光氧化原位生成两面针碱及其在细胞探针和抗癌药物制备中的应用

1.本发明属于医用材料的技术领域，具体涉及光氧化原位生成两面针碱及其在细胞探针和抗癌药物制备中的应用。


背景技术：

2.具有抗癌活性的生物碱具有广阔的临床应用前景，然而其对正常组织或细胞通常也具有较强的毒性，严重限制了其应用。为了降低对正常组织或器官的毒副作用，迫切需要建立空间选择性激活生物碱抗癌活性的方法。
3.光激活化疗具有高时空分辨率的优势，可通过光照控制治疗区域，实现选择性杀死癌细胞。然而，传统的光激活化疗通常需要在化疗药物上修饰光剪切基团，不仅合成步骤繁琐，而且容易生成毒副产物，严重限制了其应用。因此，亟需发展生物相容性好的光激活化疗策略。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明首次提出一种具有光动力活性的两面针碱通过活性氧的生成有效杀灭癌细胞的新方法，该方法能够协同利用光激活化疗和光动力治疗，将进一步提高生物碱的精准抗癌效率。
5.同时，本发明还首次提出一种光激活原位生成两面针碱的方法，并利用原位生成的两面针碱的化疗和光动力治疗活性，协同杀死癌细胞的方法。本发明将二氢两面针碱与氧在光照的条件下反应即可获得具有化疗毒性和光动力治疗活性的两面针碱化合物，该方法简单，高效。
6.本发明的目的通过下述技术方案实现：
7.本发明提供一种光激活原位生成两面针碱的方法，是将式(i)所示的二氢两面针碱分散在介质中，然后置于氧气或空气中，光照氧化即得；
[0008][0009]
在本发明的一种实施方式中，所述制备方法的反应路线为：
[0010]
[0011]
其中，x为介质提供的阴离子。
[0012]
在本发明的一种实施方式中，介质包括水或细胞内。
[0013]
在本发明的一种实施方式中，空气中氧气的含量不低于21％。进一步优选空气中氧气的含量大于等于40％；进一步优选空气中氧气的含量大于等于60％；进一步优选空气中氧气的含量大于等于80％；进一步优选上述反应在氧气中进行。
[0014]
在本发明的一种实施方式中，所述光照为紫外光、紫光；光照的强度为1～20mw/cm2。
[0015]
本发明还提供式(i)所示的二氢两面针碱在制备细胞荧光探针中的应用，
[0016][0017]
其中，二氢两面针碱在光照射下生成两面针碱，两面针碱聚集到细胞核内，形成荧光成像的细胞荧光探针。
[0018]
本发明还提供式(i)所示的二氢两面针碱在制备具有光激活化疗和光动力治疗功能的抗癌药物中的应用，
[0019][0020]
在本发明的一种实施方式中，上述应用的原理过程包括：将式(i)所示的二氢两面针碱作为光激活前药，在光照射下发生光氧化脱氢反应，生成两面针碱，实现化疗和光动力治疗活性协同杀死癌细胞。
[0021]
在本发明的一种实施方式中，癌症包括：肺癌、骨癌、膜腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤黑色素癌或眼球内黑色素癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、胆门部癌、胃癌、结肠癌、乳癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、阴门癌、霍奇金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、胰腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉癌、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾孟癌、中枢神经系统(cns)癌、原发性中枢神经系统淋巴癌、脊髓轴癌、脑干神经胶质瘤、脑垂腺腺瘤等。
[0022]
在本发明的一种实施方式中，所述抗癌药物中还包括药用辅料；所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。
[0023]
在本发明的一种实施方式中，所述抗癌药物中还包括药用载体；所述药物载体选自微囊、微球、纳米粒和脂质体。
[0024]
在本发明的一种实施方式中，所述抗癌药物的剂型选自：注射液、注射用冻干粉
针、混悬剂、植入剂、栓塞剂、胶囊剂、片剂、丸剂和口服液。
[0025]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0026]
本发明应用化合物——二氢两面针碱在光照的条件下可实现光激活化疗和光动力治疗的优势，可以通过光照控制，实现癌细胞的选择性杀灭。
[0027]
本发明以生物相容性良好的二氢两面针碱为底物，通过光氧化脱氢反应原位生成两面针碱。该方法方法简单、高效，同时激活其化疗和光动力治疗活性，将二氢两面针碱用于细胞中，并在氧的条件下光照，可实现活细胞内光激活荧光成像。通过光照控制，利用生成的两面针碱的化疗和光动力的活性，实现癌细胞的选择性杀灭。此外，基于光照的高时空分辨的优势，二氢两面针碱可在癌细胞和正常细胞共存的环境下，有效提高针对癌细胞的选择性杀灭效率。该光激活化疗和光动力治疗协同的策略，在促进两面针碱的医学应用方面具有重要价值。
附图说明
[0028]
图1为化合物
ⅰⅰ‑
2的紫外吸收光谱，荧光发射光谱和光动力活性图；(a)为化合物i
ⅰ‑
1在水中的归一化紫外吸收光谱(5*10-5
mol
·
l-1
，左侧虚线)和荧光发射光谱图(5*10-5
mol
·
l-1
，激发波长为380nm，右侧实线)；(b)化合物
ⅰⅰ‑
1(1mm)在含有不同浓度(0，100，200，400，600，800μm)的葫芦[7]脲的水溶液中的荧光发射光谱图，激发波长为365nm；(c)为化合物i
ⅰ‑
1在(b)测试条件下，与不同浓度的葫芦[7]脲结合后的最大发射强度与在水溶液中最大发射强度的比值变化图(i/i0)；化合物i
ⅰ‑
1与不同浓度的葫芦[7]脲结合后的最大发射强度对应的波长变化图；(d)化合物i
ⅰ‑
1(1mm)在光照下产生活性氧，活性氧诱导dcfh(10μm)探针转变为dcf的荧光增强点线图(激发波长为488nm，发射波长为525nm)。
[0029]
图2为化合物i-1的核磁氢谱和碳谱图。
[0030]
图3为化合物i-1和ii-1的光激活紫外吸收光谱和荧光光谱图；(a)为化合物i-1(5*10-5
mol
·
l-1
)在水和二甲基亚砜(95：5,v/v)的混合溶液中，被手提式紫外灯(365nm,5mw/cm2)光照不同时间后的紫外吸收光谱图；(b)为化合物
ⅰ‑
1在(a)的测试条件下，380nm处的吸收峰强度与初始强度的比值(a/a0)随光照时间的变化图；(c)为化合物i-1(5*10-5
mol
·
l-1
)在含有葫芦[7]脲(5*10-5
mol
·
l-1
)的水和二甲基亚砜(95：5,v/v)中，用手提式紫外灯(365nm,5mw/cm2)光照不同时间后的荧光光谱图，激发波长为380nm；(d)为化合物i-1在(c)的测试条件下，光照不同时间后的最大荧光强度随光照时间的变化图。
[0031]
图4为化合物i-1和ii-1的吸收光谱及电子云分布图；(a)为化合物i-1的理论计算吸收光谱和实测的吸收光谱；(b)为化合物ⅰi-1的理论计算吸收光谱和实测的吸收光谱；(c)为化合物i-1的最高占据轨道(homo)和最低未占据轨道(lumo)的电子云分布图；(d)为化合物ⅰi-1的最高占据轨道(homo)和最低未占据轨道(lumo)的电子云分布图。
[0032]
图5为化合物i-1和ii-1对子宫颈癌细胞(hela)的细胞存活率的影响；(a)为hela癌细胞在光照和黑暗条件下孵育不同浓度的化合物ⅰi-1(0，2，4，6，8，10，20μm)后的细胞存活率；(b)为hela癌细胞在光照和黑暗条件下孵育不同浓度的化合物i-1(0，2，4，6，8，10，20μm)后的细胞存活率；光照条件：手提式紫外灯(365nm,5mw/cm2)光照10分钟。
[0033]
图6为化合物i-1和ii-1对子宫颈癌细胞(hela)的影响；(a)为化合物i-1和ii-1(10-5
mol
·
l-1
)孵育的子宫颈癌细胞hela细胞在激光(405nm，功率：2％)照射下的共聚焦照
片图，405nm激光器，功率2％，荧光收集波段为410-580nm；(b)为激光共聚焦的lambda模式下，化合物i-1和ii-1(10-5
mol
·
l-1
)孵育的子宫颈癌细胞hela细胞的荧光光谱图和激光共聚焦照片图，405nm激光器，功率2％，荧光收集波段为410-580nm；(c)为化合物i(10-5
mol
·
l-1
)孵育子宫颈癌细胞hela细胞并诱导细胞凋亡后，商品化凋亡试剂annexin fitc和pi染色子宫颈癌细胞hela细胞的激光共聚焦荧光照片图，405nm激光器，功率2％，荧光收集波段为410-580nm；(d)为化合物ⅰi-1(10-5
mol
·
l-1
)孵育子宫颈癌细胞hela细胞并诱导细胞凋亡后，商品化凋亡试剂annexin fitc和pi染色子宫颈癌细胞hela细胞的激光共聚焦荧光照片图，annexin fitc：488nm激光器，功率2％，荧光收集波段为490-530nm；pi：543nm激光器，功率2％，荧光收集波段为600-650nm。
[0034]
图7为化合物i-1(10-5
mol
·
l-1
)孵育子宫颈癌细胞(hela)和小鼠成纤维正常细胞(nih-3t3)共存的细胞后，选择性光照子宫颈癌细胞(hela)(405nm，功率：10％)的激光共聚焦荧光照片图，405nm激光器，荧光收集波段为410-580nm。
具体实施方式
[0035]
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0036]
实施例1光氧化原位生成两面针碱
[0037]
(1)合成式
ⅰ‑
1化合物：
[0038]
化合物i-1的结构式：
[0039][0040]
化合物i-1的制备：
[0041]
氯化两面针碱(化合物ii-1，220mg)溶于甲醇(30ml)，加入硼氢化钠(200mg)，室温搅拌反应30分钟，抽滤收集沉淀，水洗，干燥得灰白色固体产物二氢两面针碱(50mg，收率：23％)。结构表征相关数据如下：
[0042]1h nmr(d
6-dmso,400mhz):7.86(d,j＝8.4hz,1h),7.56(d,j＝8.8hz,1h),7.52(s,h),7.43(s,h),7.31(s,h),6.97(s,h),6.13(s,2h),4.09(s,2h),3.87(s,3h),3.82(s,3h),3.49(s,3h)；
13
c nmr(d
6-dmso,100mhz):149.2,148.8,148.3,147.6,142.6,130.8,126.1,124.5,124.5,124.4,124.0,120.7,111.1,107.3,104.7,101.6,100.2,56.3,56.0,54.3,41.2。
[0043]
图2为化合物i-1的核磁氢谱和碳谱。
[0044]
(2)化合物
ⅰ‑
1的光激活氧化脱氢制备两面针碱：
[0045]
化合物i-1溶液(10μl，10mm，dmso)加入超纯水(100μl)，手持式紫外灯(365nm，5mw/cm2)光照不同时间，随后加入超纯水(890μl)稀释，进而利用紫外分光光度计测试其吸收光谱。dhnc溶液(10μl，10mm，dmso)加入葫芦[7]脲溶液(100μl，1mm，h2o)，手持式紫外灯(365nm，5mw/cm2)光照不同时间，随后加入超纯水(890μl)稀释，进而利用荧光光谱仪测试其荧光发射光谱，激发波长为380nm。
[0046]
所述脱氢所得两面针碱化合物的结构为式ii-1：
[0047][0048]
x-为介质提供的阴离子(本实施例为羟基)。
[0049]
在手提uv灯照射下，化合物i-1水溶液在380nm处的吸收强度随光照时间的延长而不断增强，在光照15分钟时达到平衡，表明化合物i-1在水溶液中可以高效转变为化合物ii-1(图3a-b)。同时，在葫芦[7]脲存在下，504nm处的荧光发射强度随光照时间的延长而逐渐增强，进一步验证了化合物i-1通过光氧化脱氢反应转变为了化合物ii-1，并进一步被葫芦[7]脲包裹，实现了荧光“点亮”(图3c-d)。
[0050]
性能测试：
[0051]
化合物i-1和化合物ii-1吸收光谱的理论计算
[0052]
化合物i-1和化合物ii-1单体分别利用gaussian(v.16b01)软件密度泛函理论(dft)中的b3lyp方法并考虑含阻尼的色散校正(d3bj)，在def2-tzvp基组下进行几何结构优化及频率计算。基于得到的稳定构型，用含时密度泛函理论(td-dft)中的ωb97-xd方法，在def2-tzvp基组下进行吸收光谱计算。所有的计算均用pcm溶剂模型模拟实验过程中的水溶液环境。与实验光谱的比较分析通过specdis(v.1.71)软件实现，其中展宽通过高斯函数拟合，默认半宽参数(σ)为0.2ev，分子轨道分布图利用gaussview(v.6.0.16)软件的默认参数获得。
[0053]
对化合物i-1和化合物ii-1的吸收光谱计算发现，它们最大吸收峰主要来自于最高占据轨道(homo)向最低未占据轨道(lumo)间的跃迁。该能级差与实验上二者紫外-可见光的最大吸收峰能量非常相近，拟合后的吸收光谱与实验值对比如图4a和4b所示。图4c和4d的homo和lumo轨道的电子云分布显示，化合物i-1和化合物ii-1存在局域态(le)和分子内电荷转移态(ict)的混合。
[0054]
实施例2
[0055]
市售获得两面针碱化合物——化合物ii-2，其结构式如下所示：
[0056][0057]
化合物ⅰi-2的光物理性质表征：
[0058]
图1a为化合物ⅰi-2在水中的归一化紫外吸收光谱和荧光发射光谱。其最大吸收波长为380nm，最大发射波长为524nm。不同浓度的葫芦[7]脲的作用下，化合物ii-2在水溶液中的荧光逐渐增强，而且其最大发射波长逐渐蓝移至515nm(图1b-c)，这主要归因于分子内电荷转移过程及分子内振动受到限制。
[0059]
图1d为dcfh和化合物ii-2在被光照不同时间后的荧光强度与未光照前的荧光强度比值变化图。2',7'-二氯二氢荧光素(dcfh)是一种活性氧检测探针，可以被活性氧氧化
为2',7'-二氯荧光素(dcf)，发射出黄绿色荧光。在一定范围内，荧光强度的增加水平与活性氧的产生量呈一定的相关性。500μl dcfh-da溶液(1mm，etoh)加入2ml naoh溶液(10mm，h2o)，室温下避光反应30分钟，加入10ml pbs调节ph值至中性，得终浓度为40μm的dcfh母液。取25μl dcfh母液和10μl nc溶液(10mm，dmso)，加入65μl pbs，手持式紫外灯(365nm，5mw/cm2)光照后，酶标仪测试525nm处的荧光发射强度，激发波长为488nm。结果表明，化合物ii-2在紫外光照射下(365nm，5mw/cm2)，可以高效生成ros(图1d)。可见，该化合物具有一定的光动力活性。
[0060]
实施例3
[0061]
二氢两面针碱在癌症治疗中的应用
[0062]
将处于对数生长期的子宫颈癌细胞(hela)消化，以104个/孔的细胞密度接种于96孔板，每组设置5个复孔，同时设置空白对照组(仅加入培养液)。培养24小时后，加入不同浓度的化合物i-1或化合物ii-1，孵育4小时。手持式紫外灯(365nm，5mw/cm2)光照10分钟，继续孵育24小时。每孔加入100μl mtt溶液(0.5mg/ml，90％ dmem+10％ pbs)，继续孵育4小时，加入100μl dmso，震荡10分钟，用酶标仪测试570nm处的吸光度。
[0063]
细胞存活率实验表明，化合物ii-1对细胞具有明显的暗毒性，其孵育浓度为10μm时，细胞存活率为47％。在光照后，由于活性氧的生成，其细胞毒性进一步增强，细胞存活率降至32％。说明化合物ii-1同时具有化疗和光动力治疗的活性(图5a)。与之不同，化合物i-1对细胞的暗毒性很小，细胞存活率90％以上，具有良好的生物相容性，而光照后的细胞毒性明显增加(图5b)，细胞存活率降至45％，这是由于化合物i-1原位转变为了化合物ii-1，可通过原位激活其化疗及光动力活性，有效提高对癌细胞的杀灭效率。
[0064]
实施例4
[0065]
二氢两面针碱在细胞荧光成像和癌症治疗中的应用
[0066]
将对数生长期的hela细胞消化，以105个/皿的细胞密度接种于共聚焦皿，培养24小时。加入1毫升含有10μm化合物i-1或化合物ii-1的培养液，孵育1小时。用激光共聚焦进行成像观察并激活细胞内的化合物i-1或化合物ii-1。结果表明，化合物i-1碱染色的细胞，在刚开始时几乎无荧光，仅在405nm激光照射下，橙色荧光才逐渐增强，且逐渐富集到细胞核内。而化合物ii-1染色的细胞，可以观察到线粒体中迅速发出橙色荧光，在405nm激光照射后，橙色荧光逐渐富集到细胞核内(图6a)，该实验结果表明化合物i-1在光照下有效转变为两面针碱，进一步富集到细胞核内并插入到核酸的碱基对，从而“点亮”橙色荧光。进一步，通过激光共聚焦的lambda扫描模式，观察到化合物i-1在被光激活后的荧光光谱与直接孵育化合物ii-1的细胞核内荧光光谱相一致(图6b)，进一步证实化合物i-1在激光照射下转变为了化合物ii-1。
[0067]
将处于对数生长期的子宫颈癌细胞(hela)消化，以105个/皿的细胞密度接种于共聚焦皿，培养24小时。加入1毫升含有10μm化合物i-1或化合物ii-1的培养液，孵育1小时。功率2％的405nm激光照射细胞5分钟后，原位加入10μl凋亡染色试剂annexin fitc和pi，暗中孵育30分钟，随后在激光共聚焦显微镜下进行成像观察。结果表明，化合物i-1和化合物ii-1在405nm激光照射5分钟后，细胞表面明显起泡(图6a)，进一步利用商品化凋亡试剂annexin fitc和pi染色细胞(图6c-d)，发现405nm激光照射5分钟并于黑暗中孵育30分钟后，annexin fitc可以染色细胞膜，pi染色可以染色细胞核，证明细胞处于晚期凋亡状态。
该实验结果表明化合物i-1在光照下，可转变为化合物ii-1，从而激活化合物ii-1的化疗和光动力活性，二者协同诱导癌细胞凋亡。
[0068]
实施例5
[0069]
高空间选择性光激活杀灭癌细胞
[0070]
将处于对数生长期的子宫颈癌细胞(hela)和小鼠成纤维正常细胞(nih-3t3)消化，以5*104个/皿的细胞密度接种到同一共聚焦皿上，培养24小时。加入1毫升含有10μm化合物i-1的培养液，孵育1小时。激光共聚焦显微镜进行成像并选择性光照子宫颈癌细胞(hela)内。结果表明，在hela癌细胞和nih-3t3正常细胞共存下，选择性光照hela癌细胞区域，不仅可以“点亮”hela癌细胞核内的橙色荧光，而且可有效诱导hela癌细胞表面明显起泡，而nih-3t3正常细胞没有明显的荧光和形态改变(图7)，表明光激活化合物i-1可以实现高空间选择性杀死癌细胞，降低对正常细胞的毒副作用。
[0071]
本发明建立了二氢两面针碱和两面针碱的简便高效的制备方法。二氢两面针碱在光照下，可发生光氧化脱氢反应，生成具有化疗和光动力活性的两面针碱，实现对癌细胞的高空间选择性杀灭。
[0072]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种光激活原位生成两面针碱的方法，其特征在于，是将式(i)所示的二氢两面针碱分散在介质中，然后置于氧气或空气中，光照氧化即得；2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备方法的反应路线为：其中，x为介质提供的阴离子。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，介质包括水或细胞内。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，空气中氧气的含量不低于21％。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述光照为紫外光、紫光；光照的强度为1～20mw/cm2。6.式(i)所示的二氢两面针碱在制备细胞荧光探针中的应用，其中，二氢两面针碱在光照射下生成两面针碱，两面针碱聚集到细胞核内，形成用于荧光成像的细胞荧光探针。7.式(i)所示的二氢两面针碱在制备具有光激活化疗和光动力治疗功能的抗癌药物中的应用，8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗癌药物中还包括药用辅料；所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗癌药物中还包括药用载体；所述药物载体选自微囊、微球、纳米粒和脂质体。10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗癌药物的剂型选自：注射液、注射用冻干粉针、混悬剂、植入剂、栓塞剂、胶囊剂、片剂、丸剂和口服液。

技术总结
本发明公开了光氧化原位生成两面针碱及其在细胞探针和抗癌药物制备中的应用，属于医用材料的技术领域。本发明以式(I)二氢两面针碱为底物，通过光氧化脱氢反应原位生成式(II)两面针碱，同时激活其化疗和光动力治疗活性。所述二氢两面针碱在制备光激活化疗和光动力治疗协同抗癌产品中的应用。本发明方法简单，高效；将二氢两面针碱用于细胞中，并在氧的条件下光照，可实现活细胞内光激活荧光成像；通过光照控制，利用生成的两面针碱的化疗和光动力的活性，实现癌细胞的选择性杀灭。实现癌细胞的选择性杀灭。实现癌细胞的选择性杀灭。实现癌细胞的选择性杀灭。


技术研发人员：杨雁
受保护的技术使用者：佛山科学技术学院
技术研发日：2023.03.16
技术公布日：2023/7/7