一种高密度发酵的低内毒素大肠杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种高密度发酵的低内毒素大肠杆菌及其应用。


背景技术：

2.内毒素又名脂多糖，是革兰氏阴性细菌细胞壁的一种成分，会伴随着细菌的生长分裂、死亡或者裂解而释放到周围环境中。内毒素在化学结构上主要由短链不重复的核心多糖、长链的o-特异性抗原多糖和疏水的类脂a组成。类脂a是内毒素的活性中心，包括两个磷酸基团以及六条脂肪酸链，这种结构能够最有效的刺激机体产生免疫炎症反应，同时脂肪酸链的长度，数量以及结合在碳骨架上的位置和1’和4’的磷酸基团都是影响类脂a刺激tlr4/md2通路以及caspase-11通路的重要影响因子。类脂a会激活机体tlr4/md2/cd14通路，刺激机体分泌多种细胞因子从而导致免疫反应，严重时会导致感染性休克甚至死亡(nat rev microbio 2010，8，8-14)。
3.在大肠杆菌中由多种酶共同参与催化脂多糖的合成途径。lipid iva分子是脂多糖合成过程中非糖基化的前体物质，在其骨架上添加2分子由异构酶kdsd或gutq催化形成的kdo分子后得到kdo2-lipid iva分子(j bacteriol 2005，187，6936
–
42)。在此基础上，再由月桂酰基转移酶lpxl(htrb)以及由肉豆蔻酰基转移酶lpxm(msbb)分别引入一条含十二碳以及含十四碳的脂肪酸链，形成kdo2-lipid a分子。在低温(12℃)条件下，kdo2-lipid iva棕榈油酰-acp酰基转移酶lpxp被诱导表达，以月桂酸盐为代价加入不饱和的十六碳酰基链(jbiol chem 2002，277，14186
–
93)。在脂多糖合成过程中存在多种修饰，如棕榈酰转移酶pagp可以向lipid a(类脂a)中添加一条十六碳脂肪酸链；乙醇胺磷酸转移酶epta可以向lipid a中添加一个乙醇胺磷酸基团(annu rev biochem2007，76，295
–
329)。abc转运蛋白msba在脂多糖合成过程中参与核心寡糖-lipid a分子的转运，msba 52或148位碱基突变被证实为kdo缺失突变体的抑制因子(mol microbiol 2008，67，633
–
48)。
4.大肠杆菌tak菌株是可高密度发酵的原核表达菌株，被用于重组蛋白的大规模生产。然而内毒素残留使重组蛋白产品在制药领域的应用受到了一定的限制，并且目前重组蛋白产品中内毒素的去除技术普遍存在成本高、操作繁琐以及去除不彻底的缺陷。因此本发明选择利用基因编辑技术改造脂多糖合成或修饰途径，从源头最大限度地降低大肠杆菌表达系统自身的内毒素活性。


技术实现要素：

5.本发明目的在于提供一种高密度发酵的低内毒素大肠杆菌及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。具体是利用基因敲除技术，使得大肠杆菌菌株不含与脂肪酸链转移酶合成有关的基因，且不含参与kdo分子的合成以及磷酸基团修饰的相关基因：lpxp、lpxl、lpxm、pagp、kdsd、gutq、epta；同时，对脂多糖转运蛋白msba的编码基因进行点突变，得到本发明的低内毒素大肠杆菌原核表达系统cleantak系列工程菌株。进一步的，将相关
的工程菌株命名为cleantak 3α、cleantak 4α、cleantak 5α、cleantak 6α、cleantak 7、cleantak7m。其中，cleantak 3α为敲除epta、kdsd和pagp基因的工程菌株；cleantak4α为敲除epta、kdsd、pagp和lpxl基因的工程菌株；cleantak 5α为敲除epta、kdsd、pagp、lpxl和lpxp基因的工程菌株；cleantak 6α为敲除epta、kdsd、pagp、lpxl、lpxp和lpxm基因的工程菌株；cleantak 7为敲除epta、kdsd、pagp、lpxl、lpxp、lpxm和gutq基因的工程菌株；cleantak 7m为敲除epta、kdsd、pagp、lpxl、lpxp、lpxm和gutq基因以及msba基因点突变的工程菌株。
6.为达成上述目的，本发明提出如下技术方案：
7.本发明目的之一在于提供一种高密度发酵的低内毒素大肠杆菌及其应用，所述低内毒素大肠杆菌的分类命名为escherichia coli cleantak 5α，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 20221904，保藏时间为2022年12月09日。
8.本发明还提供了escherichia coli cleantak 5α用于表达蛋白/多肽类物质中的应用，包括但不仅限于蛋白/多肽药物、蛋白/多肽类试剂、蛋白/多肽类食品(如甜蛋白、人造肉等)，以及如蜘蛛丝等蛋白/多肽类生物材料。
9.本发明还提供了escherichia coli cleantak 5α用于制备酶产品的应用，包括但不仅限于蛋白酶产品(如羧肽酶、胰蛋白酶，肠激酶等)、体外合成mrna的工具酶(如t7 rna聚合酶、甲基转移酶、牛痘病毒加帽酶、无机焦磷酸酶、dnase i、rnase抑制剂、全能核酸酶等)、饲料酶(蛋白酶、植酸酶、纤维素酶、半纤维素酶等)、生物化工酶(甲基酶、消旋酶、酰基化酶等)等。
10.本发明还提供了escherichia coli cleantak 5α用于制备质粒中的应用，如用于基因治疗、dna疫苗、mrna的制备等。
11.本发明还提供了escherichia coli cleantak 5α合成生物学的底盘，用于制备次生代谢产物，如聚羟基脂肪酸酯、青蒿酸、紫杉二烯、正丁醇等。
12.本发明目的之二在于提供一种高密度发酵的低内毒素大肠杆菌及其应用，所述低内毒素大肠杆菌的分类命名为escherichia coli cleantak 6α，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 20221905，保藏时间为2022年12月09日。
13.本发明还提供了escherichia coli cleantak 6α用于表达蛋白/多肽类物质中的应用，包括但不仅限于蛋白/多肽药物、蛋白/多肽类试剂、蛋白/多肽类食品(如甜蛋白、人造肉等)，以及如蜘蛛丝等的蛋白/多肽类生物材料。
14.本发明还提供了escherichia coli cleantak 6α用于制备酶产品的应用，包括但不仅限于蛋白酶产品(如羧肽酶、胰蛋白酶，肠激酶等)，体外合成mrna的工具酶(如t7 rna聚合酶、甲基转移酶、牛痘病毒加帽酶、无机焦磷酸酶、dnase i、rnase抑制剂、全能核酸酶等)、饲料酶(蛋白酶、植酸酶、纤维素酶、半纤维素酶等)、生物化工酶(甲基酶、消旋酶、酰基化酶等)等。
15.本发明还提供了escherichia coli cleantak 6α用于制备质粒中的应用，如用于基因治疗、dna疫苗、mrna的制备等。
16.本发明还提供了escherichia coli cleantak 6α用于合成生物学的底盘，用于制备次生代谢产物，如聚羟基脂肪酸酯、青蒿酸、紫杉二烯、正丁醇等。
17.本发明目的之三在于提供一种高密度发酵的低内毒素大肠杆菌及其应用，所述低
内毒素大肠杆菌的分类命名为escherichia coli cleantak 7m，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 20221906，保藏时间为2022年12月09日。
18.本发明还提供了escherichia coli cleantak 7m用于表达蛋白/多肽类物质中的应用，包括但不仅限于蛋白/多肽药物、蛋白/多肽类试剂、蛋白/多肽类食品(如甜蛋白、人造肉等)，以及如蜘蛛丝等蛋白/多肽类生物材料。
19.本发明还提供了escherichia coli cleantak 7m用于制备酶产品的应用，包括但不仅限于蛋白酶产品(如羧肽酶、胰蛋白酶、肠激酶等)，体外合成mrna的工具酶(如t7 rna聚合酶、甲基转移酶、牛痘病毒加帽酶、无机焦磷酸酶、dnase i、rnase抑制剂、全能核酸酶等)、饲料酶(蛋白酶、植酸酶、纤维素酶、半纤维素酶等)、生物化工酶(甲基酶、消旋酶、酰基化酶等)等。
20.本发明还提供了escherichia coli cleantak 7m用于制备质粒中的应用，如用于基因治疗、dna疫苗、mrna的制备等。
21.本发明还提供了escherichia coli cleantak 7m用于合成生物学的底盘，用于制备次生代谢产物，如聚羟基脂肪酸酯、青蒿酸、紫杉二烯、正丁醇等。
22.与现有技术相比，本发明的主要优点是：
23.1.大肠杆菌tak菌株是可高密度发酵的表达宿主菌，但是在应用生产中由于受内毒素的影响，制约重组蛋白的表达，进而影响了大肠杆菌tak菌株在生物医药行业中的应用。本发明利用基因编辑方法，对类脂a合成、修饰与参与脂多糖转运相关酶等基因进行改造，降低了脂多糖含量，得到的工程菌株内毒素含量显著降低，降低了重组蛋白、质粒或次生代谢产物去除内毒素的成本，从而减少了重组蛋白、质粒或次生代谢产物产品生产的成本，同时提高了重组蛋白、质粒或次生代谢产物产品的安全性。
24.2.本发明提供的低内毒素活性cleantak系列工程菌株仍然保留了亲本tak菌株的高密度发酵、生长快速、高效表达各类蛋白或合成质粒的能力，但同时显著降低了内毒素的含量，可用于低成本生产各类高质量蛋白/多肽、核酸或次生代谢产物。其生长速率随基因编辑数量的增加虽受到一定的抑制，将其用于表达蛋白，其表达蛋白的能力与亲本株比较也无差异。
25.应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本发明主题公开的一部分。
26.从下面的描述中可以更加全面地理解本发明教导的前述和其他方面、实施例和特征。本发明的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有益效果将在下面的描述中显见，或通过根据本发明教导的具体实施方式的实践中得知。
附图说明
27.图1：是本发明中构建低内毒素大肠杆菌原核表达系统工程菌cleantak系列工程菌株的pcr鉴定电泳结果；
28.图2：是本发明中cleantak系列工程菌株全细胞内毒素活性检测结果；
29.图3：是本发明中cleantak系列工程菌株高密度发酵时的生长特性结果；
30.图4：是本发明中cleantak系列工程菌株脂质a纯化后进行高分辨质谱的结果；图5：是本发明中含peingl表达质粒的cleantak系列工程菌株发酵及甘精胰岛素原蛋白表达
结果。
具体实施方式
31.下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
32.本发明提供了一种高密度发酵的低内毒素大肠杆菌及其应用，具体为所述低内毒素大肠杆菌菌株不含与脂肪酸链转移酶合成有关的基因，且不含参与kdo分子的合成以及磷酸基团修饰的相关基因：lpxp、lpxl、lpxm、pagp、kdsd、gutq、epta。同时，对脂多糖转运蛋白msba的编码基因进行点突变，得到cleantak 3α、cleantak 4α、cleantak 5α、cleantak 6α、cleantak 7m工程菌株。其中，cleantak 3α为敲除epta、kdsd和pagp基因的工程菌株；cleantak 4α为敲除epta、kdsd、pagp和lpxl基因的工程菌株；cleantak 5α为敲除epta、kdsd、pagp、lpxl和lpxp基因的工程菌株；cleantak 6α为敲除epta、kdsd、pagp、lpxl、lpxp和lpxm基因的工程菌株；cleantak 7m为敲除epta、kdsd、pagp、lpxl、lpxp、lpxm和gutq基因以及msba基因点突变的工程菌株。相关的基因核苷酸序列信息表如下表：
33.序列名称核苷酸序列eptaseq id no.1kdsdseq id no.2pagpseq id no.3lpxlseq id no.4lpxpseq id no.5lpxmseq id no.6gutqseq id no.7msbaseq id no.8
34.进一步的，一种高密度发酵的低内毒素大肠杆菌的构建方法包括如下步骤：
35.1)将温敏型pcas质粒热激转化至大肠杆菌tak细胞，经卡那霉素(50μg/ml)抗性筛选，得到阳性克隆；
36.2)构建ptarget质粒表达靶向sgrna；
37.3)扩增目标基因的上下游同源臂并通过soe pcr将其融合；
38.4)将步骤2)所得质粒与步骤3)所得同源臂片段电转入步骤1)所得的菌株中，经壮观霉素(50μg/ml)与卡那霉素双重抗性筛选，得到阳性克隆；
39.5)通过pcr筛选得到敲除靶标基因的工程菌株；
40.6)消除ptarget质粒与pcas质粒。
41.这样，通过crispr-cas9基因编辑技术(aem 2015，8，2506-14)，将大肠杆菌tak菌株基因组上参与调控脂多糖合成及修饰相关酶合成的基因敲除，得到低内毒素大肠杆菌原核表达系统cleantak系列工程菌株。所述的低内毒素大肠杆菌原核表达系统cleantak系列工程菌株，它缺失了调控类脂a脂肪酸链合成的lpxp、lpxl、lpxm、pagp基因，从而使工程菌株类脂a结构变成含有4条脂肪酸链的结构；此外，它不含参与kdo分子的合成的gutq基因、不含磷酸基团修饰的epta基因，使得工程菌株仅能合成不含内毒素活性的lipid iva分子。
65.以ptarget质粒dna作为模板，分别进行pcr扩增构建重组质粒的插入片段(insert)与载体(vector)片段。pcr扩增反应是在20μl的体系中进行，反应体系如下：模板dna 2μl，2
×
高保真dna酶预混液，购自诺唯赞(南京)生物科技有限公司10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，ddh2o 6μl。扩增条件为：94℃预变性5min后进入循环，循环参数为94℃30sec，53℃insert20sec、vector 2min，72℃30sec。30个循环后，72℃延伸10min。扩增的pcr产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，扩增片段大小分别为290bp与1770bp，与预期大小相当。
66.对pcr进行纯化回收后将得到的insert与vector片段使用购自上海翌圣公司的一步法克隆实验试剂盒进行连接，一般采用10μl反应体系，5μl一步法克隆重组酶预混液，insert 3μl，vector 2μl。将反应液于50℃水浴25min后立马放置冰上静置5min，再将其热激转化至e.coli dh5α感受态细胞中，涂布至含有50μg/ml壮观霉素的lb平板中，于37℃培养箱过夜培养。第二天从平板上挑取单菌落划线至另一新鲜壮观霉素抗性平板上。运用snapgene软件设计扩增引物由生工生物工程(上海)有限公司基因合成，引物序列如下：
67.s-sgrna-f：5’cgaccgagcgcagcgagtca 3’68.s-sgrna-r：5’catctcgaaccgacgttgct 3’69.提取上述划线单菌落的基因组dna作为模板进行pcr扩增验证，pcr扩增反应是在20μl的体系中进行，反应体系如下：模板dna 2μl，2
×
高保真dna酶预混液，购自诺唯赞(南京)生物科技有限公司10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，ddh2o 6μl。扩增条件为：94℃预变性5min后进入循环，循环参数为94℃30sec，53℃30sec，72℃30sec。30个循环后，72℃延伸10min。扩增的pcr产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，扩增片段大小460bp，与预期大小相当。将pcr产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序分析，确保将设计的20bp靶向序列构建在ptarget质粒的grna scaffold前，成功构建重组质粒ptarget-sgrna-epta。保存筛选出的阳性转化子。
70.3、epta基因上、下游同源臂的扩增以及融合
71.在tak基因组序列中设计两对融合pcr引物分别扩增epta基因上、下同源臂，扩增片段大小均为400bp，所述引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列如下：
72.epta-up-f:5’aaagagttcggtctggtttcttccg 3’73.epta-up-r:5’atcagaatttcacggtgtttccatcgaacaaagtg 3’74.epta-down-f:5’aaacaccgtgaaattctgattgttgaagacgatac 3’75.epta-down-r:5’ttcagcgtcagattgccaacaatca 3’76.提取处于对数生长期的tak菌株基因组dna作为模板进行pcr扩增验证，pcr扩增反应是在20μl的体系中进行，反应体系如下：模板dna 2μl，2
×
高保真dna酶预混液，购自诺唯赞(南京)生物科技有限公司10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，ddh2o 6μl。扩增条件为：94℃预变性5min后进入循环，循环参数为94℃30sec，53℃30sec，72℃30sec。30个循环后，72℃延伸10min。扩增的pcr产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，扩增片段大小400bp，与预期大小相当。
77.上下游同源臂的融合：将扩增所得的上、下游同源臂各添加1μl作为重叠延伸pcr的模板，利用引物epta-up-f和epta-down-r在与之前相同的扩增体系下进行扩增，扩增条件为94℃预变性5min后进入循环，循环参数为94℃30sec，53℃30sec，72℃1min。30个循环
后，72℃延伸10min。得到大小为800bp的同源臂融合片段，将该pcr产物使用购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司的pcr产物纯化试剂盒进行纯化回收。
78.4、epta基因缺失工程菌株的构建与鉴定
79.将构建好的ptarget-sgrna-epta重组质粒与融合的同源臂片段电转至大肠杆菌tak(pcas)菌株中，涂布至含壮观霉素与卡那霉素双抗性平板上，置于30℃培养箱过夜培养。挑取单菌落划线至新的双抗平板上培养，再提取其基因组作为模板进行pcr扩增验证，pcr扩增反应是在20μl的体系中进行，反应体系如下：模板dna 2μl，2
×
高保真dna酶预混液，购自诺唯赞(南京)生物科技有限公司10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，ddh2o 6μl。扩增条件为：94℃预变性5min后进入循环，循环参数为94℃30sec，53℃30sec，72℃30sec。30个循环后，72℃延伸10min。扩增的pcr产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，扩增片段大小1000bp，与预期大小相当。所用引物序列如下：
80.u-epta-f:5’ctgcgggttgcttaggttcactggg 3’81.u-epta-r:5’tgttggtcgagggttcattgtccca 3’82.将条带大小符合预期的pcr产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序分析，测序结果与tak菌株基因组进行比对，确认epta基因被成功敲除，将该工程菌株命名为cleantak epta。
83.5、cleantak epta工程菌株中质粒的消除
84.将含ptarget与pcas双质粒的cleantak epta工程菌株转接至5ml含kan(50μg/ml)抗性的lb液体培养基中，再向其中加入终浓度为1mmol/l的iptg诱导pcas质粒上的sgrna表达，于30℃、180r/min的摇床中培养过夜。由于sgrna-pbr322 ori与cas9蛋白结合，切割ptarget复制原点，ptarget质粒无法正常复制，所以ptarget质粒丢失。将过夜培养后的菌株涂布至50μg/ml卡那霉素的lb固体平板上，培养后挑选单菌落分别点菌至只含kan抗性与于含spec与kan双重抗性的平板上验证ptarget质粒是否成功消除。挑选只含有pcas质粒的单菌落接种至5ml lb培养基中，于37℃、180r/min的摇床中培养过夜。由于pcas质粒为温度敏感型质粒，在37℃下无法正常复制，所以pcas质粒丢失，得到不含质粒的cleantak epta工程菌株。对于未消除pcas质粒的菌株进行-80℃保存，命名为cleantak epta(pcas)，用于构建双基因敲除工程菌株。
85.按照上述方法，将构建好的各靶标基因重组ptarget质粒与融合的同源臂片段电转至上一基因缺失工程菌株含有pcas质粒的细胞中。依次构建得到cleantak 2α、cleantak 3α、cleantak 4α、cleantak 5α工程菌株，其各菌株所敲除的基因组合如下：
86.cleantak 2α工程菌株：δeptaδkdsd
87.cleantak 3α工程菌株：δeptaδkdsdδpagp
88.cleantak 4α工程菌株：δeptaδkdsdδpagpδlpxl
89.cleantak 5α工程菌株：δeptaδkdsdδpagpδlpxlδlpxp
90.再进一步的，本实施例的工程菌株的相关鉴定pcr结果见图1a-e。
91.实施例2
92.与上述实施例1不同的是，在cleantak 5α工程菌株的基础上，将构建好的各靶标基因重组ptarget质粒与融合的同源臂片段电转至cleantak 5α工程菌株含有pcas质粒的细胞中，构建得到cleantak 6α工程菌株，其敲除基因组合为：δeptaδkdsdδpagpδlpxl
δlpxpδlpxm。
93.再进一步的，本实施例的工程菌株，其鉴定pcr结果见图1a-f。
94.实施例3
95.与上述实施例1不同的是，在cleantak 6α工程菌株的基础上，将构建好的各靶标基因重组ptarget质粒与融合的同源臂片段电转至cleantak 6α工程菌株含有pcas质粒的细胞中，构建得到cleantak 7工程菌株，其敲除基因组合为：δeptaδkdsdδpagpδlpxlδlpxpδlpxmδgutq。
96.再进一步的，本实施例的工程菌株构建包括以下步骤：
97.1、ptarget-sgrna-msba重组质粒的构建
98.在msba基因待突变位点就近寻找5
’‑
ngg序列，以ngg序列上游31bp作为sgrna的靶向序列，运用snapgene软件设计包含20bp且与ptarget质粒有20-25bp同源片段的下述引物，由生工生物工程(上海)有限公司基因合成：
99.msba-sg-if：
[0100]5’
gatctgttttaccaaagccatcatcaagaaggttttagagctagaaata gcaagtt 3’[0101]
msba-sg-ir：5’cgatcaacggcactgttgcaaatag 3’[0102]
msba-sg-vf：5’ctatttgcaacagtgccgttgatcg 3’[0103]
msba-sg-vr：
[0104]5’
ttcttgatgatggctttggtaaaacagatcactagtattatacctaggac tgagc 3’[0105]
以ptarget质粒dna作为模板，分别进行pcr扩增构建重组质粒的插入片段(insert)与载体(vector)片段。具体的质粒构建及验证实验操作同ptarget-sgrna-epta重组质粒的构建。
[0106]
2、msba基因含点突变位点片段的扩增以及融合
[0107]
设计两对融合pcr引物分别扩增msba基因点突变时所需外源片段，所述引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列如下：
[0108]
msba-s1-f:5’aaaagtggcactcgcatcgg 3’[0109]
msba-s1-r:
[0110]5’
cgatctgttttaccaaagccatcatcaagaagtgacttaag
[0111]
gagcgataacatgaaggt 3’[0112]
msba-s2-f:
[0113]5’
accttcatgttatcgctccttaagtcacttcttgatgatgg
[0114]
ctttggtaaaacagatcg 3’[0115]
msba-s2-r:5’aaaacgcttcgatacaacgc 3’[0116]
其中msba-s1-r和msba-s2-f引物中包含已突变的碱基，即其第35位碱基由g/c替换为a/t。
[0117]
提取处于对数生长期的tak菌株基因组dna作为模板进行pcr扩增验证，pcr扩增反应是在20μl的体系中进行，反应体系如下：模板dna 2μl，2
×
高保真dna酶预混液，购自诺唯赞(南京)生物科技有限公司10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，ddh2o 6μl。扩增条件为：94℃预变性5min后进入循环，循环参数为94℃30sec，53℃30sec，72℃30sec。30个循环后，72℃延伸10min。扩增的pcr产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，扩增片段大小400bp，与预期大
小相当。
[0118]
s1、s2片段的融合：将扩增所得的s1、s2片段各添加1μl作为重叠延伸pcr的模板，利用引物msba-s1-f和msba-s2-r在与之前相同的扩增体系下进行扩增，扩增条件为94℃预变性5min后进入循环，循环参数为94℃30sec，53℃30sec，72℃1min。30个循环后，72℃延伸10min。得到大小为800bp的融合片段，将该pcr产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序分析，确保所得片段包含已突变的碱基，剩余pcr产物使用购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司的pcr产物纯化试剂盒进行纯化回收。
[0119]
3、msba基因点突变工程株的构建与鉴定
[0120]
将构建好的ptarget-sgrna-msba重组质粒与融合的外源片段电转至大肠杆菌cleantak 7(pcas)菌株中，涂布至含壮观霉素与卡那霉素双抗性平板上，置于30℃培养箱过夜培养。挑取单菌落划线至新的双抗平板上培养，再提取其基因组作为模板进行pcr扩增验证，pcr扩增反应是在20μl的体系中进行，反应体系如下：模板dna 2μl，2
×
高保真dna酶预混液，购自诺唯赞(南京)生物科技有限公司10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，ddh2o 6μl。扩增条件为：94℃预变性5min后进入循环，循环参数为94℃30sec，53℃30sec，72℃30sec。30个循环后，72℃延伸10min。扩增的pcr产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，扩增片段大小1000bp，与预期大小相当。所用引物序列如下：
[0121]
u-msba-f:5’taacgggtagaatatgcggc 3’[0122]
u-msba-r:5’ctggcattcccatcatgtga 3’[0123]
将条带大小符合预期的pcr产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序分析，测序结果与tak菌株基因组进行比对，比对结果见图1a-h，确认msba基因成功点突变，将该工程菌株命名cleantak 7m。
[0124]
5、cleantak 7m工程菌株中质粒的消除
[0125]
将含ptarget与pcas双质粒的cleantak 7m工程菌株转接至5ml含kan(50μg/ml)抗性的lb液体培养基中，再向其中加入终浓度为1mmol/l的iptg诱导pcas质粒上的sgrna表达，于30℃、180r/min的摇床中培养过夜。由于sgrna-pbr322 ori与cas9蛋白结合，切割ptarget复制原点，ptarget质粒无法正常复制，所以ptarget质粒丢失。将过夜培养后的菌株涂布至50μg/ml卡那霉素的lb固体平板上，培养后挑选单菌落分别点菌至只含kan抗性、以及含spec与kan双重抗性的平板上，以验证ptarget质粒是否成功消除。挑选只含有pcas质粒的单菌落接种至5ml lb培养基中，于37℃、180r/min的摇床中培养过夜。由于pcas质粒为温度敏感型质粒，在37℃下无法正常复制，所以pcas质粒丢失，得到不含质粒的cleantak 7m工程菌株。
[0126]
实施例4
[0127]
本实施例涉及大肠杆菌cleantak系列工程菌株全细胞内毒素活性检测。具体如下：
[0128]
大肠杆菌tak菌株及cleantak系列工程菌株的内毒素活性检测方法如下所示：将待测各菌株接种于5ml lb的液体培养基，37℃振荡过夜培养，再取300μl接种至新鲜的30ml lb液体培养基中，37℃培养至od
600
≈0.7。取各菌株菌液4ml，5000rpm离心5min后弃上清，沉淀用4ml屈臣氏蒸馏水重悬后再次5000rpm离心5min，重复3次。用4ml的屈臣氏蒸馏水重悬沉淀后，取2ml使用分光光度计测定菌体悬液od
600
的值，以od
600
值为0.52为基准，将各菌体
悬液进行稀释调整。取上述各菌株菌体悬液1ml进行超声破碎，功率90w、超声破碎10min。将超声破碎好的溶液进行离心，8000rpm离心30min。收集上清液。将各菌株细胞裂解液上清进行梯度稀释，使用购于福州新北生化工业有限公司的细菌内毒素检测试剂盒(终点显色基质法)检测各菌株的全细胞内毒素活性，具体实验方法见其说明书，这里不再赘述。取200μl内毒素检测混合液于酶标板，使用酶标仪波长562nm测定吸光度，再根据标准曲线计算内毒素的活性。
[0129]
实施例1至3所述工程菌株的全细胞内毒素活性检测结果统计如图2所示，随着基因编辑数量的累积，所得的工程菌株的内毒素含量也呈下降趋势，cleantak 7m菌株内毒素含量下降最为显著，较野生tak菌株降低了96.39％。
[0130]
实施例5
[0131]
本实施例涉及大肠杆菌cleantak系列工程菌株的生长特性分析，具体如下：
[0132]
取亲本tak菌株以及内毒素活性显著下降的工程菌株cleantak 4α、cleantak 5α、cleantak 6α、cleantak 7和cleantak 7m各菌株冻存菌液100μl转接至5ml的lb试管培养基中，于33℃、220rpm摇床中培养15-16h。取以上各菌液的培养液1000μl转接至100ml 1/2tb培养基中，于33℃、220rpm摇床中培养5-8h(根据摇瓶菌体浓度决定培养时长)。设定发酵罐发酵体积7l，培养基配方：乳糖150g/l，酵母15g/l，sm 6.5g/l。将摇瓶培养的菌液转入发酵罐中，设定发酵参数：温度33℃、转速650rpm、通气量9.5l/min、罐压0.02mpa，控制发酵ph6.7进行发酵培养。发酵过程中每隔3h测定od
600
和菌体含量，绘制发酵生长曲线如图3，cleantak 4α、cleantak 5α与cleantak 6α菌株在高密度发酵罐中可以进行高密度生长，实施例3中的cleantak 7菌株因缺乏kdo都合成的关键基因而导致其生长受到严重的抑制，在对msba基因点突变后得到的cleantak 7m菌株生长状态有所改善。
[0133]
实施例6
[0134]
1、大肠杆菌cleantak系列工程菌株的lipid a的纯化
[0135]
将亲本tak菌株以及内毒素活性显著下降且生长特性良好的工程菌株cleantak 5α、cleantak 6α和cleantak 7m过夜活化培养，次日以1:100的比例转接至新鲜的200ml lb培养基中，37℃、180r/min培养至od
600
为0.8-0.9之间。4℃离心10分钟收集菌体，磷酸缓冲液洗涤一次，使用20ml的磷酸重悬细菌沉淀后加入氯仿甲醇，最后比例为氯仿/甲醇/水＝1:2:0.8(v/v)，形成bligh/dyer单相体系。细菌悬浮液室温摇晃1个小时，然后2500
×
g离心20分钟，去掉含有磷脂的上层，沉淀重悬于40ml的单相bligh/dyer，转移到50ml的离心管中，离心弃上清，沉淀空气干燥后重悬于25ml的50mm、ph 4.5的醋酸钠溶液中(震荡和超声波方式溶于溶液)，如果需要可使用醋酸将ph调整到4.5，然后沸水浴30分钟释放lipid a。震荡冷却后，将溶液转移到离心管，加入氯仿甲醇到体积比为氯仿/甲醇/水＝2:2:1.8，形成一个bligh/dyer mixture双相体系，充分剧烈震荡抽取lipid a，然后2500
×
g、20℃离心20分钟，形成两相，小心收取下相(氯仿有机相)到圆底烧瓶中，再向离心管中加入等量的氯仿到溶液中，再次形成双相，离心后小心吸取下相加入到相同的圆底烧瓶中，旋转蒸发去掉氯仿，样品溶于氯仿/甲醇＝2:1(v/v)中，转移到小离心管中再干燥，盖紧存于-80℃。
[0136]
2、clean tak系列工程菌株的lipid a的esi/ms分析
[0137]
所有样品的质谱检测在waters g2-xs qtof高分辨质谱仪上进行。纯化后的类脂a溶于氯仿：甲醇＝2:1(v/v)中。采用esi离子源，阳离子检测模式，检测范围小于m/z 2500，
氮气作为碰撞气体。最终所得结果如图4所示，结果说明将epta、kdsd等一系列基因敲除后能够成功的改造大肠杆菌tak菌株的类脂a结构，而类脂a结构的改变使得工程菌株的内毒素活性下降，与实施例4的检检测结果一致，为后续低内毒素活性工程菌株的应用打下理论基础。
[0138]
实施例7
[0139]
本实施例涉及cleantak系列工程菌株蛋白表达能力分析，具体如下：
[0140]
转化peingl表达质粒至大肠杆菌tak、cleantak 5α、cleantak 6α、cleantak 7m工程菌株中，活化转接至含乳糖的1/2tb培养基中诱导甘精胰岛素原蛋白表达。分别取适量菌液浓缩处理至od
600
读数为20，混匀；取各样品40μl并加入10μl buffer，混匀后沸水中煮5min；台式离心机12000rpm离心5min，配制14％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳观察，同时观察工程菌株在高密度发酵培养基中的生长情况。工程菌株蛋白表达及生长曲线见图5，含表达质粒的cleantak 5α、cleantak 6α工程菌株在高密度发酵培养基中可以正常生长，但其生长速率较tak野生菌株有所下降，而cleantak 7m工程菌株在高密度发酵培养基中无法正常生长。
[0141]
综上，根据sds-page电泳结果可知：与亲本株tak相比较，cleantak 5α工程菌株、cleantak 6α工程菌株、cleantak 7m工程菌株三株工程菌株的蛋白表达能力并无显著差异。
[0142]
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。
[0143]
[0144]
[0145]
[0146]
[0147]
[0148]
[0149]
[0150]
[0151]
[0152]

技术特征：
1.一种高密度发酵的低内毒素大肠杆菌，其特征在于，所述低内毒素大肠杆菌的分类命名为escherichia coli cleantak 5α，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 20221904，保藏时间为2022年12月09日。2.权利要求1所述的低内毒素大肠杆菌用于表达蛋白/多肽类物质中的应用。3.权利要求1所述的低内毒素大肠杆菌用于制备酶产品的应用。4.权利要求1所述的低内毒素大肠杆菌用于制备质粒中的应用。5.权利要求1所述的低内毒素大肠杆菌用于合成生物学的底盘，制备次生代谢产物的应用。6.一种高密度发酵的低内毒素大肠杆菌，其特征在于，所述低内毒素大肠杆菌的分类命名为escherichia coli cleantak 6α，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 20221905，保藏时间为2022年12月09日。7.权利要求6所述的低内毒素大肠杆菌用于表达蛋白/多肽类物质中的应用。8.权利要求6所述的低内毒素大肠杆菌用于制备酶产品的应用。9.权利要求6所述的低内毒素大肠杆菌用于制备质粒中的应用。10.权利要求6所述的低内毒素大肠杆菌用于合成生物学的底盘，制备次生代谢产物的应用。11.一种高密度发酵的低内毒素大肠杆菌，其特征在于，所述低内毒素大肠杆菌的分类命名为escherichia coli cleantak 7m，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 20221906，保藏时间为2022年12月09日。12.权利要求10所述的低内毒素大肠杆菌用于表达蛋白/多肽类物质中的应用。13.权利要求10所述的低内毒素大肠杆菌用于制备酶产品的应用。14.权利要求10所述的低内毒素大肠杆菌用于制备质粒中的应用。15.权利要求10所述的低内毒素大肠杆菌用于合成生物学的底盘，制备次生代谢产物的应用。

技术总结
本发明提供的一种高密度发酵的低内毒素大肠杆菌及其应用，通过敲除大肠杆菌TAK基因组上调控脂肪酸链合成的lpxP、lpxL、lpxM、pagP基因、参与Kdo分子的合成的gutQ基因以及参与磷酸基团修饰的eptA基因，从而使得细胞生成不含内毒素活性的Lipid IV


技术研发人员：杨萍 黄潇 温佳红 王询 刘高成 祁高富 范豪
受保护的技术使用者：恒敬合创生物医药（浙江）有限公司
技术研发日：2023.03.16
技术公布日：2023/7/7