)启动子，优选seq id no：22、23或28的人泛素c(ubc)启动子，人磷酸甘油酸激酶1(pgk)启动子，优选seq id no：24或29的人磷酸甘油酸激酶1(pgk)启动子和seq id no：25、26或30的人cba/cbh启动子。
[0088]
在一个实施方案中，启动子是gusb基因启动子，通常是seq id no：2或20的gusb基因启动子。在另一个实施方案中，启动子是cag启动子，通常是seq id no：9或21的cag启动子。在另一个实施方案中，启动子是hsyn 1启动子，通常是seq id no：13的hsyn 1启动子。
[0089]
所有这些启动子序列都具有使所述转基因至少在神经元细胞和神经胶质细胞中表达的性质，通常是在大脑皮质和亚细胞结构例如迈纳特基底核、黑质致密部、蓝斑、海马结构和内嗅皮质中的神经元细胞和神经胶质细胞，更具体来说至少在黑质致密部的多巴胺能神经元和小神经胶质细胞，和更优选在其他脑部区域的神经细胞，其他脑部区域至少包括黑质致密部、大脑皮质、杏仁核和丘脑的尾状板内侧核。
[0090]
在优选实施方案中，所述核酸构建体包含可操作地连接至转基因的seq id no：2或20的gusb启动子，所述转基因编码葡萄糖脑苷脂酶，其通常选自seq id no：1、7、11、12和19。在另一个实施方案中，所述核酸构建体包含可操作地连接至转基因的seq id no：9或21的cag启动子，所述转基因编码葡萄糖脑苷脂酶，其通常选自seq id no：1、7、11、12和19。在另一个实施方案中，所述核酸构建体包含可操作地连接至转基因的seq id no：13的hsyn启动子，所述转基因编码葡萄糖脑苷脂酶，其通常选自seq id no：1、7、11、12和19。
[0091]
在具体的实施方案中，本公开内容所使用的启动子可以是化学诱导的启动子。本文所使用的化学诱导的启动子是通过化学诱导物向有需要的所述受试者的体内施用来调控的启动子。适合的化学诱导启动子的示例包括但不限于四环霉素/米诺四环素诱导的启动子(chtarto2003,neurosci lett.352:155
–
158)或雷帕霉素诱导系统(sanftner 2006,mol ther.13:167
–
174)。
[0092]
用于本公开内容的核酸构建体的多腺苷酸化序列
[0093]
这些核酸构建体的实施方案各自也可包含多腺苷酸化信号序列，连同或不连同其他选择性核苷酸元件。本文所使用的术语“多腺苷酸化信号”或“多聚(a)信号”指在基因的3’非翻译区域(3’utr)中的特定识别序列，其被转录为前体mrna分子并引导基因转录的终
止。多聚(a)信号用作在新形成的前体mrna的3’端的核酸内切切割以及在此3’端增加仅由腺嘌呤碱基(多腺苷酸化过程；多聚(a)尾)组成的rna区段的信号。多聚(a)尾对于核输出、翻译和mrna的稳定性是重要的。在本公开内容的上下文中，多腺苷酸化信号是能引导在哺乳动物细胞中的哺乳动物基因和/或病毒基因的多腺苷酸化的识别序列。
[0094]
多聚(a)信号通常由以下组成：a)共有序列aauaaa，其已被显示对于前信使rna(pre-mrna)的3
′
端切割和多腺苷酸化是必需的并且促使下游转录终止，以及b)aauaaa的上游和下游的额外元件，其控制利用aauaaa作为多聚(a)信号的效率。在哺乳动物基因的这些基序中有相当大的变异性。
[0095]
在一个实施方案中，任选地组合上文所述或下文所述的多种实施方案的一个或多个特征，本发明的核酸构建体的多腺苷酸化信号序列是哺乳动物基因或病毒基因的多腺苷酸化信号序列。适合的多腺苷酸化信号包括除其他以外sv40早期多腺苷酸化信号、sv40晚期多腺苷酸化信号、hsv胸苷激酶多腺苷酸化信号、鱼精蛋白基因多腺苷酸化信号、腺病毒5eib多腺苷酸化信号、生长激素多腺苷酸化信号、pbgd多腺苷酸化信号、在电脑中设计的多腺苷酸化信号(合成的)和类似的。
[0096]
在具体的实施方案中，核酸构建体的多腺苷酸化信号序列是基于牛生长激素基因的多腺苷酸化信号序列，更具体而言是seq id no：3的多腺苷酸化信号。
[0097]
在具体的实施方案中，用于根据本公开内容的用途的核酸构建体包含可操作地连接至选自seq id no：1、7、11、12和19的gba1基因的编码序列的seq id no：2或20的gusb启动子和含seq id no：3的多腺苷酸化信号序列。
[0098]
在具体的实施方案中，用于根据本公开内容的用途的核酸构建体包含可操作地连接至选自seq id no：1、7、11、12和19的gba1基因的编码序列的seq id no：9或21的cag启动子和seq id no：3的多腺苷酸化信号序列。
[0099]
在具体的实施方案中，用于根据本公开内容的用途的核酸构建体包含可操作地连接至选自seq id no：1、7、11、12和19的gba1基因的编码序列的seq id no：13的hsyn 1启动子和seq id no：3的多腺苷酸化信号序列。
[0100]
病毒载体
[0101]
本公开内容的病毒载体通常至少包含：(i)核酸构建体，其包含转基因和用于其在通过基因疗法治疗的所述宿主中的表达的适当的核酸元件，以及(ii)全部或部分的病毒基因组，例如病毒基因组的至少反向末端重复序列。
[0102]
在一个实施方案中，根据本公开内容的病毒载体包含病毒的5’itr和3’itr，并且选择性地包含ψ包装信号。
[0103]“ψ包装信号”是病毒基因组的顺式作用核苷酸序列，其在一些病毒(如腺病毒、慢病毒等)中对于在复制期间将病毒基因组包装至病毒衣壳内的过程是必需的。
[0104]
在一个实施方案中，病毒载体包含病毒的5’itr和3’itr，病毒选自细小病毒(尤其是腺相关病毒)、腺病毒、甲病毒、反转录病毒(尤其是γ反转录病毒和慢病毒)、疱疹病毒和sv40；在优选实施方案中，病毒是腺相关病毒(aav)、腺病毒(ad)或慢病毒。
[0105]
在一个实施方案中，病毒载体包含aav的5’itr和3’itr。
[0106]
aav作为人基因疗法中有潜力的载体引起极大的兴趣。病毒有利的特性是其缺乏与任何人疾病的关联性、感染分裂和非分裂细胞的能力以及可感染源自不同组织的多种细
胞系。aav基因组由包含4681个碱基的线性、单链dna分子组成(berns and bohenzky,1987,advances in virus research(academic press,inc.)32:243-307)。基因组在每个末端包含反向末端重复(itr)序列，其顺式发挥功能作为dna复制的起点和病毒的包装信号。itr的长度约是145bp。
[0107]
本发明的病毒载体中的aav itr可具有野生型核苷酸序列，或者可通过插入、缺失或取代一个或多个核苷酸而变化，通常相较于已知的aav itr，不超过5、4、3、2或1个核苷酸插入、缺失或取代。aav载体的反向末端重复序列(itr)的血清型可选自任何已知的人或非人的aav血清型。
[0108]
在具体的实施方案中，病毒载体可通过使用任何aav血清型的itr来实现。已知的aav itr包括但不限于aav1、aav2、aav3(包含3a型和3b型)、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、禽的aav、牛的aav、犬的aav、马的aav或绵羊的aav。
[0109]
在一个实施方案中，上述核酸构建体包含在所述病毒载体中，并且病毒载体还包含血清型aav2的aav的5’itr和3’itr。在具体的实施方案中，病毒载体包含血清型aav2的aav的5’itr和3’itr，优选seq id no：15和/或16，或者与seq id no：15和/或16具有至少80％或至少90％同一性的序列。
[0110]
因此，在更具体实施方案中，本公开内容的病毒载体包含核酸构建体，所述核酸构建体包含seq id no：2或20的gusb启动子，gusb启动子可操作地连接至选自seq id no：1、7、11、12和19的葡萄糖脑苷脂酶的编码序列，并且所述病毒载体还包含在所述核酸构建体两侧的aav itr，例如aav2的5’和3’itr，优选seq id no：15和/或16，或者与seq id no：15和/或16具有至少80％或至少90％同一性的序列。
[0111]
在另一具体实施方案中，本公开内容的病毒载体包含核酸构建体，所述核酸构建体包含选自seq id no：9或21的cag启动子的启动子，cag启动子可操作地连接至选自seq id no：1、7、11、12和19的葡萄糖脑苷脂酶的编码序列，并且所述病毒载体还包含在核酸构建体两侧的aav itr，例如aav2的5’和3’itr，优选seq id no：15和/或16，或者与seq id no：15和/或16具有至少80％或至少90％同一性的序列。
[0112]
在另一具体实施方案中，本公开内容的病毒载体包含核酸构建体，所述核酸构建体包含例如seq id no：13的hsyn 1启动子，hsyn 1启动子可操作地连接至选自seq id no：1、7、11、12和19的葡萄糖脑苷脂酶的编码序列，并且所述病毒载体还包含在核酸构建体两侧的aav itr，例如aav2的5’和3’itr，优选seq id no：15和/或16，或者与seq id no：15和/或16具有至少80％或至少90％同一性的序列。
[0113]
在具体的实施方案中，本公开内容的病毒载体包含seq id no：4或者与seq id no：4具有至少80％或至少90％同一性的序列或由其组成。
[0114]
另一方面，本公开内容的病毒载体可通过使用合成的5’itr和/或3’itr来实现；并且也可通过使用来自不同血清型的病毒的5’itr和3’itr来实现。病毒载体复制所需的所有其他病毒基因可反式提供在下文描述的病毒生产细胞(包装细胞)中。因此，在病毒载体中包含这些元件是任性。
[0115]
在一个实施方案中，病毒载体包含病毒的5’itr、ψ包装信号和3’itr。
[0116]
病毒颗粒
[0117]
前述公开的病毒载体可包装于由衣壳蛋白形成的衣壳中，从而构成下节所述的病
毒颗粒。
[0118]
在优选实施方案中，衣壳由腺相关病毒的衣壳蛋白形成，以下称作aav载体颗粒。
[0119]
本文所使用的aav载体颗粒至少包含aav基因组的5’itr和3’itr以及腺相关病毒的衣壳蛋白。aav载体颗粒这一术语涵盖任何重组aav载体颗粒(raav)或由已知raav的基因工程所获得的突变aav载体颗粒。
[0120]
腺相关病毒的病毒衣壳的蛋白质包括衣壳蛋白vp1、vp2和vp3。多种aav血清型的衣壳蛋白序列之间的差异会造成使用不同的细胞表面受体用于进入细胞。结合替代的细胞内加工途径，这会对各个aav血清型产生不同的组织向性。
[0121]
在具体的实施方案中，根据本公开内容的aav病毒颗粒可通过将源自具体aav血清型的aav载体/基因组的病毒载体封装于由对应相同具体血清型的aav的天然cap蛋白质形成的病毒颗粒来制备。然而，已发展出多种技术以修饰并改善天然存在的aav颗粒的结构或功能性质(b
ü
nning h等人j gene med 2008；10:717
–
733)。因此，在另一个实施方案中，根据本公开内容的aav病毒颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含两侧有给定aav血清型的itr的编码葡萄糖脑苷脂酶的基因，所述给定aav血清型包装于例如：a)病毒颗粒，其由源自相同或不同的aav血清型的衣壳蛋白组成(例如aav2 itr和aav9衣壳蛋白；aav2 itr和aav tt衣壳蛋白或来自诸如aav2-retro、aavmnm004或aavmnm008的aavretro血清型的其他衣壳蛋白等)；b)镶嵌病毒颗粒，其由源自不同的aav血清型或突变体的衣壳蛋白的混合物组成(例如具有由两种或更多种aav血清型的蛋白形成的衣壳的aav2 itr)；c)嵌合病毒颗粒，其由通过在不同的aav血清型或变体之间的结构域交换而被截短的衣壳蛋白组成(例如具有aav3结构域的aav5衣壳蛋白的aav2 itr)；或d)靶向的病毒颗粒，其被工程化以显现出选择性结合结构域，使得能够与靶细胞特异性受体进行严格的相互作用。
[0122]
pignataro d,sucunza d,rico aj等人,j neural transm2018；125:575-589中已综述靶向cns的基于aav的基因疗法。更具体而言，aav颗粒可被选择和/或工程化以至少靶向神经元细胞和神经胶质细胞，特别是至少靶向位于大脑皮质和亚细胞结构例如迈纳特基底核、黑质致密部、蓝斑、海马结构和内嗅皮质中的神经元和神经胶质细胞，更具体而言至少靶向黑质致密部的多巴胺能神经元和小神经胶质细胞。
[0123]
在具体的实施方案中，用于根据本公开内容的aav病毒颗粒的衣壳蛋白的aav血清型的示例包括aav2、aav5、aav9、aav2-retro、aav mnm004、aav mnm008和aav tt。在优选实施方案中，衣壳蛋白的所述aav血清型选自aav9和aav tt血清型。
[0124]
在具体的实施方案中，任选地结合上述或下述的多种实施方案的一个或多个特征，病毒颗粒是重组aav病毒颗粒，所述重组aav病毒颗粒包含上文所述的aav病毒载体，其优选地包含选自seq id no：1、7、11、12和19的编码序列，并包含aav9血清型或aav tt血清型的衣壳蛋白，优选包含seq id no：14的氨基酸序列或与seq id no：14具有至少98.5％、优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列的aav tt血清型的衣壳蛋白。
[0125]
在另一具体实施方案中，病毒颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含在启动子控制下的人葡萄糖脑苷脂酶的编码序列，所述启动子允许人葡萄糖脑苷脂酶至少在神经元和神经胶质细胞两者中表达，优选在神经元和小神经胶质细胞两者中表达。所述病毒颗粒选自至少靶向神经元和神经胶质细胞的病毒颗粒，优选至少靶向黑质致密部中的神经元和小神经胶质细胞的病毒颗粒，通常病毒颗粒是腺相关病毒颗粒，其包含选自aav2、aav5、
aav9、aav mnm004、aav mnm008或aav tt血清型的衣壳蛋白，优选aav tt血清型的衣壳蛋白，其包含seq id no：14的氨基酸序列或与seq id no：14具有至少98.5％、优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列。
[0126]
在更具体实施方案中，根据本公开内容的此类重组aav病毒颗粒包含aav9、aav mnm004、aav mnm008或aav tt血清型的衣壳蛋白以及aav病毒载体，所述以及病毒载体包含(i)核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接至选自seq id no：1、7、11、12和19的葡萄糖脑苷脂酶的编码序列的启动子，所述启动子选自以下启动子：seq id no：2或20的gusb启动子、seq id no：9或21的cag启动子以及seq id no：13的hsyn启动子，以及(ii)在所述核酸构建体两侧的aav itr，例如aav2的5’和3’itr，优选seq id no：15和/或16或者与seq id no：15和/或16具有至少80％或至少90％同一性的序列的5’和3’itr。
[0127]
在更具体实施方案中，根据本公开内容的此类重组腺相关病毒颗粒包含aav tt血清型的衣壳蛋白以及aav病毒载体，所述aav tt血清型的衣壳蛋白包含seq id no：14的氨基酸序列或与seq id no：14具有至少98.5％、优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列，所述aav病毒载体包含(i)核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接至选自seq id no：1、7、11、12和19的葡萄糖脑苷脂酶的编码序列的seq id no：2或20的gusb启动子，以及(ii)在所述核酸构建体两侧的aav itr，例如aav2的5’和3’itr，优选seq id no：15和/或16或与seq id no：15和/或16具有至少80％或至少90％同一性的序列的5’和3’itr。
[0128]
在更具体实施方案中，根据本公开内容的此类重组腺相关病毒颗粒包含aav tt血清型的衣壳蛋白以及aav病毒载体，所述aav tt血清型的衣壳蛋白包含seq id no：14的氨基酸序列或与seq id no：14具有至少98.5％、优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列，所述aav病毒载体包含(i)核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接至选自seq id no：1、7、11、12和19的葡萄糖脑苷脂酶的编码序列的seq id no：9或21的cag启动子，以及(ii)在所述核酸构建体两侧的aav itr，例如aav2的5’和3’itr，优选seq id no：15和/或16或者与seq id no：15和/或16具有至少80％或至少90％同一性的序列的5’和3’itr。
[0129]
在更具体实施方案中，根据本公开内容的此类重组腺相关病毒颗粒包含aav tt血清型的衣壳蛋白以及aav病毒载体，所述aav tt血清型的衣壳蛋白包含seq id no：14的氨基酸序列或与seq id no：14具有至少98.5％、优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列，所述aav病毒载体包含(i)核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接至选自seq id no：1、7、11、12和19的葡萄糖脑苷脂酶的编码序列的seq id no：13的hsyn启动子，以及(ii)在所述核酸构建体两侧的aav itr，例如aav2的5’和3’itr，优选seq id no：15和/或16或者与seq id no：15和/或16具有至少80％或至少90％同一性的序列的5’和3’itr。
[0130]
重组aav病毒颗粒的建构通常是本领域中熟知的，并已描述于例如us 5,173,414和us5,139,941；wo 92/01070,wo 93/03769,lebkowski等人(1988)molec.cell.biol.8:3988-3996；vincent等人(1990)vaccines 90(cold spring harbor laboratory press)；carter,b.j.(1992)current opinion in biotechnology 3:533-539；muzyczka,n.(1992)current topics in microbiol.and immunol.158:97-129；和kotin,r.m.(1994)human gene therapy 5:793-801。含有血清型aav tt的衣壳蛋白的病毒颗粒已描述于tordo j,等人,brain2018；141:2014-2031。
[0131]
具有逆向运输的病毒颗粒
[0132]
在一些实施方案中，根据本公开内容的病毒颗粒选自具有逆向运输的病毒变异血清型(aavretro)。
[0133]
轴突运输(有时也称为轴质运输或轴质流)是指细胞胞器和蛋白质从给定神经元的细胞体朝向轴突末端的移动(称为顺向运输)。本文所使用的术语“逆向运输”指在相反方向上颗粒的运输，即从轴突末端回到母细胞体。在此方面，亲神经性病毒(最佳示例是狂犬病病毒)通常被轴突末端吸收并利用逆向运输运送到神经元的细胞体。
[0134]
aavretro颗粒的示例包括但不限于衣壳蛋白，优选aav2-retro、aav-tt、aav-mnm004和aav-mnm008的衣壳蛋白，更优选aav2-retro、aav-tt、aav-mnm004和aav-mnm008的vp1衣壳蛋白。
[0135]
aav2-retro衣壳蛋白已描述于wo2017/218842a1。
[0136]
其他各种不同类型的经修饰的病毒衣壳，例如aav-tt、aav-mnm004和aav-mnm008，也已被设计成传导神经支配其中病毒载体通过病毒载体的逆向传播传递的区域的神经元。
[0137]
aav-mnm004和aav-mnm008例如描述于davidsson等人proc.natl.acad.sci.u.s.a.dec 9 2019doi:10.1073/pnas.1910061116和wo2019/158619中。
[0138]
也被称作aav2真型衣壳的aav-tt衣壳例如描述于wo2015/121501中。在一个实施方案中，aav-tt vp1衣壳蛋白相对野生型aav vp1衣壳蛋白在对应aav2蛋白质序列(ncbi参考序列:yp_680426.1)中的以下一个或多个位置的位置包含至少一个氨基酸取代：125、151、162、312、457、492、499、533、546、548、585、588和/或593，更具体而言，aav-tt相对野生型aav2 vp1衣壳蛋白(ncbi参考序列:yp_680426.1)包含一个或多个下列氨基酸取代：v125i、v151a、a162s、t205s、n312s、q457m、s492a、e499d、f533y、g546d、e548g、r585s、r588t和/或a593s。在一个具体实施方案中，aav-tt相对野生型aav2 vp1衣壳蛋白在位置457、492、499和533包含四个或更多个突变。
[0139]
在进一步实施方案中，aav-tt衣壳可来自不同于aav2的腺相关病毒血清型，并可源自例如aav1、aav3b、aav-lk03、aav5、aav6、aav8、aav9或aav10衣壳蛋白。具体而言，对应上述那些相对aav2的位置可通过序列比对容易地辨识，例如图1和图2所示。在一个实施方案中，本公开内容的aav-tt vp1衣壳蛋白包含seq id no：14的氨基酸序列或与seq id no：14具有至少98.5％、优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列或由其组成。
[0140]
在具体的实施方案中，根据本公开内容的aavretro病毒颗粒选自能够逆向散布于大脑皮质的那些，优选在非人灵长类的尾状核或壳核中的脑实质内注射后至少散布至黑质致密部和大脑皮质，如体内散布测定所确定的。
[0141]
在更具体实施方案中，根据本公开内容的aavretro病毒颗粒选自能够逆向散布于大脑皮质的那些，优选地在非人灵长类的尾状核或壳核中的脑实质内注射后至少散布至黑质致密部和大脑皮质，并且至少达到与aav-tt相同的水平，如体内散布测定所确定的。
[0142]
本发明人确实设计出一种体内散布测定，其能够确定具有真正的逆向运输的raav以用于治疗本文公开的诸如阿尔茨海默病的tau蛋白病的基因疗法，并且例如与诸如aav-tt raav-gfp的阳性对照比较。
[0143]
散布测定的一个重要特征在于其是在非人灵长类中的体内测定，其中在非人灵长类中将raav注射于没有通道纤维的区域。因此，没有假阳性吸收可由通道纤维获得，即纤维
通过注射区域朝向更远的目的地。在非人灵长类中，尾状核和壳核是100％实质结构，因此不包含通道纤维。因此，有利地，根据本公开内容可通过所提出的散布测定比较并选择具有逆向运输的适合的raav。
[0144]
在优选实施方案中，所述aav retro病毒颗粒包含aav tt血清型衣壳蛋白，所述aav tt血清型衣壳蛋白包含seq id no：14的氨基酸序列或与seq id no：14具有至少98.5％、优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列，并且aav retro病毒颗粒能够逆向散布于大脑皮质中，优选在非人灵长类的尾状核或壳核中的脑实质内注射后至少散布至黑质致密部和大脑皮质中，如体内散布测定所确定的。
[0145]
在优选实施方案中，体内散布测定包括以下步骤：
[0146]
a.将包含编码gfp的转基因的测试raav(raav-gfp)通过所述raav-gfp的脑实质内注射的方式注射至非人灵长类的连合后壳核中，
[0147]
b.在注射后约一个月，计算在大脑皮质中，优选在神经支配尾状壳核的脑部区域中表达gfp的神经元的数量。
[0148]
编码gfp的转基因可由seq id no：10或27的编码gfp的核酸或者其具有最佳化序列或截短形式的功能变体来制备。表达gfp的神经元可使用抗gfp抗体通过免疫过氧化酶染色来可视化。表达gfp的神经元有利地可在被注射的非人灵长类的整个大脑皮质中自动计数。预期gfp阳性的神经元的优先位置出现在大脑皮质的深层。除了皮质区域之外，表达gfp的神经元也可在神经支配被注射的连合后壳核或尾状壳核的所有脑部区域中，优选地至少在黑质致密部、杏仁核和尾状板内侧核中被定量。
[0149]
在具体的实施方案中，根据本公开内容的aav-retro病毒颗粒选自如体内散布测定所确定的神经支配被注射位点的大脑皮质的深层v-vi中的神经元的至少50％、60％、70％、80％或至少90％会表达gfp的那些。在优选实施方案中，aav retro病毒颗粒包含aav tt血清型衣壳蛋白，所述aav tt血清型衣壳蛋白包含seq id no：14的氨基酸序列或与seq id no：14具有至少98.5％、优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列，其中如所述体内散布测定所确定，神经支配被注射位点的大脑皮质的深层v-vi中的神经元的至少50％、60％、70％、80％或至少90％会表达gfp。
[0150]
在更具体实施方案中，如实施例中所述进行散布测定。
[0151]
在更具体实施方案中，体内散布测定包括以下步骤：
[0152]
a.将包含gfp转基因的测试raav通过所述raav-gfp的脑实质内注射的方式注射至非人灵长类的连合后壳核中，
[0153]
b.在注射后约一个月，计算在大脑皮质中，优选在神经支配尾状壳核的脑部区域中，更优选至少在大脑皮质、黑质、杏仁核和尾状板内侧核中表达gfp的神经元的数量，
[0154]
c.比较在大脑皮质中被标记的神经元的百分比与使用aav-tt-gfp进行的对照实验。
[0155]
在其他实施方案中，aavretro包含选自以下变异血清型的衣壳蛋白：aav2-retro、aav-mnm004、aav-mnm008和aav-tt。
[0156]
在优选实施方案中，所述aav retro病毒颗粒包含aav tt血清型衣壳蛋白，所述aav tt血清型衣壳蛋白包含seq id no：14的氨基酸序列或与seq id no：14具有至少98.5％、优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列。
molecular biology,vol.737.merten and al-rubeai(eds.)；2011humana press(springer)；gene therapy.m.giacca.2010springer-verlag；heilbronn r.and weger s.viral vectors for gene transfer:current status of gene therapeutics.in:drug delivery,handbook of experimental pharmacology 197；m.-korting(ed.).2010springer-verlag；pp.143-170；adeno-associated virus:methods and protocols.r.o.snyder and p.moulllier(eds).2011humana press(springer)；b
ü
nning h.等人recent developments in adeno-associated virus technology.j.gene med.2008；10:717-733；adenovirus:methods and protocols.m.chill
ó
n and a.bosch(eds.)；third edition.2014humana press(springer)。
[0168]
本公开内容还涉及包含上文所述的编码葡萄糖脑苷脂酶的病毒载体或核酸构建体的宿主细胞。更具体而言，根据本公开内容的宿主细胞是具体病毒生产细胞，也称为包装细胞，其在辅助载体、病毒或dna构建体的存在下用上文所述的病毒载体或核酸构建体转染，并反式提供病毒颗粒完整复制和包装所需的所有缺失功能。所述包装细胞可以是附着型或悬浮型细胞。
[0169]
举例来说，包装细胞可以是真核细胞，如哺乳动物细胞，包括猴、人、狗和啮齿动物细胞。人细胞的实例是per.c6细胞(wo01/38362)、mrc-5(atcc ccl-171)、wi-38(atcc ccl-75)、hek-293细胞(atcc crl-1573)、hela细胞(atcc ccl2)和胎儿猕猴肺细胞(atcc cl-160)。非人灵长类细胞的实例是vero细胞(atcc ccl81)、cos-1细胞(atcc crl-1650)或cos-7细胞(atcc crl-1651)。狗细胞的实例是mdck细胞(atcc ccl-34)。啮齿动物细胞的实例是诸如bhk21-f、hkcc细胞或cho细胞的仓鼠细胞。
[0170]
作为哺乳动物来源的替代者，用于生产病毒颗粒的包装细胞可源自禽类来源，例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑或雉。禽类细胞系的实例包括禽类胚胎干细胞(wo01/85938和wo03/076601)、永生的鸭视网膜细胞(wo2005/042728)和禽类胚胎干细胞衍生细胞，包括鸡细胞(wo2006/108846)或鸭细胞，例如eb66细胞系(wo2008/129058&wo2008/142124)。
[0171]
在另一个实施方案中，细胞可以是允许杆状病毒感染和复制的任何包装细胞。在具体的实施方案中，所述细胞是昆虫细胞，例如sf9细胞(atcc crl-1711)、sf21细胞(iplb-sf21)、mg1细胞(bti-tn-mg1)或high five
tm
细胞(bti-tn-5b1-4)。
[0172]
因此，在具体的实施方案中，任选地组合如上述或下述的多种实施方案的一个或多个特征，所述宿主细胞包含：
[0173]-如上所述的包含编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因的病毒载体或核酸构建体(例如aav载体)，
[0174]-不携带itr序列的编码aav rep和/或cap基因的核酸构建体，例如质粒；以及任性地
[0175]-包含病毒辅助基因的核酸构建体，例如质粒或病毒。
[0176]
在另一方面，本公开内容涉及用本公开内容的病毒颗粒传导的宿主细胞，本文所使用的术语“宿主细胞”指易于被感兴趣的病毒感染并且适合体外培养的任何细胞系。
[0177]
药物组合物
[0178]
本公开内容的另一方面涉及一种药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的本公开内容的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒或宿主细
胞。
[0179]
本文所使用的术语“药学上可接受”表示由管理机构或公认的药典诸如欧洲药典批准用于动物和/或人。“赋形剂”的术语是指与治疗试剂一起施用的稀释剂、佐剂、载体或媒介物。
[0180]
任何适合的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂可用于药物组合物的制备(参见例如remington:the science and practice of pharmacy,alfonso r.gennaro(editor)mack publishing company,april 1997)。药物组合物在制造和储存的状态下通常是无菌并且稳定的。药物组合物可制成溶液(例如盐水、右旋糖溶液、缓冲液或药学上可接受的其他无菌液体)、微乳液、脂质体或适合容纳高产物浓度的其他序化结构(例如微颗粒或纳米颗粒)。携带体可以是溶剂或散布介质(例如包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇和类似物))和其适合的混合物。可例如通过使用诸如卵磷脂的包衣通过在散布剂的情况下维持所需的颗粒尺寸以及使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选地在组合物中包含等张试剂，例如糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇或氯化钠。
[0181]
优选地，将所述药物组合物配制成溶液，更优选配制成任性缓冲的盐溶液。补充的活性化合物也可并入本发明的药物组合物。可在例如加拿大药师协会的药学和专业概要(compendium of pharmaceutical and specialties，cps)中找到关于额外治疗剂的共同施用的指南。
[0182]
在一个实施方案中，药物组合物是适用于脑实质内、脑内、静脉内或鞘内施用的药物组合物。这些药物组合物仅是示例性的并且不限制适用于其他肠胃外和非肠胃外的施用途径。本文所述的药物组合物可以以单一单位剂量或多剂量的形式包装。
[0183]
治疗用途
[0184]
使用小鼠的偶发性tau蛋白病的动物模型，本发明人惊讶地发现葡萄糖脑苷脂酶活性的aav介导的增强诱导在黑质致密部和纹状体两者中tau蛋白聚集体的广泛清除。
[0185]
这些结果对于治疗人受试者的tau蛋白病，尤其是偶发性tau蛋白病，更具体而言是阿尔茨海默病的可能治疗策略提供强烈的证据。
[0186]
因此，本公开内容涉及在有需要的受试者中治疗tau蛋白病变，例如阿尔茨海默病，更具体是偶发性阿尔茨海默病的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的上文所述的病毒颗粒或病毒载体。
[0187]
在具体的实施方案中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的上文所述的病毒颗粒或病毒载体，所述病毒颗粒或病毒载体将被输送至大脑皮质的神经元，优选大脑皮质的深层v-vi中的神经元，优选神经支配施用位置的大脑皮质的深层v-vi中的神经元的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或至少90％。
[0188]
在另一个具体实施方案中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的上文所述的病毒颗粒或病毒载体，所述病毒颗粒或病毒载体将被输送至神经支配注射位点的脑部区域中的神经元，优选至少输送至神经支配尾状壳核的脑部区域中的神经元，即至少黑质致密部、大脑皮质、杏仁核和丘脑的尾状板内侧核中，优选这些神经元的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或至少90％。
[0189]
在另一个具体实施方案中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的上文所述的病毒颗粒或病毒载体，所述病毒颗粒或病毒载体将被输送至神经支配注射位点的脑部区域
中的神经元，优选至少输送至神经支配海马结构的齿状回的脑部区域中的神经元，即至少位于内嗅皮质的ii层和iii层的神经元，优选这些神经元的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或至少90％。
[0190]
另一方面，本公开内容涉及上文所述的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物在有需要的受试者中用作药物的用途，更具体而言，用于在有需要的受试者中治疗tau蛋白病，优选阿尔茨海默病，更具体是偶发性阿尔茨海默病。
[0191]
在另一方面，本公开内容涉及上文所述的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物在制造药物中的用途，优选地用于治疗tau蛋白病，优选阿尔茨海默病，更具体是偶发性阿尔茨海默病。
[0192]
本文所使用的术语“受试者”或“患者”是指哺乳动物。可受益于本公开内容的治疗方法的哺乳动物种包括但不限于人、诸如猿类、黑猩猩、猴子和红毛猩猩的非人灵长类、包括狗和猫的家养动物以及诸如马、牛、猪、绵羊和山羊的家畜或者包括但不限于小鼠、大鼠、天竺鼠、兔子、仓鼠和类似动物的其他哺乳动物种。
[0193]
本文所使用的术语“治疗”、“医治”或“疗治”指意欲改善患者的健康状况的任何动作，例如疾病的疗法、防止、预防或延缓。在某些实施方案中，此术语是指改善或根除疾病或与疾病相关的症状，通常是tau蛋白病中的tau蛋白聚集体。
[0194]
在其他实施方案中，此术语是指因向患有此疾病的受试者施用一种或多种治疗试剂而使疾病的扩散或恶化最小化。
[0195]
本文所使用的tau蛋白病是指以脑组织中tau蛋白的胞浆内聚集，特别是神经纤维缠结形式的过度磷酸化tau蛋白的聚集为神经病理特征的疾病。具体而言，tau蛋白病包括例如阿尔茨海默病的神经退行性疾病，还包括额颞叶痴呆(ftd)、进行性核上性麻痹(psp)、皮质基底节变性(cbd)、缠结优势型痴呆(tpd)、关岛帕金森痴呆综合征、嗜银颗粒病(agd)和皮克病(ad不相关的)。
[0196]
本文所使用的阿尔茨海默病(ad)是指源头未知的中枢神经系统的进行性神经退行性疾病。在ad的背景下，定义特征是认知障碍。在大多数诊断病例中，认知障碍伴随情绪和行为症状，如抑郁、焦虑、易怒、不当行为、躁动和精神错乱。ad诊断通常通过临床评估和信息提供者的访谈来完成。根据《精神障碍诊断与统计手册》(dsm-iv)，对于达到可能是阿尔茨海默病的诊断需要以下准则：(1)多重认知缺陷，(2)社交和劳动恶化，(3)逐渐开始和恶化，和(4)不能用其他原因解释。由国家神经和交流障碍和中风研究所(nincds)和阿尔茨海默病与相关疾病协会(arrda)于1984年发布的准则如下：(1)涉及两个或更多个区域，(2)存在进行性痴呆，(3)意识的改变消失，(4)开始于40岁至90岁，和(5)不能用其他原因解释。此外，被称为轻度认知障碍(mci)的前驱前阿尔茨海默病状态(prodromal pre-alzheimer’s disease state)被定义为对于受试者的年龄和教育水平的客观异常记忆丧失。mci的准则包括：(1)由家庭成员证实的记忆障碍，(2)其他认知功能正常，(3)日常活动正常，(4)年龄记忆异常，和(5)无痴呆。
[0197]
上述方法尤其适用于治疗偶发性tau蛋白病，特别是偶发性阿尔茨海默病。本文所使用的“偶发性tau蛋白病(也称为特发性疾病)”指与已知的具体基因突变(家族性案例)无关的tau蛋白病。与家族性tau蛋白病相关的这样的已知基因突变包括在选自以下的基因中的突变：21号染色体上的淀粉样前体蛋白质(app)基因、14号染色体上的编码早老素1
(psen1)的基因和1号染色体上的编码早老素2(psen2)的基因。
[0198]
本文所使用的术语“治疗有效量”是指在剂量下和在一段时间内达到期望治疗结果所需的有效量，期望治疗结果例如是以下治疗结果的一个或多个：
[0199]-在所述受试者的神经元中tau蛋白聚集体的显著减少，
[0200]-神经元的显著神经保护效果，
[0201]-tau蛋白去除所引起的小神经胶质细胞驱动的促炎现象的显著减弱，
[0202]-朊蛋白样跨神经通道的显著阻断。
[0203]
本文所使用的术语“tau蛋白的朊蛋白样跨神经通道”是指蛋白质从神经元轴突末端跳传至被表达tau蛋白的轴突末端神经支配的下一个神经元的能力。
[0204]
tau蛋白负荷在脑部区域中(例如在大脑皮质的神经元中)的显著减少可对应在4周治疗的最小时期后在对应脑部区域(例如大脑皮质)中tau蛋白聚集的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或至少90％的减少。
[0205]
在一些实施方案中，在52周(一年)治疗的最小时期后，在经治疗的患者中神经元的显著神经保护效果可评估为，相较于未治疗的患者至少10％、至少20％或至少30％改善的神经元存活。
[0206]
在其他具体实施方案中，使用本公开内容的产物的治疗可抑制tau蛋白病的一种或多种症状的进展或延缓tau蛋白病的一种或多种症状的发作，或降低tau蛋白病的一种或多种症状的严重性。举例而言，治疗可抑制一个或多个以下症状的进展、延缓一个或多个以下症状的发作或降低一个或多个以下症状的严重程度：
[0207]-神经元的退化(例如在迈纳特基底核、黑质致密部、蓝斑、海马结构、内嗅皮质和整个大脑皮质区域中)，
[0208]-轻度至重度认知障碍，
[0209]-情绪波动，
[0210]-抑郁，
[0211]-冷淡，
[0212]-混淆时间和地点，
[0213]-幻觉，
[0214]-行为障碍，
[0215]-姿势不稳定，
[0216]-缺乏同情心，
[0217]-决策障碍，
[0218]-健忘、易怒，
[0219]-妄想、躁动，和
[0220]-对日常活动的兴趣缺乏和对社交互动的退缩等等。
[0221]
在一个实施方案中，如上文所述的病毒颗粒(或病毒载体)的有效量通过脑实质内、脑内、脑室内(icv)、鞘内或静脉内施用途径向受试者或患者施用。
[0222]
通常，所述病毒载体的治疗有效量优选通过鞘内或脑实质内途径施用，后者优选施用至脑部区域例如大脑皮质和亚细胞结构，如迈纳特基底核、黑质致密部、蓝斑、海马结构和内嗅皮质。
[0223]
在具体的实施方案中，所述病毒载体的治疗有效量通过脑实质内途径施用，优选施用至海马结构的齿状回，以通过高效路径至少散布到内嗅皮质ii和iii层的神经元。本文所使用的所述高效路径是指连接内嗅皮质和齿状回的解剖学路径。
[0224]
本文所使用的术语“优选的局部施用”并不意味着所有病毒颗粒都施用至大脑的所述区域，而是大部分病毒颗粒，例如至少50％、至少60％、至少70％或具有至少80％(vg)的病毒颗粒被施用至所述区域。
[0225]
对于脑脊髓空间中的施用，神经传导取决于脑脊髓液循环动力学，因此预期会观察到：(1)在脑室周围区域中，即紧密靠近脑室的区域；(2)通过非特异性方法发生，即神经元将通过从脑室或从蜘蛛膜下腔扩散而传导，并且预期在上皮质层i-iv观察到强烈的标记(例如通过从蜘蛛膜下腔扩散)；以及(3)在不连接至壳核的脑部区域诸如小脑和海马体中。考虑黑质致密部位于远离脑室的位置，来自深层脑部(例如黑质致密部)的神经元的脑室系统的传导很难发生，因此难以通过被动扩散进行转染。
[0226]
相较于脑脊髓空间中的施用，病毒载体在尾状壳核中的施用显现出许多优势，例如位于神经支配注射位点的大脑皮质、丘脑、杏仁核、黑质致密部和中缝背核中的神经元的特异性传导，以及在已知神经支配壳核的脑部区域中的回路特异性逆向传播，例如在投射于壳核的皮质区域的v层中而没有逆向传播至非期望的区域(例如缺乏逆向运输到已知不会神经支配壳核的区域)。
[0227]
因此，脑实质内施用途径可促使病毒颗粒局部施用至尾状壳核，进而促使转基因逆向散布至神经支配注射位点的任何脑部区域。
[0228]
在优选实施方案中，病毒颗粒可以以每壳核50至1000μl，优选200至700μl的范围内的容积以优选10
13-10
14
vg/ml(vg：病毒基因组)的范围内的浓度通过抵达至尾状壳核的脑实质内施用途径施用至人受试者或患者。在具体的实施方案中，病毒颗粒以0.5至5μl/min的范围内的注射流速，优选地在2至6小时内施用。病毒颗粒的这样的高注射速率增加病毒稳定性并使患者有更好的管理。
[0229]
在某些实施方案中，所述病毒颗粒选自raav颗粒，优选包含选自aav2、aav5、aav9、aav-mnm004、aav-mnm008和aav tt血清型的衣壳蛋白。
[0230]
在某些实施方案中，病毒颗粒是aavretro，其包含选自以下变异血清型的衣壳蛋白：aav2-retro、aav-mnm004、aav-mnm008和aav-tt。
[0231]
在一个实施方案中，aav-tt颗粒可以以每壳核50至1000μl，优选200至700μl的范围内的容积以优选10
13-10
14
vg/ml(vg：病毒基因组)的范围内的浓度通过抵达至尾状壳核的脑实质内施用途径施用至人受试者或患者。在具体的实施方案中，将病毒颗粒以0.5至5μl/min的范围内的注射流速，优选地在2至6小时内施用。
[0232]
在另一个实施方案中，aav-9颗粒可以以每壳核50至1000μl，优选200至700μl的范围内的容积以优选10
13-10
14
vg/ml(vg：病毒基因组)的范围内的浓度通过抵达至尾状壳核的脑实质内施用途径施用至人受试者或患者。在具体的实施方案中，病毒颗粒以0.5至5μl/min的范围内的注射流速，优选地在2至6小时内施用。
[0233]
在一个实施方案中，脑实质内施用途径可促使aav优选局部性施用至尾状壳核，因此促使gba1转基因逆向散布至神经支配注射位点的任何脑部区域。
[0234]
本公开内容涉及病毒颗粒，优选包含根据本公开内容的gba1转基因的aav颗粒，其
用于治疗神经退行性疾病，例如tau蛋白病，其中所述病毒颗粒通过脑实质内施用途径施用至尾状壳核。
[0235]
在优选实施方案中，根据本公开内容的aav病毒颗粒可以以每壳核50至1000μl，优选200至700μl的范围内的容积以优选10
13-10
14
vg/ml(vg：病毒基因组)的范围内的浓度通过抵达至尾状壳核的脑实质内施用途径施用至人受试者或患者。在具体的实施方案中，病毒颗粒以0.5至5μl/min的范围内的注射流速，优选地在2至6小时内施用。
[0236]
在具体的实施方案中，根据本公开内容的aav-tt可通过抵达至尾状壳核的脑实质内施用途径施用至人受试者或患者，以治疗tau蛋白病如阿尔茨海默病。
[0237]
根据本公开内容的所述aav-tt颗粒可以以每壳核50至1000μl，优选200至700μl的范围内的容积以优选10
13-10
14
vg/ml(vg：病毒基因组)的范围内的浓度通过抵达至尾状壳核的脑实质内施用途径施用至人受试者或患者。在具体的实施方案中，病毒颗粒以0.5至5μl/min的范围内的注射流速，优选地在2至6小时内施用。
[0238]
在优选实施方案中，提供一种重组腺相关病毒(raav)颗粒，其包含这样的核酸构建体，所述核酸构建体包含编码人葡萄糖脑苷脂酶的转基因，并且人葡萄糖脑苷脂酶包含选自seq id no：5、6、8、17和18的序列，通常转基因选自seq id no：1、7、11、12和19的序列，其中核酸构建体还包含可操作地连接至所述转基因的启动子，其中所述raav颗粒包含aav-tt衣壳蛋白，所述aav-tt衣壳蛋白包含seq id no：14的氨基酸序列或与seq id no：14具有至少98.5％、优选99％或99.5％同一性的序列，以用于治疗神经退行性疾病，例如突触核蛋白病变，优选戈谢病(例如神经性戈谢病)或帕金森氏症(例如偶发性帕金森氏症)，其中所述raav颗粒通过脑实质内途径优选以每壳核50至1000μl，优选200至700μl的范围内的容积以优选10
13-10
14
vg/ml(vg：病毒基因组)的范围内的浓度施用至尾状壳核。在具体的实施方案中，病毒颗粒以0.5至5μl/min的范围内的注射流速，优选地在2至6小时内施用。
[0239]
在另一个实施方案中，根据本公开内容的aav-9可通过抵达至尾状壳核的脑实质内施用途径施用至人受试者或患者，以治疗tau蛋白病如阿尔茨海默病。
[0240]
根据本公开内容的所述aav-9颗粒可以以每壳核50至1000μl，优选200至700μl的范围内的容积以优选10
13-10
14
vg/ml(vg：病毒基因组)的范围内的浓度通过抵达至尾状壳核的脑实质内施用途径施用至人受试者或患者，以治疗tau蛋白病如阿尔茨海默病。在具体的实施方案中，病毒颗粒以0.5至5μl/min的范围内的注射流速，优选地在2至6小时内施用。
[0241]
在另一个实施方案中，脑实质内施用途径可促进aavretro施用至海马结构的齿状回的优选局部性施用，从而促使gba1转基因逆向散布至神经支配注射位点的任何脑部区域，优选位于内嗅皮质的ii层和iii层中的神经元。
[0242]
本公开内容的产物或包含其的药物组合物的治疗有效量可根据因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及产物或药物组合物在个体中引导所需反应的能力而改变。可调整剂量方案以提供最佳治疗反应。
[0243]
治疗有效量通常也是产品或药物组合物的在治疗上的有利功效胜过任何有毒性或有害作用的量。
[0244]
对于任何具体受试者，可根据个体需求以及施用或管理组合物的施用的个体的专业判断来随时间调整具体剂量方案。本文所示的剂量范围仅是示例性的并且并不限制医生可选择的剂量范围。
[0245]
在一个实施方案中，根据本公开内容的aav病毒颗粒可以以10
8-10
14
vg/kg(vg：病毒基因组；kg：受试者或患者的体重)的范围内的量或剂量施用至人受试者或患者以治疗tau蛋白病，例如阿尔茨海默病。
[0246]
试剂盒
[0247]
在另一方面，本公开内容更进一步涉及在一个或多个容器中包含上文所述的核酸构建体、病毒载体、宿主细胞、病毒颗粒或药物组合物的试剂盒。此试剂盒可包含说明书或包装材料，其描述如何将包含在试剂盒中的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物施用至患者。试剂盒的容器可以是任何适合的材料，例如玻璃、塑胶、金属等，并可以具有任意适合的尺寸、形状或构造。在某些实施方案中，试剂盒可包含一个或多个安瓿或注射器，其包含适合的液体或溶液形式的本发明的产品。
[0248]
以举例说明的方式提供以下实施例，并且其目的并非在于限制本公开内容。
实施例
[0249]
用于测试并比较具有逆向运输的aav的体内散布测定
[0250]
使用生产raav的标准方法制备测试raav-gfp。测试raav-gfp使用在cag启动子控制下以gfp编码序列作为转基因并且具有aav2的itr的核酸构建体，所述核酸构建体用aav血清型的衣壳蛋白包装以测试其逆向运输性质。
[0251]
体内散布测定包括通过所述raav-gfp的脑实质内注射将测试raav-gfp注射至非人灵长类的连合后壳核中的第一步骤。
[0252]
接着，测定包括在注射后一个月计算在大脑皮质、黑质、杏仁核和尾状板内侧核中表达gfp的神经元的数量的步骤。细胞计数通过利用aiforia
tm
来进行，aiforia
tm
是为了在脑组织样本中的免疫过氧化酶染色的细胞的自动无偏计数而设计的全切片数字影像和深度卷积神经网络(cnn)算法(penttinen等人,european journal of neuroscience2018；48:2354-2361)。
[0253]
使用抗gfp抗体通过免疫过氧化氢酶染色使表达gfp的神经元可视化。表达gfp的神经元在被注射的非人灵长类的整个大脑中被自动计数。如图7a和图7b所示，gfp阳性的神经元的优先位置出现于大脑皮质的深层。除了皮质区域以外，将在神经支配被注射的连合后壳核的所有脑部区域，尤其是在黑质致密部、杏仁核和尾状板内侧核中的表达gfp的神经元定量(图7a至图13b)。
[0254]
1.小鼠中的研究
[0255]
本发明人已设计出以下基因疗法候选产品：
[0256]
编码在连续启动子gusb控制下的gba1基因的重组腺相关病毒载体血清型2/9(raav2/9-gba1)，例如使用下文描述的seq id no：4的构建体paav.ngusb.gba1。
[0257]
考虑到需要提高神经元和神经胶质细胞两者中的葡萄糖脑苷脂酶活性，驱使转基因表达的连续启动子(gusb)的选择在本文是优选的。
[0258]
病毒载体可有利地脑实质内传递，即病毒载体的施用可通过利用立体定位手术直接注射至需要的脑部区域来实现。
[0259]
更具体而言，本发明人假设葡萄糖脑苷脂酶的表达可能参与导致tau蛋白聚集的过程。
[0260]
作为对这种实用假说的概念证实，本发明人已经进行了实验，其中用重组腺相关病毒载体(aav)血清型9对野生型小鼠(n＝2)双侧注射至纹状体，所述重组腺相关病毒载体(aav)血清型9编码在神经元特异性突触素启动子的控制下的人tau蛋白的突变形式(tau301l)(raav2/9-tau301l)。各个纹状体接收1.0微升的1.22x10e13的病毒悬浮液。
[0261]
接下来，一旦在tau蛋白驱使的神经退行性过程已经在进行中但在达到非返回点(non-returning point)之前(例如递送raav2/9-tau301l后4周)，编码在连续启动子gusb控制下的gba1基因的重组aav2/9(raav2/9-gba1)被递送至右纹状体(1.0微升的1.25x 10e13的病毒悬浮液)，连同编码无转基因的空的对照raav2/9(r-aav2/9-空)被注射至左纹状体。3周后(例如在初次递送raav2/9-tau301l后8周)，处死动物并处理用于神经病理学分析。实验计划概述于图3。
[0262]
所进行的初步神经病理学分析揭示，raav2/9-gba1介导的葡萄糖脑苷脂酶的提升出乎意料地导致整个显示tau蛋白相关神经病理的脑部区域(即纹状体和大脑皮质)的tau蛋白聚集的几乎完全清除(图4)。
[0263]
2.aav-tt-gfp和aav9-gfp在非人灵长类脑部中的生物分布和比较性能
[0264]
2.1进行的实验
[0265]
对4只成年青年雄性食蟹猴(macaca fascicularis)灵长类(体重为3.0至3.4kg)注射5μl的aav-tt-gfp(1x 10
13
vg/ml；2只动物)或5μl的aav9-gfp(1x 10
13
vg/ml；2只动物)。aav均编码在cag启动子控制下的gfp。
[0266]
利用hamilton注射器通过心室摄影辅助的立体定位手术施用aav。以0.5μl/min的脉冲实现压力注射。在非人灵长类中，剂量被调整为较低范围。然而，在人体试验中，高注射速度允许病毒稳定，并且更好的患者管理和剂量可以是0.5μl至5μl/min的范围。一旦aav递送完成，注射针头额外放置10分钟，以使aav通过注射道的回流最小化(图5)。在手术即将进行之前，收集体液样品(血液和csf)并存放于-80℃。
[0267]
在通过心内灌注的aav递送后一个月处死动物。在处死之前，收集体液样品(血液和csf)并存放于-80℃。灌注物由林格盐溶液，以及随后的多聚甲醛的缓冲溶液(3,000ml/动物)和1,000ml的冷冻保护溶液所组成，所述冷冻保护溶液由在0.1m、ph 7.3的磷酸盐缓冲液中的10％甘油和1％ dmso制成。
[0268]
林格溶液灌注期间，新鲜组织样品(例如未固定的)从多个周围器官采取，这些包括心脏、肺、肝、脾、胰、肾、睾丸和纹状体肌肉。样品于干冰冷冻并存放于-80℃。
[0269]
一旦灌注完成，将大脑从头颅中移出，制作约1cm宽的脑块并储存于冷冻保护溶液中，冷冻保护溶液由在0.1m、ph 7.3的磷酸盐缓冲液中的20％甘油和2％ dmso制成(从所有脑块中移除软脑膜)。获得来自固定的周围器官(心脏、肺、肝、脾、胰、肾、睾丸、腹膜后神经节、松果腺和纹状体肌肉)的样品，并进一步将样品包埋于石蜡中。
[0270]
在冷冻保护溶液中至少48小时后，在切片机中制造10个系列的冷冻脑部冠状切片(40微米厚)并将其收集于冷冻保护溶液中。利用在兔子中获得的初级多克隆抗体处理一个完整系列的切片(例如包含猴脑的每第十个切片)以用于gfp的免疫过氧化酶检测。在与生物素化的山羊抗兔igg孵育后，接着使用abc试剂盒孵育切片，最后使用h2o
2-dab溶液染色。在染色完成后，将自由漂浮的切片置于显微镜载玻片上，风干过夜，并用entellan加盖玻片。使用aperio cs2切片扫描器(leica)扫描染色的切片并使用专用软件进行处里。
[0271]
2.2结果
[0272]
仅在已知神经支配连合后壳核的整个脑部区域发现aav-tt-gfp或aav9-gfp的标记，而在未神经支配注射位点的脑部区域(例如海马体、小脑等)没有观察到甚至单个标记的神经元。此外，所获得的逆向标记是“高尔基体样”形态，即神经元标记不限于体细胞，而是实际上延伸至远端的树突，尤其是在整个大脑皮质的位置中。值得注意的是有时甚至可看到小的树突过程，例如树突棘。
[0273]
在注射位点的事件
[0274]
aav-tt-gfp的两次注射均准确并且适当地位于连合后壳核的边界内。对于aav-tt-gfp所获得的注射位点的尺寸始终小于aav9-gfp的注射位点的尺寸，在动物m295和m296(注射aav-tt-gfp)中涵盖28.01％和21.83％，而在注射aav9-gfp的动物(m297和m298)中，注射位点内分别包含32.46％和55.86％的连合后壳核(图6)。aav-tt-gfp的两次注射均显示出完全缺乏通过注射道的aav摄取(例如这些均是非常干净的注射)。相较之下，使用aav9-gfp进行的注射显示出通过注射道的中至高的摄取，表示所获得的结果非常有可能因为连合后壳核上方的白质道摄取aav9-gfp而被假阳性标记污染(在皮质区域内可能尤其不佳)。图7b示出了与假阳性结果相关的问题。此外，在动物m297中aav9-gfp的递送已传播超出连合后壳核的边界，并且还包括外苍白球(gpe)的实质部分。
[0275]
逆向传播的潜力
[0276]
逆向标记的神经元的总数和观察到的强度均与注射位点的范围直接相关。换句话说，预期从覆盖连合后壳核的较大区域的注射位点有较多数量的gfp+神经元。在此方面，除了提供在感兴趣的各区域中所观察到的神经元的数量的准确的定量以外，还需要通过被注射位点覆盖的连合后壳核区域的范围来校正最终数量。基于使用进行的定量提供神经元的数量。为了试图适当地比较aav-tt相对aav9的性能，所获得的原始数据需要通过考虑注射位点的范围来标准化。因此，计算基于注射位点尺寸的校正因子以适当地估计各aav的预期的逆向传播。对于m295的校正因子是x3.57，对于m296的校正因子是x4.58，对于m297的校正因子是x3.08，对于m298的校正因子是x1.79。校正因子被使用于产生如图8-13中显示的数据。
[0277]
显示出最强标记的大脑区域
[0278]
在所有动物(aav-tt-gfp和aav9-gfp)中，在额上回和中央前回中观察到最强的标记(图8)。始终显示出gfp+神经元(尽管程度低)的其他皮质区域是带状前回皮质、中央后回和岛叶回。在额中回、额下回、眶额皮质(眶额、外侧眶区和内侧眶区)、颞上回、颞中回和颞下回以及在顶上小叶和缘上回中观察到稀疏的神经元标记。此外，在对侧的皮质中持续发现gfp+神经元是同侧皮质的类镜像呈现(明显包含少得多数量的gfp+神经元)。结果与所预期的结果完全一致并且事实上非常相关，注意在aav在连合后壳核(运动相关的壳核区域)中的递送后，在中央前回和额上回(皮质脑回分别包含主要运动皮质和辅助运动区域)均观察到最强的标记。关于皮下标记，有两个特别相关的结构，即黑质致密部(snc)和中央中核-束旁核复合体(cm-pf)。此外，在cm-pf中所观察到的gfp+神经元的数量相当可观，尽管已预期，但仍应注意cm-pf丘脑复合物是丘脑纹状体投射的主要来源。除了cm-pf以外，在腹前、腹外侧和腹后丘脑核、中央外侧和中央附近板内侧核和缝背核(小脑干核已知是对壳核的血清素源性投射的主要来源)中也可发现稀疏的标记。此外，在杏仁核复合物的水平观察到
的标记低于两个aav类型的最初预期。尽管杏仁核复合物常被视为传入壳核(以及皮质、视丘和黑质)的另一来源，但使用aav-tt和aav9所获得的数据清楚地提示此解剖途径的重要性在早期解剖研究中可能被高估。
[0279]
纹状体传入系统
[0280]
尽管本公开内容不是为此目的而设计，但所进行的量化允许数字上估计各个不同的纹状体传入系统(即皮质纹状体途径(同侧和对侧)、丘脑纹状体和黑质纹状体投射)的“重量”。所获得的数据显示出同侧的皮质纹状体投射到目前为止是最丰富的(平均占总纹状体的69.37％)，接着是对侧的皮质纹状体投射神经元(占总纹状体传入的15.99％)，接着是黑质纹状体投射(平均7.99％)，最后是源自中央中核-束旁核复合体的丘脑纹状体投射(6.67％)。在此方面，值得注意的是尽管对侧的皮质纹状体途径在关于基底神经节功能和功能障碍的大部分研究中常被忽略，但此投射大约呈现占总纹状体传入的16％，明显高于与丘脑纹状体和黑质纹状体投射相关的那些的百分比。
[0281]
与aav9-gfp相较的之下，所获得的结果支持aav-tt-gfp的优异的性能。结果的深入比较显示出相较于aav9而言，aav-tt是更好的候选者。aav-tt保有一些重要的优势，尤其是当在逆向传播方面具有较高的“潜力”以及缺乏通过注射道的摄取。使用aav-tt呈现出完全没有假阳性。
[0282]
用于实践本发明的序列
[0283]
实践本发明所使用的序列记载如下(非限制性列表)：
[0284]
seq id no：1：人gba1的编码核苷酸序列(实施例中使用的优化序列)
[0285]
atggctggcagtcttacaggtctcctgctcctgcaagctgtctcttgggcttctggggccaggccctgtatccccaaatcctttggatactcatctgtggtgtgtgtttgtaatgccacttattgtgatagctttgacccccccacctttcctgcactgggcaccttttcaaggtatgaatctaccaggtctgggaggaggatggagctgagtatggggcccatccaagcaaaccatactggcactggcttgctgctgacactgcaacctgaacagaagttccagaaagtgaagggctttggaggagccatgactgatgctgctgccctcaatattttggccctgagcccccctgctcagaatctccttttgaaatcatacttctctgaggagggaattggatacaatatcatcagggtgccaatggcctcatgtgactttagtattaggacttacacctatgctgatacccctgatgatttccagctgcataacttctcattgcctgaggaggataccaaattgaagatcccactcattcacagggccctgcaactggctcagagaccagtgtcattgctggcctccccctggacctccccaacttggctcaaaaccaatggggctgtcaatggtaagggctctcttaaggggcagcctggagacatttaccatcagacctgggccaggtattttgtgaagttcctggatgcttatgctgagcacaaattgcaattttgggctgttacagctgagaatgaaccctctgcaggactgctgtctggctatcctttccagtgcctgggctttacccctgagcatcagagggatttcattgccagggacctgggacctactcttgccaatagcacacaccataatgtgaggcttctgatgcttgatgaccagagacttctgctgccacactgggccaaggttgtcctgacagatcctgaggctgccaagtatgttcatgggattgctgtgcactggtatctggacttccttgctccagctaaggccaccctgggagaaacacacaggttgtttcccaatacaatgctttttgcatcagaggcctgtgtgggcagtaaattttgggagcagtctgttaggctggggagctgggatagaggaatgcaatactcccattctatcatcaccaatctgctctaccatgtggtggggtggactgactggaaccttgcccttaaccctgagggtggccccaattgggtcaggaattttgtggatagtcccatcattgtggatatcaccaaggacacattctataagcaaccaatgttctatcacctgggtcactttagtaagtttatccctgaggggtcccagagggtgggactggtggcttcccagaagaatgatctggatgctgtggccctgatgcaccctgatggcagtgctgtggttgttgttctcaatagaagctctaaagatgtgcccttgaccatcaaagatccagctgtgggatttctggaaacaatttcccctggttatagcatccacactta
cctttggagaaggcagtga
[0286]
seq id no：2：ngusb启动子核苷酸序列
[0287]
attcctgctgggaaaagcaagtggaggtgctccttgaagaaacagggggatcccaccgatctcaggggttctgttctggcctgcggccctggatcgtccagcctgggtcggggtggggagcagacctcgcccttatcggctggggctgagggtgagggtcccgtttccccaaaggcctagcctggggttccagccacaagccctaccgggcagcgcccggccccgcccctccaggcctggcactcgtcctcaaccaagatggcgcggatggcttcaggcgcatcacgacaccggcgcgtcacgcgacccgccctacgggcacctcccgcgcttttcttagcgccgcagacggtggccgagcgggggaccgggaagcatggcccgggct
[0288]
seq id no：3：牛生长激素基因(bgh)多腺苷酸化信号
[0289]
gccctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgcact
[0290]
seq id no：4：paav.ngusb.gba1核苷酸序列
[0291]
tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcg
[0292]
taaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtg
[0293]
cgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgcc
[0294]
agggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtacctcgcgaatgcatc
[0295]
tagaggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccg
[0296]
ggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactagggg
[0297]
ttcctggaggggtggagtcgtgacagatctgaattcctgctgggaaaagcaagtggaggtgctccttgaag
[0298]
aaacagggggatcccaccgatctcaggggttctgttctggcctgcggccctggatcgtccagcctgggtcg
[0299]
gggtggggagcagacctcgcccttatcggctggggctgagggtgagggtcccgtttccccaaaggcctagc
[0300]
ctggggttccagccacaagccctaccgggcagcgcccggccccgcccctccaggcctggcactcgtcctca
[0301]
accaagatggcgcggatggcttcaggcgcatcacgacaccggcgcgtcacgcgacccgccctacgggcacc
[0302]
tcccgcgcttttcttagcgccgcagacggtggccgagcgggggaccgggaagcatggcccgggctgcagct
[0303]
ctaaggtaaatataaaatttttaagtgtataatgtgttaaactactgattctaattgtttctctctttt
ag
[0304]
attccaacctttggaactcaattcagccaccatggctggcagtcttacaggtctcctgctcctgcaagctg
[0305]
tctcttgggcttctggggccaggccctgtatccccaaatcctttggatactcatctgtggtgtgtgtttgt
[0306]
aatgccacttattgtgatagctttgacccccccacctttcctgcactgggcaccttttcaaggtatgaatc
[0307]
taccaggtctgggaggaggatggagctgagtatggggcccatccaagcaaaccatactggcactggcttgc
[0308]
tgctgacactgcaacctgaacagaagttccagaaagtgaagggctttggaggagccatgactgatgctgct
[0309]
gccctcaatattttggccctgagcccccctgctcagaatctccttttgaaatcatacttctctgaggaggg
[0310]
aattggatacaatatcatcagggtgccaatggcctcatgtgactttagtattaggacttacacctatgctg
[0311]
atacccctgatgatttccagctgcataacttctcattgcctgaggaggataccaaattgaagatcccactc
[0312]
attcacagggccctgcaactggctcagagaccagtgtcattgctggcctccccctggacctccccaacttg
[0313]
gctcaaaaccaatggggctgtcaatggtaagggctctcttaaggggcagcctggagacatttaccatcaga
[0314]
cctgggccaggtattttgtgaagttcctggatgcttatgctgagcacaaattgcaattttgggctgttaca
[0315]
gctgagaatgaaccctctgcaggactgctgtctggctatcctttccagtgcctgggctttacccctgagca
[0316]
tcagagggatttcattgccagggacctgggacctactcttgccaatagcacacaccataatgtgaggcttc
[0317]
tgatgcttgatgaccagagacttctgctgccacactgggccaaggttgtcctgacagatcctgaggctgcc
[0318]
aagtatgttcatgggattgctgtgcactggtatctggacttccttgctccagctaaggccaccctgggaga
[0319]
aacacacaggttgtttcccaatacaatgctttttgcatcagaggcctgtgtgggcagtaaattttgggagc
[0320]
agtctgttaggctggggagctgggatagaggaatgcaatactcccattctatcatcaccaatctgctctac
[0321]
catgtggtggggtggactgactggaaccttgcccttaaccctgagggtggccccaattgggtcaggaattt
[0322]
tgtggatagtcccatcattgtggatatcaccaaggacacattctataagcaaccaatgttctatcacctgg
[0323]
gtcactttagtaagtttatccctgaggggtcccagagggtgggactggtggcttcccagaagaatgatctg
[0324]
gatgctgtggccctgatgcaccctgatggcagtgctgtggttgttgttctcaatagaagctctaaagatgt
[0325]
gcccttgaccatcaaagatccagctgtgggatttctggaaacaatttcccctggttatagcatccacactt
[0326]
acctttggagaaggcagtgaaaatgaaggcctgataattgcaccaccaggcctgataggccctgtgccttc
[0327]
tagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactg
[0328]
tcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggg
[0329]
gtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgcactagtccactccctctctgc
[0330]
gcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctca
[0331]
gtgagcgagcgagcgcgcagagagggatctagatatcggatcccgggcccgtcgactgcagaggcctgcat
[0332]
gcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaa
[0333]
catacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgt
[0334]
tgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcg
[0335]
gggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcg
[0336]
gctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcag
[0337]
gaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttc
[0338]
cataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacagg
[0339]
actataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgctta
[0340]
ccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctc
[0341]
agttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgc
[0342]
cttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccac
tg
[0343]
gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggc
[0344]
tacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtag
[0345]
ctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgca
[0346]
gaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactca
[0347]
cgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaag
[0348]
ttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtc
[0349]
seq id no：5：没有信号肽序列(如由seq id no：1编码)的人葡萄糖脑苷脂酶的氨基酸序列
[0350]
arpcipksfgyssvvcvcnatycdsfdpptfpalgtfsryestrsgrrmelsmgpiqanhtgtgllltlqpeqkfqkvkgfggamtdaaalnilalsppaqnlllksyfseegigyniirvpmascdfsirtytyadtpddfqlhnfslpeedtklkiplihralqlaqrpvsllaspwtsptwlktngavngkgslkgqpgdiyhqtwaryfvkfldayaehklqfwavtaenepsagllsgypfqclgftpehqrdfiardlgptlansthhnvrllmlddqrlllphwakvvltdpeaakyvhgiavhwyldflapakatlgethrlfpntmlfaseacvgskfweqsvrlgswdrgmqyshsiitnllyhvvgwtdwnlalnpeggpnwvrnfvdspiivditkdtfykqpmfyhlghfskfipegsqrvglvasqkndldavalmhpdgsavvvvlnrsskdvpltikdpavgfletispgysihtylwrrq
[0351]
seq id no：6：含有短信号肽(如由seq id no：1编码)的人葡萄糖脑苷脂酶的完整氨基酸序列
[0352]
magsltgllllqavswasgarpcipksfgyssvvcvcnatycdsfdpptfpalgtfsryestrsgrrmelsmgpiqanhtgtgllltlqpeqkfqkvkgfggamtdaaalnilalsppaqnlllksyfseegigyniirvpmascd
fsirtytyadtpddfqlhnfslpeedtklkiplihralqlaqrpvsllaspwtsptwlktngavngkgslkgqpgdiyhqtwaryfvkfldayaehklqfwavtaenepsagllsgypfqclgftpehqrdfiardlgptlansthhnvrllmlddqrlllphwakvvltdpeaakyvhgiavhwyldflapakatlgethrlfpntmlfaseacvgskfweqsvrlgswdrgmqyshsiitnllyhvvgwtdwnlalnpeggpnwvrnfvdspiivditkdtfykqpmfyhlghfskfipegsqrvglvasqkndldavalmhpdgsavvvvlnrsskdvpltikdpavgfletispgysihtylwrrq
[0353]
seq id no：7：人gba1基因的编码序列的完整核苷酸序列(野生型)人葡萄糖脑苷脂酶mrna,完整cds
[0354]
genbank:m19285.1
[0355]
＞m19285.1:123-1733人葡萄糖脑苷脂酶mrna,完整cds
[0356]
atggagttttcaagtccttccagagaggaatgtcccaagcctttgagtagggtaagcatcatggctggcagcctcacaggtttgcttctacttcaggcagtgtcgtgggcatcaggtgcccgcccctgcatccctaaaagcttcggctacagctcggtggtgtgtgtctgcaatgccacatactgtgactcctttgaccccccgacctttcctgcccttggtaccttcagccgctatgagagtacacgcagtgggcgacggatggagctgagtatggggcccatccaggctaatcacacgggcacaggcctgctactgaccctgcagccagaacagaagttccagaaagtgaagggatttggaggggccatgacagatgctgctgctctcaacatccttgccctgtcaccccctgcccaaaatttgctacttaaatcgtacttctctgaagaaggaatcggatataacatcatccgggtacccatggccagctgtgacttctccatccgcacctacacctatgcagacacccctgatgatttccagttgcacaacttcagcctcccagaggaagataccaagctcaagatacccctgattcaccgagccctgcagttggcccagcgtcccgtttcactccttgccagcccctggacatcacccacttggctcaagaccaatggagcggtgaatgggaaggggtcactcaagggacagcccggagacatctaccaccagacctgggccagatactttgtgaagttcctggatgcctatgctgagcacaagttacagttctgggcagtgacagctgaaaatgagccttctgctgggctgttgagtggataccccttccagtgcctgggcttcacccctgaacatcagcgagacttcattgcccgtgacctaggtcctaccctcgccaacagtactcaccacaatgtccgcctactcatgctggatgaccaacgcttgctgctgccccactgggcaaaggtggtactgacagacccagaagcagctaaatatgttcatggcattgctgtacattggtacctggactttctggctccagccaaagccaccctaggggagacacaccgcctgttccccaacaccatgctctttgcctcagaggcctgtgtgggctccaagttctgggagcagagtgtgcggctaggctcctgggatcgagggatgcagtaca
[0357]
gccacagcatcatcacgaacctcctgtaccatgtggtcggctggaccgactggaaccttgccctgaacccc
[0358]
gaaggaggacccaattgggtgcgtaactttgtcgacagtcccatcattgtagacatcaccaaggacacgtt
[0359]
ttacaaacagcccatgttctaccaccttggccacttcagcaagttcattcctgagggctcccagagagtgg
[0360]
ggctggttgccagtcagaagaacgacctggacgcagtggcactgatgcatcccgatggctctgctgttgtg
[0361]
gtcgtgctaaaccgctcctctaaggatgtgcctcttaccatcaaggatcctgctgtgggcttcctggagac
[0362]
aatctcacctggctactccattcacacctacctgtggcatcgccagtga
[0363]
seq id no：8：包含长信号肽的人葡萄糖脑苷脂酶的完整氨基酸序列
[0364]
mefsspsreecpkplsrvsimagsltgllllqavswasgarpcipksfgyssvvcvcnatycdsfdpptfp
[0365]
algtfsryestrsgrrmelsmgpiqanhtgtgllltlqpeqkfqkvkgfggamtdaaalnilalsppaqnl
[0366]
llksyfseegigyniirvpmascdfsirtytyadtpddfqlhnfslpeedtklkiplihralqlaqrpvsl
[0367]
laspwtsptwlktngavngkgslkgqpgdiyhqtwaryfvkfldayaehklqfwavtaenepsagllsgyp
[0368]
fqclgftpehqrdfiardlgptlansthhnvrllmlddqrlllphwakvvltdpeaakyvhgiavhwyldf
[0369]
lapakatlgethrlfpntmlfaseacvgskfweqsvrlgswdrgmqyshsiitnllyhvvgwtdwnlalnp
[0370]
eggpnwvrnfvdspiivditkdtfykqpmfyhlghfskfipegsqrvglvasqkndldavalmhpdgsavv
[0371]
vvlnrsskdvpltikdpavgfletispgysihtylwrrq
[0372]
seq id no：9：cag启动子的核苷酸序列
[0373]
ctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataa
[0374]
cttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgt
[0375]
tcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccact
[0376]
tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcc
[0377]
tggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgc
[0378]
tattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaa
[0379]
ttttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgcca
[0380]
ggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcgg
[0381]
cgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggc
[0382]
gggcg
[0383]
seq id no：10：编码gfp的核苷酸序列
[0384]
atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaa
[0385]
cggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttca
[0386]
tctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcag
tgc
[0387]
ttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtcca
[0388]
ggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgaca
[0389]
ccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctg
[0390]
gagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaactt
[0391]
caagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcg
[0392]
gcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaac
[0393]
gagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagct
[0394]
gtacaagtga
[0395]
seq id no：11：人gba1的编码核苷酸序列(idt优化序列)
[0396]
atggagttctcatctccctcacgagaagaatgtccgaaacctctttcaagagtaagcatcatggccggcag
[0397]
cttgaccggtcttttgttgttgcaggccgtgtcctgggcctcaggtgctaggccatgcattcctaaatcct
[0398]
tcggctatagtagcgtggtttgcgtctgcaacgccacatactgtgacagtttcgatccacctaccttccca
[0399]
gcgctgggtaccttctcacggtatgaatcaacgcgatcagggcgcagaatggaactttcaatggggccaat
[0400]
ccaagctaaccacacgggaacgggtcttctgctgacgctccaaccggaacaaaagttccaaaaggtaaaag
[0401]
gctttggaggtgcgatgactgatgccgcagcactcaacatcctggcgctctcaccgccggcacaaaatttg
[0402]
ctgttgaagagttatttctcagaagaagggatcggttacaacatcatacgggtcccgatggcgagctgtga
[0403]
cttttctataagaacatatacctatgcggatacgcccgacgatttccaacttcataattttagtctgcctg
[0404]
aggaagacacaaagttgaagataccgctgatacacagagcattgcagcttgctcaacgaccggtcagcttg
[0405]
cttgccagcccatggacaagtccaacatggcttaagaccaatggcgcggttaatggcaagggatccctgaa
[0406]
gggccagccgggagacatctatcatcaaacttgggcgcggtattttgtcaagttcttggacgcctacgctg
[0407]
agcacaaactgcagttctgggccgttaccgccgaaaatgaaccatccgccggactgctttctggctaccct
[0408]
ttccaatgtcttggctttacgcctgaacaccaaagagacttcattgctcgggaccttggtccaacgctcgc
[0409]
gaacagtactcatcataatgtacgactcttgatgctcgatgaccagcgactgttgcttccacattgggcca
[0410]
aggtagttctgaccgaccccgaagccgctaaatacgtccacggcattgctgtccattggtaccttgacttt
[0411]
ttggctcccgcaaaagccactctgggtgaaacacacagactctttccaaacacgatgcttttcgcatcaga
[0412]
agcctgcgtcggaagtaaattttgggaacagtcagtaaggttgggtagttgggatcgcgggatgcaatata
[0413]
gtcatagcattattaccaacttgctttatcacgtcgttgggtggacagattggaacctcgcgttgaatcct
[0414]
gaaggcggccctaattgggtaagaaactttgttgattcacctattatcgtcgacataaccaaggacacatt
[0415]
ctacaagcaaccgatgttctatcaccttgggcatttcagtaaattcataccagagggcagccagcgcgtcg
[0416]
ggttggtagcctctcaaaaaaacgatttggatgcggtcgctctgatgcatcccgacgggagcgcagtagtc
[0417]
gttgtccttaaccgaagctccaaggatgtacccctcacgattaaggaccctgctgtcgggttccttgaaac
[0418]
tataagtcccggctatagtattcatacttatctctggagaagacagtga
[0419]
seq id no：12：编码人gba1的核苷酸序列(genscript优化序列)
[0420]
atggagttttcaagcccctcacgggaagagtgccctaagcccctgtcacgggtctcaattatggccgggag
[0421]
cctgactggcctgctgctgctgcaggccgtgagctgggcatcaggagccaggccttgcatcccaaagtctt
[0422]
tcggctacagctccgtggtgtgcgtgtgcaacgccacctattgtgactccttcgatccccctacctttccc
[0423]
gccctgggcacattttctagatacgagtctacacgcagcggccggagaatggagctgagcatgggccctat
[0424]
ccaggccaatcacaccggaacaggcctgctgctgaccctgcagccagagcagaagttccagaaggtgaagg
[0425]
gctttggaggagcaatgacagacgcagccgccctgaacatcctggccctgtccccacccgcccagaatctg
[0426]
ctgctgaagtcctacttctctgaggagggcatcggctataacatcatccgggtgcccatggccagctgcga
[0427]
cttttccatcagaacctacacatatgccgatacccctgacgatttccagctgcacaatttttccctgcc
ag
[0428]
aggaggatacaaagctgaagatccccctgatccaccgggccctgcagctggcacagcggcccgtgagcctg
[0429]
ctggccagcccctggacctcccctacatggctgaagaccaacggcgccgtgaatggcaagggctctctgaa
[0430]
gggacagccaggcgacatctaccaccagacatgggccagatatttcgtgaagtttctggatgcctacgccg
[0431]
agcacaagctgcagttctgggccgtgaccgcagagaacgagccttctgccggcctgctgagcggctatccc
[0432]
ttccagtgcctgggctttacacctgagcaccagcgggactttatcgccagagatctgggcccaaccctggc
[0433]
caactccacacaccacaatgtgaggctgctgatgctggacgatcagcgcctgctgctgcctcactgggcca
[0434]
aggtggtgctgaccgacccagaggccgccaagtacgtgcacggcatcgccgtgcactggtatctggatttc
[0435]
ctggcaccagcaaaggccaccctgggagagacacaccggctgttccctaacaccatgctgtttgccagcga
[0436]
ggcctgcgtgggctccaagttttgggagcagtccgtgaggctgggatcttgggacaggggcatgcagtact
[0437]
cccactctatcatcaccaatctgctgtatcacgtggtgggctggacagactggaacctggccctgaatcca
[0438]
gagggcggccccaactgggtgagaaatttcgtggatagccccatcatcgtggacatcaccaaggatacatt
[0439]
ctacaagcagccaatgttttatcacctgggccacttctctaagtttatcccagagggcagccagagggtgg
[0440]
gcctggtggccagccagaagaacgacctggatgccgtggccctgatgcaccctgatggctccgccgtggtg
[0441]
gtggtgctgaatcgctctagcaaggacgtgcctctgaccatcaaggatccagccgtgggcttcctggagac
[0442]
tatttcccccggctattcaattcatacctatctgtggagaaggcagtga
[0443]
seq id no：13：hsyn启动子的核苷酸序列(ncbi ref.ng_008437.1)
[0444]
agtgcaagtgggttttaggaccaggatgaggcggggtgggggtgcctacctgacgaccgaccccgacccac
[0445]
tggacaagcacccaacccccattccccaaattgcgcatcccctatcagagagggggaggggaaacaggatg
[0446]
cggcgaggcgcgtgcgcactgccagcttcagcaccgcggacagtgccttcgcccccgcctggcggcgcgcg
[0447]
ccaccgccgcctcagcactgaaggcgcgctgacgtcactcgccggtcccccgcaaactccccttcccggcc
[0448]
accttggtcgcgtccgcgccgccgccggcccagccggaccgcaccacgcgaggcgcgagataggggggcac
[0449]
gggcgcgaccatctgcgctgcggcgccggcgactcagcgctgcctcagtctgcggtgggcagcggaggagt
[0450]
cgtgtcgtgcctgagagcgcag
[0451]
seq id no：14：aav tt衣壳蛋白的氨基酸序列
[0452]
maadgylpdwledtlsegirqwwklkpgppppkpaerhkddsrglvlpgykylgpfngldkgepvneadaa
[0453]
alehdkaydrqldsgdnpylkynhadaefqerlkedtsfggnlgravfqakkrileplglveepvktapgk
[0454]
krpvehspaepdsssgtgksgqqparkrlnfgqtgdadsvpdpqplgqppaapsglgtntmasgsgapmad
[0455]
nnegadgvgnssgnwhcdstwmgdrvittstrtwalptynnhlykqissqsgasndnhyfgystpwgyfdf
[0456]
nrfhchfsprdwqrlinnnwgfrpkrlsfklfniqvkevtqndgtttiannltstvqvftdseyqlpyvlg
[0457]
sahqgclppfpadvfmvpqygyltlnngsqavgrssfycleyfpsqmlrtgnnftfsytfedvpfhssyah
[0458]
sqsldrlmnplidqylyylsrtntpsgtttmsrlqfsqagasdirdqsrnwlpgpcyrqqrvsktaadnnnsdyswtgatkyhlngrdslvnpgpamashkddeekyfpqsgvlifgkqdsgktnvdiekvmitdeeeirttnpvateqygsvstnlqsgntqaatsdvntqgvlpgmvwqdrdvylqgpiwakiphtdghfhpsplmggfglkhpppqilikntpvpanpsttfsaakfasfitqystgqvsveiewelqkenskrwnpeiqytsnynksvnvdftvdtngvyseprpigtryltrnl
[0459]
seq id no：15：aav2的flip itr的核苷酸序列
[0460]
ttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct
[0461]
seq id no：16：aav2的flop itr的核苷酸序列
[0462]
aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaa
[0463]
seq id no：17：人gba1同种型2氨基酸序列(ncbi ref.np_001165282.1)
[0464]
melsmgpiqanhtgtgllltlqpeqkfqkvkgfggamtdaaalnilalsppaqnlllksyfseegigyniirvpmascdfsirtytyadtpddfqlhnfslpeedtklkiplihralqlaqrpvsllaspwtsptwlktngavngkgslkgqpgdiyhqtwaryfvkfldayaehklqfwavtaenepsagllsgypfqclgftpehqrdfiardlgptlansthhnvrllmlddqrlllphwakvvltdpeaakyvhgiavhwyldflapakatlgethrlfpntmlfaseacvgskfweqsvrlgswdrgmqyshsiitnllyhvvgwtdwnlalnpeggpnwvrnfvdspiivditkdtfykqpmfyhlghfskfipegsqrvglvasqkndldavalmhpdgsavvvvlnrsskdvpltikdpavgfletispgysihtylwrrq
[0465]
seq id no：18：人gba1同种型3氨基酸序列(ncbi ref.np_001165283.1)
[0466]
mefsspsreecpkplsrvsimagsltgllllqavswasgarpcipksfgyssvvcvcnatycdsfdpptfpalgtfsryestrsgrrmelsmgpiqanhtgtgigyniirvpmascdfsirtytyadtpddfqlhnfslpeedtkl
kiplihralqlaqrpvsllaspwtsptwlktngavngkgslkgqpgdiyhqtwaryfvkfldayaehklqfwavtaenepsagllsgypfqclgftpehqrdfiardlgptlansthhnvrllmlddqrlllphwakvvltdpeaakyvhgiavhwyldflapakatlgethrlfpntmlfaseacvgskfweqsvrlgswdrgmqyshsiitnllyhvvgwtdwnlalnpeggpnwvrnfvdspiivditkdtfykqpmfyhlghfskfipegsqrvglvasqkndldavalmhpdgsavvvvlnrsskdvpltikdpavgfletispgysihtylwrrq
[0467]
seq id no：19：人gba1基因的编码序列的完整核苷酸序列
[0468]
atggagttttcaagtccttccagagaggaatgtcccaagcctttgagtagggtaagcatcatggctggcagcctcacaggattgcttctacttcaggcagtgtcgtgggcatcaggtgcccgcccctgcatccctaaaagcttcggctacagctcggtggtgtgtgtctgcaatgccacatactgtgactcctttgaccccccgacctttcctgcccttggtaccttcagccgctatgagagtacacgcagtgggcgacggatggagctgagtatggggcccatccaggctaatcacacgggcacaggcctgctactgaccctgcagccagaacagaagttccagaaagtgaagggatttggaggggccatgacagatgctgctgctctcaacatccttgccctgtcaccccctgcccaaaatttgctacttaaatcgtacttctctgaagaaggaatcggatataacatcatccgggtacccatggccagctgtgacttctccatccgcacctacacctatgcagacacccctgatgatttccagttgcacaacttcagcctcccagaggaagataccaagctcaagatacccctgattcaccgagccctgcagttggcccagcgtcccgtttcactccttgccagcccctggacatcacccacttggctcaagaccaatggagcggtgaatgggaaggggtcactcaagggacagcccggagacatctaccaccagacctgggccagatactttgtgaagttcctggatgcctatgctgagcacaagttacagttctgggcagtgacagctgaaaatgagccttctgctgggctgttgagtggataccccttccagtgcctgggcttcacccctgaacatcagcgagacttcattgcccgtgacctaggtcctaccctcgccaacagtactcaccacaatgtccgcctactcatgctggatgaccaacgcttgctgctgccccactgggcaaaggtggtactgacagacccagaagcagctaaatatgttcatggcattgctgtacattggtacctggactttctggctccagccaaagccaccctaggggagacacaccgcctgttccccaacaccatgctctttgcctcaga
[0469]
ggcctgtgtgggctccaagttctgggagcagagtgtgcggctaggctcctgggatcgagggatgcagtaca
[0470]
gccacagcatcatcacgaacctcctgtaccatgtggtcggctggaccgactggaaccttgccctgaacccc
[0471]
gaaggaggacccaattgggtgcgtaactttgtcgacagtcccatcattgtagacatcaccaaggacacgtt
[0472]
ttacaaacagcccatgttctaccaccttggccacttcagcaagttcattcctgagggctcccagagagtgg
[0473]
ggctggttgccagtcagaagaacgacctggacgcagtggcactgatgcatcccgatggctctgctgttgtg
[0474]
gtcgtgctaaaccgctcctctaaggatgtgcctcttaccatcaaggatcctgctgtgggcttcctggagac
[0475]
aatctcacctggctactccattcacacctacctgtggcgtcgccagtga
[0476]
seq id no：20：ngusb启动子#2的核苷酸序列
[0477]
attcctgctgggaaaagcaagtggaggtgctccttgaagaaacagggggatcccaccgatctcaggggttc
[0478]
tgttctggcctgcggccctggatcgtccagcctgggtcggggtggggagcagacctcgcccttatcggc
tg
[0479]
gggctgagggtgagggtcccgtttccccaaaggcctagcctggggttccagccacaagccctaccgggcag
[0480]
cgcccggccccgcccctccaggcctggcactcgtcctcaaccaagatggcgcggatggcttcaggcgcatc
[0481]
acgacaccggcgcgtcacgcgacccgccctacgggcacctcccgcgcttttcttagcgccgcagacggtgg
[0482]
ccgagcgggggaccgggaagc
[0483]
seq id no：21：cag启动子#2的核苷酸序列
[0484]
ctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataa
[0485]
cttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgt
[0486]
tcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccact
[0487]
tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcc
[0488]
tggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgc
[0489]
tattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaa
[0490]
ttttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgcca
[0491]
ggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcgg
[0492]
cgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggc
[0493]
gggcgggagtcgctgcgacgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccg
[0494]
gctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagc
[0495]
gcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccct
[0496]
ttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgc
[0497]
gctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgagggga
[0498]
gcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtg
[0499]
tgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctcccc
[0500]
gagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccg
[0501]
ggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcggggga
[0502]
ggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggt
[0503]
aatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgc
[0504]
cgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggcct
[0505]
tcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgcc
[0506]
ttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaac
[0507]
catgttcatgccttcttctttttcctacag
[0508]
seq id no：22：短形式版人泛素c(ubc)启动子的核苷酸序列
[0509]
ggcctccgcgccgggttttggcgcctcccgcgggcgcccccctcctcacggcgagcgctgccacgtcagac
[0510]
gaagggcgcagcgagcgtcctgatccttccgcccggacgctcaggacagcggcccgctgctcataagactc
[0511]
ggccttagaaccccagtatcagcagaaggacattttaggacgggacttgggtgactctagggcactggttt
[0512]
tctttccagagagcggaacaggcgaggaaaagtagtcccttctcggcgattctgcggagggatctccgtgg
[0513]
ggcggtgaacgccgatgattatataaggacgcgccgggtgtggcacagctagttccgtcgcagccgggatt
[0514]
tgggtcgcggttcttgtttgtggatcgctgtgatcgtcacttggt
[0515]
seq id no：23：长形式人泛素c(ubc)启动子的核苷酸序列
[0516]
ccggaggcgcggcccaaaaccgcggagggcgcccgcggggggaggagtgccgctcgcgacggtgcagtctg
[0517]
cttcccgcgtcgctcgcaggactaggaaggcgggcctgcgagtcctgtcgccgggcgacgagtattctgag
[0518]
ccggaatcttggggtcatagtcgtcttcctgtaaaatcctgccctgaacccactgagatcccgtgaccaaa
[0519]
agaaaggtctctcgccttgtccgctccttttcatcagggaagagccgctaagacgcctccctagaggcacc
[0520]
ccgccacttgcggctactaatatattcctgcgcggcccacaccgtgtcgatcaaggcagcgtcggccc
taa
[0521]
acccagcgccaagaacaaacacctagcgacactagcagtgaaccactcatcgcccgacgacccgaccggcc
[0522]
ccgaaagcaccggcggcccggcgagccaccctgccttcgcacacctctctggcggttcccgacatcagacc
[0523]
caggcgctcgttccaacgggacttgacccccaacccccctcgcgtcgttttaccgccgacaagggctcaga
[0524]
acttaccttctgcgaacactccgcccgacactccagcaactttgttccaccccccgtaccacccgccgttc
[0525]
ttgggttccagaactccggaagcgattacgccctttcgagaataagcccactctacccgaccccgtggtag
[0526]
acccctgggactgcacttcaaacagtgactgacctcttgagccaaacagcagacaacgcccccgccgtcaa
[0527]
taccgccacggcaacccgtcacgtgggcatggaaaccctcgcgcgcgggagcagcacagcactgcagtggg
[0528]
caagacaaccgaatattacgtcccaccccggtggacggccatccacacgccatccgaaaagaggcagcgtc
[0529]
ctgcgtcccaagcccggatcccatccgagaggacttagctgtccgcggcctggagaccactcccctcccta
[0530]
ttcactccgcagtcaaagaaaccagccaaaatacatggatagaagaattcatcgacttcgaggccaaaact
[0531]
tgatacgcgagccccaaccgctcacacaaaacacttcaaaaaatccgtggaaaactttacattagtaaacc
[0532]
cagttatacattaaaagtcacaatctgatcatttaacaggcgatttaagaccggcaaaaaccgaaaaaaca
[0533]
atctg
[0534]
seq id no：24：磷酸甘油酸激酶1(pgk)启动子的核苷酸序列
[0535]
gacccctctctccagccactaagccagttgctccctcggctgacggctgcacgcgaggcctccgaacgtct
[0536]
tacgccttgtggcgcgcccgtccttgtcccgggtgtgatggcggggtgtggggcggagggcgtggcgggga
[0537]
agggccggcgacgagagccgcgcgggacgactcgtcggcgataaccggtgtcgggtagcgccagccgcgcg
[0538]
acggtaacgagggaccgcgacaggcagacgctcccatgatcactctgcacgccgaaggcaaacagtgcagg
[0539]
ccgtgcggcgcttggcgttccttggaagggctgaatccccgcctcgtccttcgcagcggccccccgggtgt
[0540]
tcccatcgccgcttctaggcccactgcgacgcttgcctgcacttcttacacgctctgggtcccagccgcgg
[0541]
cgacgcaaagggccttggtgcgggtctcgtcggcgcagggacgcgtttgggtcccgacggaaccttttccg
[0542]
cgttggggttgggg
[0543]
seq id no：25：cba/cbh启动子#1的核苷酸序列
[0544]
agatgtactgccaagtaggaaagtcccgtaaggtcatgtactgggcataatgccaggcgggccatttaccg
[0545]
tcattgacgtcaatagggggcgtacttggcatatgatacacttgatgtactgccaagtgggcagtttaccg
[0546]
taaatactccacccattgacgtcaatggaaagtccctattggcgttactatgggaacatacgtcattattg
[0547]
acgtcaatgggcgggggtcgttgggcggtcagccaggcgggccatttaccgtaagttatgtaacgcggaac
[0548]
tccatatatgggctatgaactaatgaccccgtaattgattactattaaccacgttctgcttcactctcccc
[0549]
atctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggc
[0550]
ggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggt
[0551]
gcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggcc
[0552]
ctataaaaagcgaagcgcgcggcggaactgaaaaaccagaaagttaactggtaagtttagtctttttgtct
[0553]
tttatttcaggtcctggtggtgcaaatcaaagaactgctcctcagtggatgttgcctttacttctaggcct
[0554]
gtacggaagtgttacttctgctctaaaagct
[0555]
seq id no：26：cba/cbh启动子#2的核苷酸序列
[0556]
agatgtactgccaagtaggaaagtcccgtaaggtcatgtactgggcataatgccaggcgggccatttaccg
[0557]
tcattgacgtcaatagggggcgtacttggcatatgatacacttgatgtactgccaagtgggcagtttaccg
[0558]
taaatactccacccattgacgtcaatggaaagtccctattggcgttactatgggaacatacgtcattattg
[0559]
acgtcaatgggcgggggtcgttgggcggtcagccaggcgggccatttaccgtaagttatgtaacgcggaac
[0560]
tccatatatgggctatgaactaatgaccccgtaattgattactattaaccacgttctgcttcactctcccc
[0561]
atctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggc
[0562]
ggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagag
gt
[0563]
gcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggcc
[0564]
ctataaaaagcgaagcgcgcggcggggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcct
[0565]
cgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcct
[0566]
ccgggctgtaattagcaagaggtaagggtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattacc
[0567]
tgttttacaggcctgaaatcacttggttttaggttgg
[0568]
seq id no：27：编码gfp的核苷酸序列#2
[0569]
atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaa
[0570]
cggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttca
[0571]
tctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgc
[0572]
ttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtcca
[0573]
ggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgaggacgaca
[0574]
ccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctg
[0575]
gagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaactt
[0576]
caagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcg
[0577]
gcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaac
[0578]
gagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagct
[0579]
gtacaagtaaseq id no：28：长形式人泛素c(ubc)启动子#2的核苷酸序列
[0580]
ggcctccgcgccgggttttggcgcctcccgcgggcgcccccctcctcacggcgagcgctgccacgtcagac
[0581]
gaagggcgcagcgagcgtcctgatccttccgcccggacgctcaggacagcggcccgctgctcataagactc
[0582]
ggccttagaaccccagtatcagcagaaggacattttaggacgggacttgggtgactctagggcactggttt
[0583]
tctttccagagagcggaacaggcgaggaaaagtagtcccttctcggcgattctgcggagggatctccg
tgg
[0584]
ggcggtgaacgccgatgattatataaggacgcgccgggtgtggcacagctagttccgtcgcagccgggatt
[0585]
tgggtcgcggttcttgtttgtggatcgctgtgatcgtcacttggtgagtagcgggctgctgggctggccgg
[0586]
ggctttcgtggccgccgggccgctcggtgggacggaagcgtgtggagagaccgccaagggctgtagtctgg
[0587]
gtccgcgagcaaggttgccctgaactgggggttggggggagcgcagcaaaatggcggctgttcccgagtct
[0588]
tgaatggaagacgcttgtgaggcgggctgtgaggtcgttgaaacaaggtggggggcatggtgggcggcaag
[0589]
aacccaaggtcttgaggccttcgctaatgcgggaaagctcttattcgggtgagatgggctggggcaccatc
[0590]
tggggaccctgacgtgaagtttgtcactgactggagaactcggtttgtcgtctgttgcgggggcggcagtt
[0591]
atggcggtgccgttgggcagtgcacccgtacctttgggagcgcgcgccctcgtcgtgtcgtgacgtcaccc
[0592]
gttctgttggcttataatgcagggtggggccacctgccggtaggtgtgcggtaggcttttctccgtcgcag
[0593]
gacgcagggttcgggcctagggtaggctctcctgaatcgacaggcgccggacctctggtgaggggagggat
[0594]
aagtgaggcgtcagtttctttggtcggttttatgtacctatcttcttaagtagctgaagctccggttttga
[0595]
actatgcgctcggggttggcgagtgtgttttgtgaagttttttaggcaccttttgaaatgtaatcatttgg
[0596]
gtcaatatgtaattttcagtgttagactagtaaattgtccgctaaattctggccgtttttggcttttttgt
[0597]
tagacseq id no：29：磷酸甘油酸激酶1(pgk)启动子#2的核苷酸序列
[0598]
ggggttggggttgcgccttttccaaggcagccctgggtttgcgcagggacgcggctgctctgggcgtggtt
[0599]
ccgggaaacgcagcggcgccgaccctgggtctcgcacattcttcacgtccgttcgcagcgtcacccggatc
[0600]
ttcgccgctacccttgtgggccccccggcgacgcttcctgctccgcccctaagtcgggaaggttccttgcg
[0601]
gttcgcggcgtgccggacgtgacaaacggaagccgcacgtctcactagtaccctcgcagacggacagcgcc
[0602]
agggagcaatggcagcgcgccgaccgcgatgggctgtggccaatagcggctgctcagcagggcgcgccgag
[0603]
agcagcggccgggaaggggcggtgcgggaggcggggtgtggggcggtagtgtgggccctgttcctgcc
cgc
[0604]
gcggtgttccgcattctgcaagcctccggagcgcacgtcggcagtcggctccctcgttgaccgaatcaccg
[0605]
acctctctccccag
[0606]
seq id no：30：cba/cbh启动子#3的核苷酸序列
[0607]
cgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaatag
[0608]
taacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagta
[0609]
catcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattg
[0610]
tgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattacca
[0611]
tggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtat
[0612]
ttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggc
[0613]
ggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctcc
[0614]
gaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcggga
[0615]
gtcgctgcgacgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgac
[0616]
tgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagctgagcaag
[0617]
aggtaagggtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattacctggagcacctgcctgaaat
[0618]
cactttttttcag
[0619]
seq id no：31：aav2衣壳蛋白的氨基酸序列
[0620]
maadgylpdwledtlsegirqwwklkpgppppkpaerhkddsrglvlpgykylgpfngldkgepvneadaa
[0621]
alehdkaydrqldsgdnpylkynhadaefqerlkedtsfggnlgravfqakkrvleplglveepvktapgk
[0622]
krpvehspvepdsssgtgkagqqparkrlnfgqtgdadsvpdpqplgqppaapsglgtntmatgsgapmad
[0623]
nnegadgvgnssgnwhcdstwmgdrvittstrtwalptynnhlykqissqsgasndnhyfgystpwgyfdf
[0624]
nrfhchfsprdwqrlinnnwgfrpkrlnfklfniqvkevtqndgtttiannltstvqvftdseyqlpyvlg
[0625]
sahqgclppfpadvfmvpqygyltlnngsqavgrssfycleyfpsqmlrtgnnftfsytfedvpfhssyah
[0626]
sqsldrlmnplidqylyylsrtntpsgtttqsrlqfsqagasdirdqsrnwlpgpcyrqqrvsktsadnnn
[0627]
seyswtgatkyhlngrdslvnpgpamashkddeekffpqsgvlifgkqgsektnvdiekvmitdeeeirtt
[0628]
npvateqygsvstnlqrgnrqaatadvntqgvlpgmvwqdrdvylqgpiwakiphtdghfhpsplmggfgl
[0629]
khpppqilikntpvpanpsttfsaakfasfitqystgqvsveiewelqkenskrwnpeiqytsnynksvnv
[0630]
dftvdtngvyseprpigtryltrnl
[0631]
seq id no：32：aav9衣壳蛋白的氨基酸序列
[0632]
maadgylpdwlednlsegirewwalkpgapqpkanqqhqdnarglvlpgykylgpgngldkgepvnaadaa
[0633]
alehdkaydqqlkagdnpylkynhadaefqerlkedtsfggnlgravfqakkrlleplglveeaaktapgk
[0634]
krpveqspqepdssagigksgaqpakkrlnfgqtgdtesvpdpqpigeppaapsgvgsltmasgggapvad
[0635]
nnegadgvgsssgnwhcdsqwlgdrvittstrtwalptynnhlykqisnstsggssndnayfgystpwgyf
[0636]
dfnrfhchfsprdwqrlinnnwgfrpkrlnfklfniqvkevtdnngvktiannltstvqvftdsdyqlpyv
[0637]
lgsahegclppfpadvfmipqygyltlndgsqavgrssfycleyfpsqmlrtgnnfqfsyefenvpfhssy
[0638]
ahsqsldrlmnplidqylyylsktingsgqnqqtlkfsvagpsnmavqgrnyipgpsyrqqrvsttvtqnn
[0639]
nsefawpgasswalngrnslmnpgpamashkegedrffplsgslifgkqgtgrdnvdadkvmitneeeikt
[0640]
tnpvatesygqvatnhqsaqaqaqtgwvqnqgilpgmvwqdrdvylqgpiwakiphtdgnfhpsplmggfg
[0641]
mkhpppqilikntpvpadpptafnkdklnsfitqystgqvsveiewelqkenskrwnpeiqytsnyyksnn
[0642]
vefavntegvyseprpigtryltrnl

技术特征：
1.一种病毒颗粒，其包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因。2.权利要求1的病毒颗粒，其中所述转基因包含选自seq id no:5、6、8、17和18的人类葡萄糖脑苷脂酶的编码序列，典型地所述转基因包含选自seq id no:1、7、11、12和19的序列。3.权利要求1或2的病毒颗粒，其中所述核酸构建体还包含可操作地连接至所述转基因的启动子，并且其中所述启动子优选允许至少在黑质致密部(snc)的神经元细胞和小神经胶质细胞中的所述转基因的表达。4.权利要求3的病毒颗粒，其中所述启动子是泛在启动子，尤其选自seq id no:2或20的gusb启动子、seq id no:9或21的cag启动子和seq id no:13的hsyn启动子的启动子。5.权利要求1-4中任一项的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒至少同时靶向神经元和神经胶质细胞。6.权利要求1-5中任一项的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒至少同时靶向位于大脑皮质和亚细胞结构例如迈纳特基底核、黑质致密部、蓝斑、海马结构和内嗅皮质中的神经元和神经胶质细胞。7.权利要求1-6中任一项的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒至少同时靶向神经元和小神经胶质细胞。8.权利要求1-7中任一项的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒至少同时靶向黑质致密部中的多巴胺能神经元和小神经胶质细胞。9.权利要求1-8中任一项的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是重组腺相关病毒(raav)颗粒，优选地所述重组腺相关病毒颗粒包含选自aav2、aav5、aav9、aav-mnm004、aav-mnm008和aav-tt的衣壳蛋白。10.权利要求1-9中任一项的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含aav tt衣壳蛋白，优选地所述aav tt衣壳蛋白包含seq id no:14的氨基酸序列或与seq id no:14具有至少98.5％优选99％或99.5％同一性的序列。11.权利要求1-10中任一项的病毒颗粒，其中所述核酸构建体还包含多腺苷酸化信号序列，优选地包含seq id no:3的多腺苷酸化信号序列。12.权利要求1-11中任一项的病毒颗粒，其中所述核酸构建体包含在病毒载体中，所述病毒载体还包含5’itr序列和3’itr序列，优选腺相关病毒的5’itr序列和3’itr序列，更优选源自aav2血清型的5’itr序列和3’itr序列，所述5’itr序列和所述3’itr序列包含seq id no:15和/或16的序列或与seq id no:15和/或16具有至少80％或至少90％同一性的序列或由其组成。13.权利要求1-12中任一项的病毒颗粒，其中所述病毒载体包含seq id no:4的核酸序列或与seq id no:4具有至少80％或至少90％同一性的核酸序列。14.权利要求1-13中任一项的病毒颗粒，其中所述核酸构建体包含在启动子控制下的人类葡萄糖脑苷脂酶的编码序列，允许至少在多巴胺能神经元和小神经胶质细胞两者中所述人类葡萄糖脑苷脂酶的表达，其中所述病毒颗粒选自至少靶向黑质致密部的多巴胺能神经元和小神经胶质细胞的病毒颗粒，通常aav颗粒包含选自aav2、aav5和aav9的衣壳蛋白。15.权利要求1-13中任一项的病毒颗粒，其中所述核酸构建体包含在启动子控制下的
人类葡萄糖脑苷脂酶的编码序列，允许至少在多巴胺能神经元和小神经胶质细胞两者中，优选至少在黑质致密部和大脑皮质的神经元中所述人类葡萄糖脑苷脂酶的表达，其中所述病毒颗粒选自具有逆向运输的病毒颗粒，通常所述病毒颗粒包含选自aav-mnm004、aav-mnm008和aav-tt的aav retro衣壳蛋白。16.权利要求1-15中任一项的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含能够逆向运输的衣壳蛋白(aavretro)。17.权利要求16的病毒颗粒，其中如体内散布测定确定的，在非人灵长类的尾状核或壳核进行脑实质注射后，所述病毒颗粒能够散布于大脑皮质中，优选地至少散布于黑质致密部和大脑皮质。18.一种体内散布测定，其包括以下步骤：a.通过脑实质内注射将包含编码绿色荧光蛋白(gfp)的转基因的raav注射至非人灵长类的连合后壳核中，以及b.在注射后约一个月，计算在大脑皮质中，优选在神经支配尾状壳核的脑部区域中表达gfp的神经元的数量。19.权利要求18的体内散布测定，还包括以下步骤c)：将在大脑皮质中，优选在神经支配尾状壳核的脑部区域中表达gfp的神经元的数量与对照实验组进行比较，所述对照实验组通过脑实质内注射将包含编码绿色荧光蛋白(gfp)的转基因的aav-tt注射至非人灵长类的连合后壳核中来进行。20.权利要求1-17中任一项的病毒颗粒，其选自能够散布于大脑皮质，优选散布于黑质致密部和大脑皮质并且如在权利要求18-19中任一项的体内散布测定中所确定的至少达到与aav-tt相同的水平的aavretro。21.权利要求1-17和20中任一项的病毒颗粒，其中所述aavretro选自aav-mnm004、aav-mnm008和aav-tt。22.权利要求1-17或20-21中任一项的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含aav tt衣壳蛋白，其优选地包含seq id no:14的氨基酸序列或与seq id no:14具有至少98.5％、优选99％或99.5％同一性的序列。23.权利要求1-17或20-22中任一项的病毒颗粒，其用于治疗。24.权利要求1-17或20-22中任一项的病毒颗粒，其用于在有需要的受试者中通过基因疗法治疗tau蛋白病。25.根据权利要求24使用的病毒颗粒，其中所述tau蛋白病是人类偶发性tau蛋白病。26.根据权利要求24-25中任一项使用的病毒颗粒，其中待治疗的所述受试者选自患有末期tau蛋白病的患者。27.根据权利要求24-26中任一项使用的病毒颗粒，其中所述tau蛋白病是阿尔茨海默病，典型地是偶发性阿尔茨海默病。28.根据权利要求24-26中任一项使用的病毒颗粒，其中所述tau蛋白病是阿尔茨海默病以外的临床实体，其包括但不限于进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、额颞叶痴呆和皮克病。29.根据权利要求23-28中任一项使用的病毒颗粒，其中通过鞘内施用或脑实质内施用将病毒载体施用至所述受试者，所述脑实质内施用优选地施用至脑部区域例如大脑皮质和
亚细胞结构例如迈纳特基底核、黑质致密部、蓝斑、海马结构和内嗅皮质。30.根据权利要求29使用的病毒颗粒，其中通过脑实质内施用将所述病毒载体施用至所述受试者，优选地施用至黑质致密部和/或尾状壳核的脑部区域。31.根据权利要求29使用的病毒颗粒，其中通过脑实质内施用将病毒载体施用至所述受试者，优选地施用至海马结构的齿状回。32.一种治疗有需要的受试者中的tau蛋白病，优选偶发性tau蛋白病的方法，所述方法包括将治疗有效剂量的权利要求1-17或20-22中任一项的病毒颗粒施用至所述受试者。33.根据权利要求32的治疗tau蛋白病的方法，其中待治疗的所述受试者选自患有末期tau蛋白病的患者。34.根据权利要求32或33的治疗tau蛋白病的方法，其中所述tau蛋白病是阿尔茨海默病。35.根据权利要求32或33的治疗tau蛋白病的方法，其中所述tau蛋白病是阿尔茨海默病以外的临床实体，其包括但不限于进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、额颞叶痴呆或皮克病。36.根据权利要求32-35的治疗tau蛋白病的方法，其中通过鞘内施用或脑实质内施用将所述病毒颗粒施用至所述受试者，所述脑实质内施用优选地施用至脑部区域例如大脑皮质和亚细胞结构例如迈纳特基底核、黑质致密部、蓝斑、海马结构和内嗅皮质。37.根据权利要求32-35的治疗tau蛋白病的方法，其中通过脑实质内施用将所述病毒颗粒施用至所述受试者，优选地施用至黑质致密部、尾状壳核或海马结构的齿状回的脑部区域。

技术总结
本公开内容涉及用于通过基因疗法治疗Tau蛋白病特别是阿尔茨海默病的病毒颗粒。更具体地，本发明涉及用于通过基因疗法治疗有需要的受试者的Tau蛋白病的病毒颗粒，所述病毒颗粒包含核酸构建体，并且核酸构建体包含编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因。糖脑苷脂酶的转基因。


技术研发人员：G
受保护的技术使用者：生物医学网络研究财团中心 UCB生物制药有限责任公司
技术研发日：2021.08.06
技术公布日：2023/7/7