近红外光调节的共轭聚合物复合纳米粒子及其制备方法和应用

1.本发明属于光热气体治疗技术领域，具体涉及近红外光调节的共轭聚合物复合纳米粒子及其制备方法和应用。


背景技术：

2.癌症是全球死亡的主要原因之一，严重威胁着人类的健康和福祉。光热治疗(photothermal therapy，ptt)作为一种极具前景的治疗手段，因其优异的远程时空控制精度和无创性治疗特性而备受关注。值得注意的是，ptt利用吸光剂将光能转化为热能用于细胞热消融。更重要的是，近红外光比可见光更有利于减少组织中的光衰减，这使得具有高nir吸光度的治疗药物能够实现更好的光穿透深度和对生物系统的低毒性。目前，已有多种类型的无机纳米材料被研究并应用于光热治疗，如稀土离子掺杂纳米晶、新型金属纳米结构、氧化钨纳米线等。然而，对于大多数无机纳米材料而言，备受争议的长期毒性严重限制了其潜在的临床应用。
3.因此，有机材料引起了人们的广泛兴趣。特别是，由半导体聚合物制备的半导体聚合物纳米粒子(spns)由于其优异的光学性能，在生物医学领域具有广阔的应用前景。值得注意的是，spns的无金属性质使其可以绕过金属离子引起的毒性问题。同时，spns往往具有光学优势，甚至优于无机半导体纳米粒子。此外，spns可以有效地将光能转化为机械声波和热能，使其成为光声成像和光热治疗的最佳候选者。此外，与碳纳米管和金纳米棒相比，它们具有更强的光吸收能力和更高的光热转换效率，从而导致更快的升温。基于这些令人鼓舞的性能，基于半导体聚合物量子点(pdots)的诊疗试剂作为光热纳米调节剂已被用于癌症治疗。然而，由于细胞内热休克蛋白(heat shock proteins，hsps)可以抑制热应激诱导的细胞凋亡，ptt也存在疗效低和肿瘤复发的问题。因此，进一步克服光热治疗的缺陷对肿瘤治疗具有重要意义。
4.目前，气体治疗因其高效的治疗效果和生物安全性，被认为是一种非常有潜力的肿瘤治疗策略。在气体信号分子家族中，一氧化氮(no)在几乎所有的器官系统中发挥着极其重要的生理或病理生理作用。特别是，越来越多的证据表明，no对癌症是一把双刃剑。低浓度的no可以促进肿瘤的生长，但在高浓度(如》1μm)时，no可以抑制实体瘤的生长。同时，no还可以通过增敏多药耐药癌细胞来提高化疗疗效。此外，no不仅可以作为放射增敏剂，还可以通过与活性氧(ros)反应形成高反应性的过氧亚硝酸盐来增强光动力学治疗(pdt)的疗效。因此，研究人员开发了各种no供体。其中，n，n'-二仲丁基-n，n'-二亚硝基对苯二胺(bnn6)被认为是一种用于气体治疗的强大的no发生器。然而，bnn6具有uv-vis光响应的缺点，严重制约了其应用和发展。为了克服这一不足，bnn6通过与其他分子的π-π叠加表现出近红外响应。因此，将光控型no发生器设计制备成共轭聚合物纳米粒子用于光热/气体双模态精准治疗具有重要的必要性和重要性。


技术实现要素：

5.本发明开发了近红外调节的共轭聚合物复合纳米粒子cpnps和cpnpbs。复合纳米粒子cpnps为具有近红外(nir)响应的纳米颗粒，复合纳米粒子cpnpbs可作为近红外(nir)响应的光热纳米载体和癌细胞中no生成器。此外，上述复合纳米粒子均表现出优异的生物相容性和热效应。更重要的是，复合纳米粒子cpnpbs的光热性能与no发生性能的结合为杂化纳米材料的制备提供了新的路径，利用该具有近红外光激活的复合纳米粒子cpnpbs可以实现光热/气体双模式精准治疗。
6.本发明采用以下技术方案：
7.本发明提供一种近红外调节的共轭聚合物复合纳米粒子cpnps，cpnps的制备方法为：将in-ndi溶液和f127溶液混合，将混合液加到去离子水中，冰水浴下反应，去除有机溶剂，过滤，纯化后即得。
8.具体的：用thf配制in-ndi溶液和f127溶液。in-ndi溶液浓度为1mg/ml，f127溶液浓度为10mg/ml，将以上两种溶液按体积比1∶2混合并稀释，剧烈搅拌。然后，在超声下，将混合溶液迅速注入去离子水中，混合物在冰水浴中继续超声5min，并用氮气除去thf。将剩余的纳米粒经0.22μm滤膜过滤纯化后得到。
9.其中，in-ndi采用以下方法制备而成：
10.将in的甲苯溶液和ndi的甲苯溶液混合，加入催化剂pd(pph3)4，110℃下反应48h，然后用(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼烷-2-基)苯和溴苯除去端基，纯化，沉淀，最终得到in-ndi。共轭聚合物in-ndi的合成路线如图15a所示。
11.本发明提供一种近红外调节的共轭聚合物复合纳米粒子cpnpbs，cpnpbs的制备方法为：
12.将in-ndi溶液、bnn6溶液和f127混合，将混合液加到去离子水中，冰水浴下反应，去除有机溶剂，过滤，洗涤，即得。
13.具体的：用thf配制in-ndi溶液、bnn6溶液和f127溶液。in-ndi溶液浓度为1mg/ml，bnn6溶液浓度为1mg/ml，f127溶液浓度为10mg/ml，将以上三种溶液按体积比1∶1∶2混合并稀释，剧烈搅拌。然后，在超声下，将混合溶液迅速注入去离子水中，混合物在冰水浴中继续超声5min，并用氮气除去thf。将剩余的纳米粒经0.22μm滤膜过滤纯化后，经超滤离心管过滤，反复洗涤三次，以洗去未包裹的bnn6，收集上层纳米粒子，即得。复合纳米粒子cpnpbs的合成路线如图15b所示。
14.本发明发现，复合纳米粒子cpnps为具有近红外(nir)响应的纳米颗粒，复合纳米粒子cpnpbs可作为近红外(nir)响应的光热纳米载体和癌细胞中no生成器。此外，上述复合纳米粒子cpnps和cpnpbs均表现出优异的生物相容性和热效应，在黑暗条件下细胞毒性不显著。
15.将复合纳米粒子cpnps或cpnpbs注射于小鼠肿瘤部位，在激光照射下，ptt抑制了cpnps和cpnpbs处理小鼠的肿瘤生长，相比之下，cpnpbs和激光照射治疗小鼠的肿瘤生长在监测的28天内表现出更显著的抑制作用。因此，可将复合纳米粒子cpnps或cpnpbs用于制备肿瘤抑制药物。所述的肿瘤具体为乳腺癌细胞形成的肿瘤。
16.本发明的有益效果为：
17.本发明合成出了一种基于共轭聚合物的近红外刺激响应的复合纳米粒子cpnps或
cpnpbs，cpnps可用于光热治疗，cpnpbs可用于光热/no协同治疗。复合纳米粒子cpnpbs同时克服了no的扩散距离短和寿命极其有限的缺点，实现nir对no释放的精准可控性，光热损伤仅限于被照射区域，大大降低了全身毒性。为设计多重治疗纳米药物开辟了一种适用并且高效安全的思路。
附图说明
18.图1为in-ndi的1h nmr谱。
19.图2为聚合物ndi的凝胶渗透色谱(gpc)图谱。
20.图3为uv-vis-nir吸收光谱，溶解在thf中的in-ndi的浓度和885nm处的吸收之间的线性关系图(插入)。
21.图4为bnn6的1h nmr谱。
22.图5为cpnpbs的a)tem图像；b)dls分布图像；c)bnn6、cpnps和cpnpbs的nir吸收光谱；d)cpnps和cpnpb的ζ-电位；一周内e)不同批次cpnpbs的f)dls和b)zeta电位测定的重现性。
23.图6为cpnp和cpnpb在室温下的zeta电位随储存时间的变化图。
24.图7为a)bnn6在无水乙醇中的uv-vis-nir吸收光谱以及在248nm处的吸收与浓度之间的线性关系图(插入)。b)超滤液的紫外吸收曲线。
25.图8为a)100g/ml的cpnps在808nm近红外辐照下不同功率密度的温度变化曲线。b)cpnpbs(in-ndi浓度为100μg/ml，bnn6为100μg/ml)在808nm的近红外辐照下不同功率密度的温度变化曲线。c)在808nm(0.6w/cm2)的近红外照射下，不同浓度的cpnps在10分钟内的温度变化曲线。d)四种不同溶液(pbs、bnn6、cpnps和cpnpbs)在近红外激光(808nm，0.6w/cm2)照射下10分钟的光热图像。e)cpnpbs在808nm(0.6w/cm2)的近红外辐照和五个开关周期下的温度变化曲线。f)从冷却期得到的时间和-lnθ的线性关系(应用冷却期的线性时间数据，确定系统传热的时间常数(τs＝160.82178)。pce为55.6％)。
26.图9为a)cpnps在808nm(0.6w/cm2)的近红外辐照和五个开关周期下的温度变化曲线。
27.图10为在808nm(0.6w/cm2)激光下连续记录温度10分钟，然后关闭激光以记录10分钟的温度。
28.图11为a)将1m nano2标准溶液稀释成不同浓度，并与griess试剂1和griess试剂2混合。b)通过使用540nm处的uv吸收值制备no标准曲线。
29.图12为a)808nm(0.3w/cm2、0.6w/cm2、1w/cm2)近红外激光照射cpnpbs10分钟，no释放情况。b)808nm(0.6w/cm2)近红外激光照射负载不同浓度的bnn6的cpnpbs10min，no的释放情况。c)808nm(0.6w/cm2)开关激光照射下，cpnpbs nps的no控制释放曲线(in-ndi浓度为100μg/ml，bnn6浓度为100μg/ml)。
30.图13为用不同浓度的cpnps(0～200μg/m l)处理mcf-7细胞和hela细胞，用于a)生物相容性评价和b)光热治疗评价(808nm,0.6w/cm2)。用mcf-7细胞和hela细胞处理不同浓度的cpnpbs进行体外细胞c)生物相容性评价和d)光热治疗效果评价(808nm,0.6w/cm2)。e)不同条件处理hela细胞的活/死细胞染色荧光图像。标尺＝200μm。
31.图14为a)瘤内注射pbs、cpnps和cpnpbs后，用808nm激光(0.6w/cm2,10min)激发
4t-1荷瘤小鼠相应的红外光热图像。b)28天内小鼠肿瘤体积变化曲线。c)治疗期间小鼠体重变化。d)正常对照组小鼠和治疗组小鼠(808nm,0.6w/cm2,10min)治疗后主要脏器的苏木精和伊红(h&e)染色图像。比例尺：200μm。
32.图15为a)共轭聚合物in-ndi的合成路线。b)由in-ndi、bnn6和f127合成的复合纳米粒子cpnpbs的路线。
具体实施方式
33.下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。
34.本实施例中所用到的所有试剂均为分析纯，所需的主要实料试剂均列于表1中。
35.表1主要试剂
36.试剂名称生产厂家亚硝酸钠上海麦克林化学有限公司pd(pph3)4上海麦克林化学有限公司甲苯上海阿拉丁试剂有限公司溴苯上海阿拉丁试剂有限公司四氢呋喃上海西格玛奥德里奇公司pluronic f-127上海西格玛奥德里奇公司丙酮上海阿拉丁试剂有限公司氯仿上海阿拉丁试剂有限公司甲醇上海阿拉丁试剂有限公司无水乙醇上海阿拉丁试剂有限公司过氧化氢天津市大茂化学试剂公司三氯甲烷北京化工厂有限公司一氧化氮检测试剂盒上海碧云天生物技术有限公司ndi88深圳睿迅光电材料科技有限公司in1443苏州纳凯科技有限公司苏州胎牛血清(fbs)美国clark公司0.25％胰酶上海中乔新舟生物科技有限公司dmem完全培养基武汉普诺赛生命科技有限公司双抗赛默飞世尔科技公司mtt细胞增殖分析试剂盒中国北京索莱宝科技有限公司无菌pbs溶液中国北京索莱宝科技有限公司ao/eb染色试剂盒上海源叶生物科技有限公司
37.实施例1
38.1、共轭聚合物in-ndi的合成与表征
39.根据经典的给体-受体(d-a)结构，利用stille聚合反应，以给体单体in和受体单体ndi为原料，设计合成了一种新的π-共轭聚合物。具体如下：
40.在50ml单口烧瓶中，将in(in1443，0.25mmol)和ndi(ndi88，0.25mmol)在氮气气氛
下用10ml甲苯溶解。然后，使用pd(pph3)4(8.6mg)作为催化剂，将体系加热到110℃，反应48h。然后加入20mg(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼烷-2-基)苯继续反应5小时以除去聚合物的溴端基。而后在加入0.4ml溴苯继续反应6小时以除去聚合物的锡端基。加热后，粗产物在四氢呋喃、氯仿和丙酮中纯化，在甲醇中沉淀。最终得到棕黑色固体产物in-ndi，将其储存在棕色的玻璃小瓶中，在4℃的环境中存放，通过核磁氢谱和紫外可见吸收光谱来验证聚合物in-ndi的成功合成。
41.结果显示，本实施例合成出来了一种新型的半导体聚合物in-ndi，产物的化学结构由1h nmr谱得到验证(图1)。in-ndi聚合物表现出电子给体-受体(d-a)交替主链、平面结构和强电子缺位，进而有nir区域的宽带光学吸收。凝胶渗透色谱(gpc)测定结果显示，in-ndi的数均分子量(mn)和重均分子量(mw)分别为35088da和99343da，多分散指数(pdi)为2.8(图2)。溶解在thf中的in-ndi的浓度和885nm处的吸收之间的线性关系如图3所示。
42.2、一氧化氮供体bnn6的合成与表征
43.按照文献(fan j,he n,he q,liu y,ma y,fu x,liu y,huang p,chen x.a novel self-assembled sandwich nanomedicine for nir-responsive release of no.nanoscale.2015dec 21；7(47):20055-62.doi:10.1039/c5nr06630a.epub 2015nov 16.pmid:26568270；pmcid:pmc4666708.)报道的方法合成了n，n'-二仲丁基-n，n'-二亚硝基-对苯二胺(bnn6)。具体如下：将2.34ml bpa稀释到18ml乙醇中，然后在搅拌和氮气保护下与nano2溶液(20ml6m)混合。30分钟后，滴加盐酸溶液(20ml 6m)。搅拌4小时后，通过离心法收集米色固体产品，并在冷冻真空下干燥过夜。通过核磁氢谱来验证bnn6的成功合成。本实施例用质子核磁共振谱(1h nmr)对纯化的bnn6进行了表征，如图4所示。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ7.52(4h),4.95-4.69(2h),2.00-1.84(2h),1.81-1.69(2h),1.48(t,j＝7.6hz,6h),1.08(td,j＝7.4,5.3hz,6h)。
44.3、cpnps的制备
45.以四氢呋喃(thf)为溶剂分别配制两种溶液：in-ndi溶液和f127溶液，in-ndi溶液浓度为1mg/ml，f127溶液浓度为10mg/ml，将以上两种溶液按体积比1∶2(共3ml)混合并稀释至20ml，剧烈搅拌。然后，在超声下，将1ml混合溶液迅速注入10ml去离子水中(溶剂疏水性的改变导致疏水性部分聚集形成纳米颗粒)，混合物在冰水浴中继续超声5min，并用氮气除去四氢呋喃(thf)。将剩余的纳米粒经0.22μm滤膜过滤纯化后，浓缩至600μg/ml，最后将收集到的纳米颗粒保存在4℃冰箱中。
46.4、cpnpbs的制备
47.以四氢呋喃(thf)为溶剂分别分别配制三种溶液：in-ndi溶液、bnn6溶液、f127溶液，in-ndi溶液浓度为1mg/ml，bnn6溶液浓度为1mg/ml，f127溶液浓度为10mg/ml，将以上三种溶液按体积比1∶1∶2(共4ml)混合在一起并稀释至20ml，剧烈搅拌。然后，在超声下，将1ml混合溶液迅速注入10ml去离子水中，混合物在冰水浴中继续超声5min，并用氮气除去四氢呋喃(thf)。将剩余的纳米粒经0.22μm滤膜过滤纯化后，经超滤离心管过滤，反复洗涤三次，以洗去未包裹的bnn6，收集上层纳米粒子，浓缩至600μg/ml，最后将收集到的纳米颗粒保存在4℃冰箱中。回收过滤液，测试紫外可见光吸收曲线，取其在248nm处的吸收值，对照bnn6的标准曲线，计算cpnpbs中bnn6的负载率为70.15％，图7a和图7b。
48.制备得到的cpnpbs在透射电镜(tem)下呈现球形形貌(图5a)，粒径在100nm左右。
动态光散射(dls)显示的水合粒径集中在为103nm左右(图5b)，分别测试了cpnps、cpnpbs、bnn6的吸收光谱(图5c)，从吸收光谱中可以看出，cpnpbs成功合成，此外，zeta电位结果表明，cpnps和cpnpbs都具有-28mv和-21mv的负电位(图5d)，表明纳米粒子可以在水溶液中保持稳定，重要的是，在一周之内，纳米粒子的电势基本保持不变(图6a和图6b)，zeta电势和dls表明，制备不同批次的cpnpbs具有良好的重现性(图5e和5f)。
49.5、光热效应和光稳定性
50.所制备的cpnps和cpnpbs在nir窗口也能表现出广泛的吸收，可以作为nir-ii光热治疗的光热试剂，进一步在体内利用。为了评估cpnps和cpnpbs的光热性能，通过记录808nm近红外光照射下的温度变化来研究cpnps(cpnpbs)的光热效应。
51.采用不同的光功率密度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1w/cm2)激光辐照cpnps和cpnpbs溶液研究光功率密度的依赖性，cpnps溶液浓度为100g/ml，制备cpnpbs溶液时in-ndi浓度为100μg/ml，bnn6为100μg/ml。
52.另外，在808nm(0.6w/cm2)的近红外照射下，采用不同的浓度(0、10、20、40、60、80、100μg/ml)cpnps溶液研究浓度依赖性。
53.在808nm激光照射下，cpnps和cpnpbs溶液在不同功率密度近红外照射下的温度变化如图8a和图8b所示，结果表明cpnps和cpnpbs具有较强的近红外激光功率密度依赖性。
54.图8c绘制了在808nm(0.6w/cm2)的激光连续照射下，不同浓度(0～100μg/ml)的cpnps溶液的温度变化曲线，图8c中结果显示，较高浓度(如80、100μg/ml)的溶液，在照射10min后，温度最高可以达到59.8℃；溶液的最高温度随着溶液浓度的降低而降低。
55.利用红外热像图可以直观地看到，四种不同溶液(pbs 0.1m、bnn6100μg/ml、cpnps100μg/ml和cpnpbs100μg/ml)在808nm(0.6w/cm2)激光照射下的温度变化，cpnpbs溶液的最高温度可达到60℃(图8d)，基本满足ptt(》43℃)的散热要求。
56.为了评估cpnps和cpnpbs溶液的光热稳定性，100μg/mlcpnps和cpnpbs的可循环温度变化如图9和图8e所示，cpnps和cpnpbs在五个连续的加热/冷却循环中具有稳定的光热能力。
57.6、cpnps和cpnpbs的光热转换效率
58.光热转换效率是评估光热转换能力的一个重要的参数，为了测量光热转换效率，在ep管中加入0.5ml的100μg/mlcpnps(或cpnpbs)水溶液。然后将纳米粒子水溶液置于808nm(0.6w/cm2)激光照射下达到温度平衡，关闭激光器，溶液温度冷却至室温。光热转换效率(η)计算如下：
[0059][0060]
式中h代表b@p@c的传热系数；s代表容器的表面积；tmax和tmin分别代表整个过程的最高温度和室温；qdis代表水的散热量。i是照射激光功率(0.6w/cm2)，a
808
是cpnps(cpnpbs)在808nm处的吸光度。hs的结果通过以下公式计算。
[0061][0062]
其中τs是溶液传热的时间常数，可以根据图8中的测量值得到(τ
scpnps
＝191.5468,τ
scpnpbs
＝160.82178)；m为溶解纳米颗粒的去离子水的质量(500mg)，c为水的热容(4.2j/g)。系统换热的时间常数可以通过激光关闭后的冷却时间与温度变化的负自然对数的曲线
得到(图10和图8f)，经计算，cpnps和cpnpbs的光热转换效率分别为55.6％和46％。
[0063]
7、一氧化氮标准曲线
[0064]
使用一氧化氮检测试剂盒，将1m nano2标准溶液稀释成以下浓度：60μm、40μm、20μm、15μm、10μm、5μm。将900μlgriess试剂i、900μlgriess试剂ii和900μlnano2溶液混合均匀，然后测试混合溶液的紫外吸收曲线。绘制不同浓度的nano2在540nm处吸收值的标准曲线。最后得到标准曲线方程为：y＝0.01249x+0.00708。
[0065]
8、cpnpbs体外no检测
[0066]
in-ndi是一种优异的光热试剂，本实施例将in-ndi和bnn6混合，并利用f127通过纳米再沉淀法将两者包覆在一起制备亲水性的纳米粒子，in-ndi在808nm的近红外激光照射下一部分产生热量，另一部分转换为电子供bnn6释放no所用。采用经典griess法定量研究了cpnpbs中的no的释放行为，验证了近红外光控制no的产生。
[0067]
为了检测cpnpbs释放的no，将浓度为100μg/ml的cpnpbs水溶液置于离心管中，用808nm(0.6w/cm2)激光照射离心管。以10min为间隔，将150μl溶液转移到96孔板中，然后加入150μl的griessi和griessii。用酶标仪测定540nm处的吸光度。根据得到的no浓度吸收值标准曲线计算no的释放量。
[0068]
no浓度吸收值标准曲线如图11a和图11b所示。
[0069]
当in-ndi和bnn6结合形成cpnpbs之后，cpnpbs对近红外光变得十分敏感(图12a～c)，将cpnpbs中in-ndi的浓度调整为100μg/ml，负载不同量bnn6(5、10、25、50和100μg/ml)的制备不同的cpnpbs溶液，在808nm(0.6w/cm2)的激发光照射10min下，no释放量随着bnn6的浓度增高而随之增加(图12a)，当bnn6的负载量为100μg ml-1
时，no的释放量可达到20.9μg/ml。此外，还研究了cpnpbs在不同功率密度的808nm近红外激发光下的no释放图，可以发现cpnpbs溶液对近红外光的响应具有功率密度依赖性(图12b)。
[0070]
进一步研究了cpnpbs释放no的近红外光可控性，当近红外光打开时，no快速释放，一旦关闭近红外时，no的释放变得十分缓慢，伴有少量的延迟释放(图12c)，这表明cpnpbs溶液对no释放具有良好的近红外光可控性。通过控制近红外光的开关和功率，可以很好地按需控制no浓度，这对于在治疗窗口内操纵药物浓度，降低no中毒风险具有重要意义。
[0071]
实施例2细胞实验
[0072]
1、细胞培养及毒性试验
[0073]
用含10％胎牛血清(fbs)、1％青霉素、1％链霉素的dmem细胞培养基培养hela细胞、mcf-7细胞和4t1细胞。所有细胞均在细胞培养瓶中于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。
[0074]
2、cpnps和cpnpbs的细胞毒性研究
[0075]
采用mtt法和活/死细胞染色法评价纳米粒对hela细胞和mcf-7细胞的毒性和光热毒性。
[0076]
mtt法测毒性：将不同浓度的cpnps和cpnpbs分别孵育mcf-7细胞和hela细胞，在黑暗条件下采用mtt法测定细胞活力。具体的，将mcf-7/hela细胞以每孔7000个细胞接种于96孔板中，培养24h。次日，用含有不同浓度cpnps(0、20、40、60、80、100、150、200μg/ml)和cpnpbs(0、20、40、60、80、100、150、200μg/ml)的dmem细胞培养基孵育细胞，12h后每孔加入20μl mtt溶液(5mg/ml)，37℃继续孵育4h。然后移除溶液，每孔加入150μl二甲基亚砜(dmso)。最后将96孔板振荡5min，用酶标仪测定490nm处的吸光度，对照组为未经处理的细
胞，计算细胞存活率。细胞存活率(cpr)计算公式：cpr＝(实验组吸收值的平均值-调零组吸收值的平均值)/(对照组吸收值的平均值-调零组吸收值的平均值)。
[0077]
结果如图13a和13c所示，细胞活力都超过了85％，因此，cpnps和cpnpbs在黑暗条件下细胞毒性不显著，生物相容性良好。
[0078]
光热毒性：体外光热毒性也是利用mtt检测评估的，方法同上，不同之处在于：用含有不同浓度cpnps(0、20、40、60、80、100、150、200μg/ml)和cpnpbs(0、20、40、60、80、100、150、200μg/ml)的基础培养基dmem孵育细胞后，先在培养箱里培养4h，接着置于808nm(0.6w/cm2)的nir激光下照射每孔细胞，持续5min，照射完之后接着培养12h后，然后移除溶液，每孔加入150μl二甲基亚砜(dmso)。最后将96孔板振荡5min，用酶标仪测定490nm处的吸光度，对照组为未经处理的细胞，计算细胞存活率。细胞存活率(cpr)计算公式：cpr＝(实验组吸收值的平均值-调零组吸收值的平均值)/(对照组吸收值的平均值-调零组吸收值的平均值)。
[0079]
结果显示，808nm(0.6w/cm2)的激发光照射每孔细胞持续5min后，细胞活力出现明显下降的趋势(图13b和13d)，用100μg/mlcpnps孵育的细胞成活率可下降至41％，而加载了bnn6的cpnpbs溶液由于在光照条件下可以产生致死癌细胞的no，cpnpbs孵育的细胞活力随着bnn6加载量的增多(5～100μg/ml)而逐渐下降，细胞活力则下降至9％，因此可以得出结论，光热效应与no的双重作用会产生更好的治疗效果。
[0080]
活/死细胞染色：为了进一步检测cpnpbs的细胞光热毒性，使用ao/eb双荧光染料法检测hela细胞的凋亡。具体的：将mcf-7/hela细胞以每孔20万个细胞的数量接种于12孔板中，培养24h，吸出原培养基，加入含有不同处理试剂的培养基dmem继续孵育细胞12h(1)pbs；(2)pbs+nir；(3)cpnps；(4)cpnps+nir；(5)cpnpbs nps；(6)cpnpbs+nir，上述处理中，pbs浓度为0.1m，所有纳米粒子的浓度均为100μg/ml，nir为808nm0.6w/cm2，光照为5min。弃去原培养液，每孔用pbs洗涤3次。将预先制备好的吖啶橙/溴化乙胺(ao/eb)荧光染料加入孔中，轻轻晃动孔板，使染色液均匀铺在细胞上。然后在荧光显微镜下观察细胞并拍照，绿色代表活细胞，红色代表死细胞。
[0081]
在荧光显微镜下观察到，在无光照条件下，所有浓度的cpnpbs无明显的细胞毒性。在光照条件下，与对照组相比，用cpnpbs处理过之后细胞毒性显著增强(图13e)，这些结果与mtt保持一致，说明ptt和no协同治疗可有效地杀死肿瘤细胞。
[0082]
实施例3动物实验
[0083]
1、动物模型的构建
[0084]
购买健康的雌性小鼠若干只，饲养在动物房中，将小鼠饲养在温度为24
±
2℃、湿度为60％的环境中，并提供循环水和食物。等到裸鼠6周龄，体重为20～30g时，分别在每只小鼠背侧皮下注射4t-1鼠源乳腺癌细胞，细胞量为5
×
107株，饲养一周后得到荷瘤小鼠。每天用卡尺测量小鼠的肿瘤大小。
[0085]
2、体内光热治疗
[0086]
当小鼠背部肿瘤长到90～120mm3时，将小鼠随机分为6组，每组5只，分别做以下处理：
[0087]
a)肿瘤部位注射pbs 0.1m60μl；
[0088]
b)肿瘤部位注射pbs0.1m60μl，24h后，用808nm nir光照5min，光功率密度为0.6w/
cm2；c)肿瘤部位注射cpnps60μl，浓度为100μg/ml；
[0089]
d)肿瘤部位注射cpnps60μl，浓度为100μg/ml,24h后，用808nm nir光照5min，光功率密度为0.6w/cm2；
[0090]
e)肿瘤部位注射cpnpbs 60μl，浓度为100μg/ml；
[0091]
f)肿瘤部位注射cpnpbs 60μl，浓度为100μg/ml,24h后，用808nm nir光照5min，光功率密度为0.6w/cm2。
[0092]
每隔一天测量肿瘤的长度和宽度，并按照以下公式计算肿瘤的体积：
[0093]
v＝l/2
×
w2。
[0094]
3、生物安全性研究
[0095]
用红外热相机分别记录每只小鼠肿瘤部位在808nm(0.6w/cm2)照射10min的红外热像图，cpnps和cpnpbs温度都能升高到65℃(图14a)，而pbs组只能升高至34.3℃，说明cpnps和cpnpbs在体外具有良好的治疗效果。在体内光热效应得到验证后，对不同治疗后的肿瘤生长进行了28天的监测(图14b)，以比较治疗效果，在没有激光照射的情况下，cpnps和cpnpbs处理的小鼠生长与pbs组相似，而在激光照射下，ptt抑制了cpnps和cpnpbs处理小鼠的肿瘤生长，相比之下，cpnpbs和激光照射治疗小鼠的肿瘤生长在监测的28天内表现出更显著的抑制作用。除此之外，每隔5天小鼠体重，结果表示，所有小鼠的体重没有明显变化，证明所有药物都没有影响小鼠的生长(图14c)。
[0096]
第28天，小鼠被安乐处死。将处死后的小鼠，取出肿瘤和主要器官(心肝脾肺肾)，将收集的肿瘤和主要的器官浸泡在10％的中性福尔马林将其固定，脱水至透明，接着使用石蜡包埋。将包埋好的石蜡块切成4μm的切片，然后用苏木精-伊红(h&e)染色。最后，用显微镜拍摄组织切片的照片。
[0097]
在苏木精和伊红(h&e)染色图像中(图14d)，各组的小鼠的肾脏、脾脏和肝脏等主要脏器没有明显的生理学和形态学的损伤，因此可以得出结论在保证治疗期间的主要脏器没有明显的损伤的情况下还可以有效地杀死肿瘤细胞，大大降低了全身毒性。
[0098]
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

技术特征：
1.一种近红外光调节的共轭聚合物复合纳米粒子cpnps的制备方法，其特征在于，将in-ndi溶液和f127溶液混合，将混合液加到去离子水中，冰水浴下超声2～5分钟，再旋蒸去除in-ndi溶液和f127溶液的溶剂，过滤，纯化后即得；in-ndi采用以下方法制备而成：将in的甲苯溶液和ndi的甲苯溶液混合，加入催化剂pd(pph3)4， 110 ℃下反应48 h，然后用（4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼烷-2-基）苯和溴苯除去端基，纯化，沉淀，最终得到in-ndi。2.根据权利要求1所述的一种近红外光调节的共轭聚合物复合纳米粒子cpnps的制备方法，其特征在于，in-ndi溶液的浓度为1 mg/ml，f127溶液浓度为10 mg/ml，混合时in-ndi和f127的体积比1:2。3.采用权利要求1～2任一项所述的方法制备得到的复合纳米粒子cpnps。4.一种近红外光调节的共轭聚合物复合纳米粒子cpnpbs的制备方法，其特征在于，将in-ndi溶液、bnn6溶液和f127溶液混合，将混合液加到去离子水中，冰水浴下超声2～5分钟，去除in-ndi溶液、bnn6溶液和f127溶液的溶剂，过滤，洗涤，即得。5.根据权利要求4所述的一种近红外光调节的共轭聚合物复合纳米粒子cpnpbs的制备方法，其特征在于，in-ndi溶液浓度为1 mg/ml，bnn6溶液浓度为1 mg/ml，f127溶液浓度为10 mg/ml，混合时将in-ndi溶液、bnn6溶液和f127溶液按体积比1∶1∶2混合。6.采用权利要求4～5任一项所述的方法制备得到的复合纳米粒子cpnpbs。7.权利要求3所述的复合纳米粒子cpnps在制备肿瘤抑制药物中的应用。8.权利要求6所述的复合纳米粒子cpnpbs在制备肿瘤抑制药物中的应用。9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤抑制药物在光功率密度为0.6w/cm2的808nm近红外光照射下使用，所述的肿瘤为乳腺癌细胞形成的肿瘤。

技术总结
本发明属于光热气体治疗技术领域，具体涉及近红外光调节的共轭聚合物复合纳米粒子及其制备方法和应用。本发明开发了近红外光调节的共轭聚合物复合纳米粒子CPNPs和CPNPBs。复合纳米粒子CPNPs为具有近红外（NIR）响应的纳米颗粒，复合纳米粒子CPNPBs可作为近红外（NIR）响应的光热纳米载体和癌细胞中NO生成器。此外，上述复合纳米粒子均表现出优异的生物相容性和热效应。更重要的是，复合纳米粒子CPNPBs的光热性能与NO发生性能的结合为杂化纳米材料的制备提供了新的路径，利用该具有近红外光激活的复合纳米粒子CPNPBs可以实现光热/气体双模式精准治疗。热/气体双模式精准治疗。热/气体双模式精准治疗。


技术研发人员：常开文 孙晓琳 齐乔芳 张杨 倪天军 杨志军
受保护的技术使用者：新乡医学院
技术研发日：2023.03.16
技术公布日：2023/7/7