一种适应泛癌种类器官高效扩增的组合式培养基及应用的制作方法

1.本发明涉及肿瘤类器官培养技术领域，特别涉及一种适应泛癌种类器官高效扩增的组合式培养基及应用。


背景技术：

2.类器官培养技术可以通过病人的肿瘤样本培养构建3d类器官模型，模拟原代肿瘤组织的细胞异质性，可应用于药物研发及精准医疗领域。目前肿瘤类器官培养基成分复杂，且不同肿瘤间差异巨大，难以灵活应对多种来源的肿瘤样本培养。
3.而现有的普适性培养基采用固定成分，针对性差，培养不同组织来源的肿瘤往往导致类器官扩增速度慢，甚至难以传代，同时会带来正常类器官比例过高的风险和成本增高的弊端。通过对肿瘤生长相关信号通路的刺激优化培养成分，针对生殖系统相关肿瘤，通过添加对应生理浓度的激素，同时开发通用且灵活搭配的类器官培养基组合成为解决该问题、降本增效的有效手段。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种适应泛癌种类器官高效扩增的组合式培养基及应用，以克服现有技术中的不足。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本技术公开了一种适应泛癌种类器官高效扩增的组合式培养基，所述组合式培养基由培养基a液、培养基b液、培养基c液、培养基d液、培养基e液或培养基f液中的一种或多种组合而成；
7.所述培养基a液包括以下组分：hepes培养液添加物、glutamax培养液添加物、b27培养液无血清添加物、insulin-transferrin-selenium-sodium pyruvate培养液添加物、n2培养液添加物、3-(6-甲基-2-吡啶基)-n-苯基-4-(4-喹啉基)-1h-吡唑-1-硫代甲酰胺、4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)咪唑、烟酰胺、pi3k-akt-mtor信号通路的激动剂sc79、促进肿瘤上皮间质转化及伤口愈合信号通路的配体角质细胞生长因子、wnt信号通路激动剂chir99021、凋亡信号通路抑制剂z-vad-fmk、抗氧化剂乙酰半胱氨酸、抑制正常类器官生长的mdm2抑制剂rebemadlin；溶剂为advanced dmem/f12培养液；
8.所述培养基b液包括以下组分：脊椎蛋白、头蛋白、表皮生长因子、胃泌素-1、前列腺素2、抗氧化剂乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液；
9.所述培养基c液包括以下组分：r脊椎蛋白、wnt3a、乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液；
10.所述培养基d液包括以下组分：r脊椎蛋白、头蛋白、成纤维细胞生长因子10、佛司可林、碱性成纤维细胞生长因子、乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液；
11.所述培养基e液包括以下组分：r脊椎蛋白、头蛋白、成纤维细胞生长因子10、表皮生长因子、神经调节素1、佛司可林、雌二醇、孕酮、乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/
f12培养液；
12.所述培养基f液包括以下组分：成纤维细胞生长因子10、碱性成纤维细胞生长因子、乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液。
13.作为优选，所述培养基a液中各组分浓度如下：5～15mm的hepes培养液添加物、1～10mm的glutamax培养液添加物、1x～5x的b27培养液无血清添加物、1x～5x的insulin-transferrin-selenium-sodium pyruvate培养液添加物、1x～5x的n2培养液添加物、500～1000nm的3-(6-甲基-2-吡啶基)-n-苯基-4-(4-喹啉基)-1h-吡唑-1-硫代甲酰胺、5～50μm的4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)咪唑、100-500ng/ml的烟酰胺、5～30nm的pi3k-akt-mtor信号通路的激动剂sc79、50～250ng/ml的促进肿瘤上皮间质转化及伤口愈合信号通路的配体角质细胞生长因子、1～3μm的wnt信号通路激动剂chir99021、0.5～5μm的凋亡信号通路抑制剂z-vad-fmk、1～50mm的抗氧化剂乙酰半胱氨酸、1～15μm的抑制正常类器官生长的mdm2抑制剂rebemadlin；溶剂为advanced dmem/f12培养液。
14.作为优选，所述培养基b液中各组分浓度如下：1～5μg/ml的脊椎蛋白、100～1000ng/ml的头蛋白、100～500ng/ml的表皮生长因子、10～100nm的胃泌素-1、10～100nm的前列腺素2、1～50mm的抗氧化剂乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液。
15.作为优选，所述培养基c液中各组分浓度如下：100～500μg/ml的r脊椎蛋白、10～50μg/ml的wnt3a、1～50mm的乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液。
16.作为优选，所述培养基d液中各组分浓度如下：1～5μg/ml的r脊椎蛋白、100～1000ng/ml的头蛋白、100～1000ng/ml的成纤维细胞生长因子10、10～100μm的佛司可林、10～100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、1～50mm的乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液。
17.作为优选，所述培养基e液中各组分浓度如下：1～5μg/ml的r脊椎蛋白、100～1000ng/ml的头蛋白、100～1000ng/ml的成纤维细胞生长因子10、10～50ng/ml的表皮生长因子、100～500ng/ml的神经调节素1、10～100μm的佛司可林、100～1000nm的雌二醇、100～500nm的孕酮以及1～50mm的乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液。
18.作为优选，所述培养基f液中各组分浓度如下：100～1000ng/ml的成纤维细胞生长因子10、10～100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、1～50mm的乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液。
19.本发明还公开了一种适应泛癌种类器官高效扩增的组合式培养基的应用，所述组合式培养基应用于肿瘤组织的培养扩增；所述肿瘤组织包括肺癌、膀胱癌、消化系统肿瘤、女性生殖系统肿瘤；所述组合式培养基针对不同的肿瘤组织，在培养基a液、培养基b液、培养基c液、培养基d液、培养基e液或培养基f液中选择其中一种或多种组合而成。
20.作为优选，所述消化系统肿瘤包括胃癌、结直肠癌；所述女性生殖系统肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌；针对胃癌的培养扩增，所述组合式培养基由培养基a液、培养基b液和培养基c液混合而成；针对结直肠癌的培养扩增，所述组合式培养基由培养基a液、培养基b液混合而成；针对肺癌的培养扩增，所述组合式培养基由培养基a液、培养基d液混合而成；针对乳腺癌的培养扩增，所述组合式培养基由培养基a液、培养基e液混合而成；针对膀胱癌的培养扩增，所述组合式培养基由培养基a液、培养基f液混合而成。
21.本发明的有益效果：
22.1、短时间内应对多癌种时更灵活、简便、高效。
23.2、适配高发病率癌种，匹配临床需求；可覆盖临床发病率较高，有临床个体化服务需求的肿瘤类型。
24.3、相较于传统肿瘤类器官培养基，该培养基能有效激活肿瘤细胞增殖相关通路，抑制凋亡通路，更适配肿瘤类器官的生长。
25.4、对于生殖系统肿瘤，通过添加生理浓度激素显著提高对应类器官扩增效率。
26.5、考虑培养基配制成分成本较高，且有效期较短，组合式的培养基可以避免培养基过期导致的浪费。
27.本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
附图说明
28.图1为根据实施例1不同培养条件对胃癌类器官生长影响的明场图；
29.图2为根据实施例1不同培养条件下胃癌肿瘤细胞数目统计图；
30.图3为根据实施例2胃癌类器官培养明场成像图；
31.图4为根据实施例3胃癌类器官培养明场成像图；
32.图5为根据实施例4结直肠癌类器官培养明场成像图；
33.图6为根据实施例5肺癌类器官培养明场成像图；
34.图7为根据实施例6肺癌类器官培养明场成像图；
35.图8为根据实施例7肺癌类器官培养明场成像图；
36.图9为根据实施例8乳腺癌类器官培养明场成像图；
37.图10为根据实施例9乳腺癌类器官培养明场成像图；
38.图11为根据实施例10乳腺癌类器官培养明场成像图；
39.图12为根据实施例11膀胱癌类器官培养明场成像图；
40.图13为根据实施例12膀胱癌类器官培养明场成像图；
41.图14为根据实施例13膀胱癌类器官培养明场成像图。
具体实施方式
42.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
43.实施例1
44.本方案中采用胃癌类器官样本，考察了添加物sc79、角质细胞生长因子、chir99021以及z-vad-fmk对类器官生长的影响。
45.具体方案如下：
46.预先准备培养基：a1液(区别于专利中的a液，无添加物sc79、角质细胞生长因子、chir99021以及z-vad-fmk)：包括40mladvanced dmem/f12、12.5mm hepes、2mm glutamax、1.25x的b27(without vitamin a)、1.25x的insulin-transferrin-selenium-sodium pyruvate、1.25x的n2、625nm 3-(6-甲基-2-吡啶基)-n-苯基-4-(4-喹啉基)-1h-吡唑-1-硫
代甲酰胺、12.5μm 4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)咪唑、125ng/ml烟酰胺、乙酰半胱氨酸1.25mm、10μm rebemadlin。b液(20mladvanced dmem/f12、2.5μg/ml r脊椎蛋白、500ng/ml头蛋白、250ng/ml表皮生长因子、50nm胃泌素-1、50nm前列腺素2以及1.25mm乙酰半胱氨酸)以及c液(500μladvanced dmem/f12、125μg/ml r脊椎蛋白、25μg/ml wnt3a以及1.25mm乙酰半胱氨酸)。
47.将配制好的a1液、b液、c液混合获得基本培养基；
48.取8ml基础培养基，在此基础上添加sc79至终浓度为10nm；
49.取8ml基础培养基，在此基础上添加角质细胞生长因子至终浓度为100ng/ml；
50.取8ml基础培养基，在此基础上添加chir99021至终浓度为1μm；取8ml基础培养基，在此基础上添加z-vad-fmk至终浓度为1μm；
51.取8ml基础培养基，在此基础上添加sc79至终浓度为10nm、角质细胞生长因子至终浓度为100ng/ml、chir99021至终浓度为1μm、z-vad-fmk至终浓度为1μm，得到a+b+c培养基。
52.类器官经tryple消化后计数，并按照100个肿瘤细胞/μl浓度用70％基质胶重悬，按5μl/滴体积种于96孔板，37℃固化后加入需对比培养基，明场成像记录5天后类器官生长情况，同时hoechst染色，对每孔肿瘤细胞数量进行定量统计，结果如图1、图2所示。结果发现，添加sc79、角质细胞生长因子、chir99021以及z-vad-fmk可以显著刺激肿瘤增殖及类器官生长。
53.其中advance dmem/f12为一种市售培养液的商品名，具体可在thermofisher gibco等地方购买获得，货号为12634028；hepes为一种市售培养液添加物，具体可在thermofisher gibco等地方购买获得，货号为15630106；glutamax为一种市售培养液添加物，具体可在thermofisher gibco等地方购买获得，货号为35050061；b27(without vitamina)为一种市售培养液无血清添加物，具体可在thermofisher gibco等地方购买获得，货号为12587-010；insulin-transferrin-selenium-sodium pyruvate为一种市售培养液添加物，具体可在thermofisher gibco等地方购买获得，货号为51300044；n2为一种市售培养液添加物，具体可在thermofisher gibco等地方购买获得，货号为17502048；chir99021为一种糖原合成酶激酶-3β(gsk-3β)和gsk-3α的有效选择性抑制剂，具体可在cell signaling technology等地方采购，货号为54290；z-vad-fmk为一种泛凋亡抑制剂，具体可在cell signaling technology等地方采购，货号为60332；tryple是一种消化酶，具体可在thermofisher gibco等地方购买获得，货号为12604013。
54.实施例2
55.本方案采用胃癌类器官样本，考察胃癌培养基对胃癌类器官生长的影响。
56.预先准备培养基：a液由400mladvanced dmem/f12配制而成，含有5mm hepes、1mm glutamax、1x的b27(without vitamin a)、1x的insulin-transferrin-selenium-sodium pyruvate、1x的n2、500nm 3-(6-甲基-2-吡啶基)-n-苯基-4-(4-喹啉基)-1h-吡唑-1-硫代甲酰胺、5μm 4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)咪唑、100ng/ml烟酰胺、sc795nm、角质细胞生长因子50ng/ml、chir990211μm、z-vad-fmk 0.5μm、乙酰半胱氨酸1mm、rebemadlin 1μm。培养基b液由10mladvanced dmem/f12配制而成，含有1μg/ml r脊椎蛋白、100ng/ml头蛋白、100ng/ml表皮生长因子、10nm胃泌素-1、10nm前列腺素2以及1mm浓度的抗氧化剂乙酰半胱氨酸。培养基c液由500μladvanced dmem/f12配制而成，含有100μg/ml r脊
椎蛋白、10μg/ml wnt3a以及1mm浓度的乙酰半胱氨酸。a液、b液、c液分别取50ml、10ml、0.5ml混合为胃癌完全培养基。
57.参照实施例1进行胃癌类器官消化种板，培养第5天明场成像结果如图3所示，该培养条件下胃癌类器官生长状况良好。
58.实施例3
59.本方案采用胃癌类器官样本，考察胃癌培养基对胃癌类器官生长的影响。
60.预先准备培养基：a液由400mladvanced dmem/f12配制而成，含有15mm hepes、10mm glutamax、5x的b27(without vitamin a)、5x的insulin-transferrin-selenium-sodium pyruvate、5x的n2、1000nm 3-(6-甲基-2-吡啶基)-n-苯基-4-(4-喹啉基)-1h-吡唑-1-硫代甲酰胺、50μm 4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)咪唑、500ng/ml烟酰胺、sc7930nm、角质细胞生长因子250ng/ml、chir990213μm、5μm、抗氧化剂乙酰半胱氨酸50mm、rebemadlin15μm。培养基b液由10mladvanced dmem/f12配制而成，含有5μg/ml r脊椎蛋白、1000ng/ml头蛋白、500ng/ml表皮生长因子、100nm胃泌素-1、100nm前列腺素2以及50mm浓度的抗氧化剂乙酰半胱氨酸。培养基c液由500μl advanced dmem/f12配制而成，含有500μg/ml r脊椎蛋白、50μg/ml wnt3a以及50mm浓度的乙酰半胱氨酸。a液、b液、c液分别取50ml、10ml、0.5ml混合为胃癌完全培养基。
61.参照实施例1进行胃癌类器官消化种板，培养第5天明场成像结果如图4所示，该培养条件下胃癌类器官生长状况良好。
62.实施例4
63.本方案中采用结直肠肿瘤组织样本，考察了实施例1优化培养基对结直肠类器官生长的影响。
64.预先准备培养基：a液由400ml advanced dmem/f12配制而成，含有12.5mm hepes、2mm glutamax、1.25倍浓度的b27(without vitamin a)、1.25倍浓度的insulin-transferrin-selenium-sodium pyruvate、1.25倍浓度的n2、625nm 3-(6-甲基-2-吡啶基)-n-苯基-4-(4-喹啉基)-1h-吡唑-1-硫代甲酰胺、12.5μm 4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)咪唑、125ng/ml烟酰胺、sc7912.5nm、角质细胞生长因子125ng/ml、chir99021 1.25μm、z-vad-fmk 1.25μm、乙酰半胱氨酸1.25mm以及10μm rebemadlin)；b液取自实施例1。a液、b液分别取40ml、10ml混合获得结直肠癌培养基。获得肿瘤手术样本后，在体视镜下用眼科镊和眼科剪剔除癌旁组织及坏死组织，然后将组织块剪成1mm3左右大小，加入含有1mg/ml的ⅰ型胶原蛋白酶及1mg/ml dna酶的advanced dmem/f12在37℃条件下80rpm震荡消化30min，期间每隔10分钟取出用1ml移液器反复吹打10次。
65.消化结束时加入胎牛血清至终浓度为2％以终止消化，用细胞计数仪计数，并用70％基质胶重悬至适当浓度，按50μl/滴种于24孔板中。
66.将24孔板倒置于37℃培养箱中凝固15分钟。
67.凝固结束后，加入对应培养基于37℃，5％co2环境下培养，每隔3-4天更换一次培养基。
68.培养第5天明场成像结果如图5所示，该培养条件下结直肠癌类器官生长状况良好。
69.实施例5
70.本方案采用肺癌肿瘤组织样本，考察实施例1优化培养基对肺癌类器官生长的影响。
71.预先准备培养基：a液取自实施例4配制好的a液，d液由10mladvanced dmem/f12配制而成，2.5μg/ml的r脊椎蛋白、500ng/ml的头蛋白、500ng/ml的成纤维细胞生长因子10、50μm的佛司可林、50ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、10mm的乙酰半胱氨酸。a液、d液分别取40ml、10ml混合获得肺癌培养基。
72.获得肿瘤手术样本后，按照实施例4方法进行处理及培养。培养第5天明场成像结果如图6所示，该培养条件下肺癌类器官生长状况良好。
73.实施例6
74.本方案采用肺癌类器官样本，考察肺癌培养基对肺癌类器官生长的影响。
75.预先准备培养基：a液取自实施例2配制好的a液，d液由10mladvanced dmem/f12配制而成，含有1μg/ml r脊椎蛋白、100ng/ml头蛋白、100ng/ml成纤维细胞生长因子10、10μm佛司可林、100ng/ml成纤维细胞生长因子10、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子以及1mm浓度的乙酰半胱氨酸。a液、d液分别取40ml、10ml混合获得肺癌培养基。
76.取肺癌类器官，按照实施例1方法进行处理及培养。培养第5天明场成像结果如图7所示，该培养条件下肺癌类器官生长状况良好。
77.实施例7
78.本方案采用肺癌类器官样本，考察肺癌培养基对肺癌类器官生长的影响。
79.预先准备培养基：a液取自实施例3配制好的a液，d液由10mladvanced dmem/f12配制而成，含有5μg/ml r脊椎蛋白、1000ng/ml头蛋白、1000ng/ml成纤维细胞生长因子10、100μm佛司可林、1000ng/ml成纤维细胞生长因子10、100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子以及50mm浓度的乙酰半胱氨酸。a液、d液分别取40ml、10ml混合获得肺癌培养基。
80.取肺癌类器官，按照实施例1方法进行处理及培养。培养第5天明场成像结果如图8所示,该培养条件下肺癌类器官生长状况良好。
81.实施例8
82.本方案中采用乳腺癌肿瘤组织样本，考察实施例1优化培养基对乳腺癌类器官生长的影响。
83.预先准备培养基：a液取自实施例4配制好的a液，e液由10mladvanced dmem/f12配制而成，含有2.5μg/ml r脊椎蛋白、500ng/ml头蛋白、50ng/ml成纤维细胞生长因子10、25ng/ml表皮生长因子、200ng/ml神经调节素1、50μm佛司可林、500nm雌二醇、250nm孕酮以及1.25mm乙酰半胱氨酸。a液、e液分别取40ml、10ml混合获得乳腺癌培养基。
84.获得肿瘤手术样本后，按照实施例4进行处理及培养。培养第5天明场成像结果如图9所示，该培养条件下乳腺癌类器官生长状况良好。
85.实施例9
86.本方案采用乳腺癌类器官样本，考察乳腺癌培养基对乳腺癌类器官生长的影响。
87.预先准备培养基：a液取自实施例2配制好的a液，e液由10mladvanced dmem/f12配制而成，含有1μg/ml r脊椎蛋白、100ng/ml头蛋白、10ng/ml成纤维细胞生长因子10、10ng/ml表皮生长因子、100ng/ml神经调节素1、10μm佛司可林、100nm雌二醇、100nm孕酮以及1mm浓度的乙酰半胱氨酸。a液、e液分别取40ml、10ml混合获得乳腺癌培养基。
88.取乳腺癌类器官，按照实施例1方法进行处理及培养。培养第5天明场成像结果如图10所示，该培养条件下乳腺癌类器官生长状况良好。
89.实施例10
90.本方案采用乳腺癌类器官样本，考察乳腺癌培养基对乳腺癌类器官生长的影响。
91.预先准备培养基：a液取自实施例3配制好的a液，e液由10mladvanced dmem/f12配制而成，含有5μg/ml r脊椎蛋白、1000ng/ml头蛋白、100ng/ml成纤维细胞生长因子10、50ng/ml表皮生长因子、500ng/ml神经调节素1、100μm佛司可林、1000nm雌二醇、500nm孕酮以及50mm浓度的乙酰半胱氨酸。a液、e液分别取40ml、10ml混合获得乳腺癌培养基。
92.取乳腺癌类器官，按照实施例1方法进行处理及培养。培养第5天明场成像结果如图11所示，该培养条件下乳腺癌类器官生长状况良好。
93.实施例11
94.本方案中采用膀胱癌肿瘤组织样本，考察实施例1优化培养基对膀胱癌类器官生长的影响。
95.预先准备培养基：a液取自实施例4配制好的a液配制、f液由10mladvanced dmem/f12配制而成、含有500ng/ml成纤维细胞生长因子10、62.5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子以及1.25mm乙酰半胱氨酸)。a液、f液分别取40ml、10ml混合获得膀胱癌培养基。
96.获得肿瘤手术样本后，按照实施例4进行处理及培养。培养第5天明场成像结果如图12所示，该培养条件下膀胱癌类器官生长状况良好。
97.实施例12
98.本方案采用膀胱癌类器官样本，考察膀胱癌培养基对膀胱癌类器官生长的影响。
99.预先准备培养基：a液取自实施例2配制好的a液，f液由10mladvanced dmem/f12配制而成，含有100ng/ml成纤维细胞生长因子10、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子以及1mm浓度的乙酰半胱氨酸。a液、f液分别取40ml、10ml混合获得膀胱癌培养基。
100.取膀胱癌类器官，按照实施例1方法进行处理及培养。培养第5天明场成像结果如图13所示，该培养条件下膀胱癌类器官生长状况良好。
101.实施例13
102.本方案采用膀胱癌类器官样本，考察膀胱癌培养基对膀胱癌类器官生长的影响。
103.预先准备培养基：a液取自实施例3配制好的a液，f液由10mladvanced dmem/f12配制而成，含有1000ng/ml成纤维细胞生长因子10、100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子以及50mm浓度的乙酰半胱氨酸。a液、f液分别取40ml、10ml混合获得膀胱癌培养基。
104.取膀胱癌类器官，按照实施例1方法进行处理及培养。培养第5天明场成像结果如图14所示，该培养条件下膀胱癌类器官生长状况良好。
105.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种适应泛癌种类器官高效扩增的组合式培养基，其特征在于：所述组合式培养基由培养基a液、培养基b液、培养基c液、培养基d液、培养基e液或培养基f液中的一种或多种组合而成；所述培养基a液包括以下组分：hepes培养液添加物、glutamax培养液添加物、b27培养液无血清添加物、insulin-transferrin-selenium-sodium pyruvate培养液添加物、n2培养液添加物、3-(6-甲基-2-吡啶基)-n-苯基-4-(4-喹啉基)-1h-吡唑-1-硫代甲酰胺、 4-（4-氟苯基）-2-（4-羟基苯基）-5-（4-吡啶基）咪唑、烟酰胺、pi3k-akt-mtor信号通路的激动剂sc79、促进肿瘤上皮间质转化及伤口愈合信号通路的配体角质细胞生长因子、wnt信号通路激动剂chir99021、凋亡信号通路抑制剂z-vad-fmk、抗氧化剂乙酰半胱氨酸、抑制正常类器官生长的mdm2抑制剂rebemadlin；溶剂为advanced dmem/f12培养液；所述培养基b液包括以下组分：脊椎蛋白、头蛋白、表皮生长因子、胃泌素-1、前列腺素2、抗氧化剂乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液；所述培养基c液包括以下组分：r脊椎蛋白、wnt3a、乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液；所述培养基d液包括以下组分：r脊椎蛋白、头蛋白、成纤维细胞生长因子10、佛司可林、碱性成纤维细胞生长因子、乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液；所述培养基e液包括以下组分：r脊椎蛋白、头蛋白、成纤维细胞生长因子10、表皮生长因子、神经调节素1、佛司可林、雌二醇、孕酮、乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液；所述培养基f液包括以下组分：成纤维细胞生长因子10、碱性成纤维细胞生长因子、乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液。2.如权利要求1所述的一种适应泛癌种类器官高效扩增的组合式培养基，其特征在于：所述培养基a液中各组分浓度如下：5~15mm的hepes培养液添加物、1~10mm的glutamax培养液添加物、1x~5x的b27培养液无血清添加物、1x~5x的insulin-transferrin-selenium-sodium pyruvate培养液添加物、1x~5x的n2培养液添加物、500~1000nm的3-(6-甲基-2-吡啶基)-n-苯基-4-(4-喹啉基)-1h-吡唑-1-硫代甲酰胺、5~50μm的 4-（4-氟苯基）-2-（4-羟基苯基）-5-（4-吡啶基）咪唑、100-500ng/ml的烟酰胺、5~30nm的pi3k-akt-mtor信号通路的激动剂sc79、50~250ng/ml的促进肿瘤上皮间质转化及伤口愈合信号通路的配体角质细胞生长因子、1~3μm的wnt信号通路激动剂chir99021、0.5~5μm的凋亡信号通路抑制剂z-vad-fmk、1~50mm的抗氧化剂乙酰半胱氨酸、1~15μm的抑制正常类器官生长的mdm2抑制剂rebemadlin；溶剂为advanced dmem/f12培养液。3.如权利要求1所述的一种适应泛癌种类器官高效扩增的组合式培养基，其特征在于：所述培养基b液中各组分浓度如下：1~5μg/ml的脊椎蛋白、100~1000ng/ml的头蛋白、100~500ng/ml的表皮生长因子、10~100nm的胃泌素-1、10~100nm的前列腺素2、1~50mm的抗氧化剂乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液。4.如权利要求1所述的一种适应泛癌种类器官高效扩增的组合式培养基，其特征在于：所述培养基c液中各组分浓度如下：100~500μg/ml的r脊椎蛋白、10~50μg/ml的wnt3a、1~50mm的乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液。5.如权利要求1所述的一种适应泛癌种类器官高效扩增的组合式培养基，其特征在于：
所述培养基d液中各组分浓度如下：1~5μg/ml的r脊椎蛋白、100~1000ng/ml的头蛋白、100~1000ng/ml的成纤维细胞生长因子10、10~100μm的佛司可林、10~100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、1~50mm的乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液。6.如权利要求1所述的一种适应泛癌种类器官高效扩增的组合式培养基，其特征在于：所述培养基e液中各组分浓度如下：1~5μg/ml的r脊椎蛋白、100~1000ng/ml的头蛋白、100~1000ng/ml的成纤维细胞生长因子10、10~50ng/ml的表皮生长因子、100~500ng/ml的神经调节素1、10~100μm的佛司可林、100~1000nm的雌二醇、100~500nm的孕酮以及1~50mm的乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液。7.如权利要求1所述的一种适应泛癌种类器官高效扩增的组合式培养基，其特征在于：所述培养基f液中各组分浓度如下：100~1000ng/ml的成纤维细胞生长因子10、10~100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、1~50mm的乙酰半胱氨酸；溶剂为advanced dmem/f12培养液。8.一种适应泛癌种类器官高效扩增的组合式培养基的应用，其特征在于：所述组合式培养基应用于肿瘤组织的培养扩增；所述肿瘤组织包括肺癌、膀胱癌、消化系统肿瘤、女性生殖系统肿瘤；所述组合式培养基针对不同的肿瘤组织，在培养基a液、培养基b液、培养基c液、培养基d液、培养基e液或培养基f液中选择其中一种或多种组合而成。9.如权利要求8所述一种适应泛癌种类器官高效扩增的组合式培养基的应用，其特征在于：所述消化系统肿瘤包括胃癌、结直肠癌；所述女性生殖系统肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌；针对胃癌的培养扩增，所述组合式培养基由培养基a液、培养基b液和培养基c液混合而成；针对结直肠癌的培养扩增；所述组合式培养基由培养基a液、培养基b液混合而成；针对肺癌的培养扩增；所述组合式培养基由培养基a液、培养基d液混合而成；针对乳腺癌的培养扩增；所述组合式培养基由培养基a液、培养基e液混合而成；针对膀胱癌的培养扩增；所述组合式培养基由培养基a液、培养基f液混合而成。

技术总结
本发明公开了一种适应泛癌种类器官高效扩增的组合式培养基及应用，针对肺癌、膀胱癌、消化系统肿瘤、女性生殖系统肿瘤及其它肿瘤可以迅速、灵活配置完成适应特定肿瘤扩增的培养基，提高检测实验室运作效率，同时在经典的类器官培养体系基础上激活肿瘤增殖相关信号通路；抑制肿瘤生长信号通路；针对生殖系统相关肿瘤，通过添加相应生理条件下浓度的激素；加入MDM2抑制剂抑制正常类器官生长，最终达到肿瘤类器官高效扩增的目的，缩短类器官扩增培养周期，降低类器官培养对肿瘤组织样本量的需求。求。求。


技术研发人员：肖红江 解翠薇 王丰 肖声平
受保护的技术使用者：杭州济扶科技有限公司
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/7/12