一种用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于纳米纤维双层膜的制备领域，涉及一种用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜及其制备方法和应用。


背景技术：

2.口腔种植是指利用生物材料制作人工牙根、牙冠等，以修复缺失的牙齿和周围组织，实现长期稳定、舒适的咀嚼功能和牙齿外形。然而，由于牙齿缺失后，牙槽骨常因失去功能性刺激等因素而逐渐萎缩，导致种植修复中常见的骨量不足问题，成为该领域面临的主要挑战之一。因此，在进行口腔种植手术前，需要对患者的骨质进行评估。对于患者牙槽骨骨量较少的情况，需要先进行植骨手术，利用骨粉、骨膜等科技再生材料代替人骨，这种技术被称为引导骨组织再生术(guided bone regeneration，gbr)。在整个种植修复流程中，部分患者需要进行骨增量手术，而其中一部分需要用到骨粉和口腔修复膜。采用口腔修复膜材料在牙种植中可以促进骨再生，提高植体稳定性，同时保证骨和植骨发育良好，具有良好的治疗效果，对于改善患者口腔健康、提升生活质量具有重要价值。
3.通过应用口腔修复膜对骨缺损部位进行覆盖，可以形成一层机械屏障，从而达到封闭效果。这种覆盖可以缓解覆盖组织的压力，同时对血凝块进行保护，形成良好的成骨空间。该屏障可以阻挡影响骨形成的纤维细胞和结缔组织等，使具有成长潜力的前体成骨细胞进入到骨缺损区，从而诱导骨缺损区的骨修复再生，增加口腔种植修复的成功率。
4.口腔修复膜种类繁多，传统的合金材料和高分子材料来源的口腔修复膜因其生物相容性差和不可降解等缺陷而逐渐被淘汰。胶原类口腔修复膜目前占据主要市场，但市场上已有的同类型产品或多或少存在一些缺陷：
5.(1)胶原降解速度快，在修复后期无法维持空间结构；
6.(2)致密面不能阻止软组织侵入骨缺损区，达不到屏障膜的预期效果；
7.(3)疏松面吸渗性不佳，不能有效锁住渗血，诱导骨再生效果不佳；
8.(4)口腔修复膜手感僵硬，贴附效果不佳，会影响手术操作的便利性。
9.相比之下，丝素蛋白(silk fibroin，sf)作为天然高分子材料，具有良好的生物降解性、机械强度和生物相容性，在骨、软骨、肝脏和皮肤的组织工程中得到广泛应用。然而，丝素蛋白的黏附性和亲水性较差，限制了其在医用材料方面的应用。经过交联改性后，丝素蛋白可以诱导形成β-折叠结构，从而提高材料的细胞粘附力和弹性模量。采用静电纺丝技术可以制备出纳米级的丝素蛋白纤维网，其力学强度较高，更接近于天然骨膜的物理结构。电纺单层膜存在厚度薄、强度差、易遇水溶胀等缺点。
10.因此，在本领域中，期望开发一种能够具有理想的组织贴合性、力学性能和降解周期的材料。


技术实现要素：

11.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜及其制备方法和应用。
12.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
13.一方面，本发明提供一种用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜，其包括内层的多孔疏松层和外层的致密层，所述多孔疏松层是丝素蛋白和纳米羟基磷灰石组成的纳米纤维膜，所述致密层是丝素蛋白与生物可降解材料组成的纳米纤维膜，所述多孔疏松层和致密层之间形成交联结构。
14.在本发明中，将丝素蛋白与纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite，nha)复合，增加表面粗糙度并大幅提高机械强度。此外，添加高分子生物可降解材料可以进一步增加纳米纤维膜的稳定性和力学强度。多孔疏松层和外层的致密层形成交联结构，能够诱导丝素蛋白形成β-折叠结构，使得本发明的牙周再生的丝素基双层膜具有三维结构，相较于胶原膜具有更为理想的组织贴合性、力学性能、降解周期，在临床应用上具有较大的前景。
15.优选地，所述多孔疏松层中纳米羟基磷灰石的质量占比为10％～30％，例如10％、13％、15％、18％、20％、23％、25％、28％或30％。
16.优选地，所述纳米羟基磷灰石的粒径为20～40nm，例如20nm、23nm、25nm、28nm、30nm、35nm、38nm或40nm。由于本发明所述用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜是通过静电纺丝制备得到的，因此，纳米羟基磷灰石的粒径通过研磨、过筛维持在20～40nm，使其更好的分散在静电纺丝溶液中，避免沉降；同时在静电纺丝过程中不易堵针头，使纺丝过程更加顺畅。
17.优选地，所述致密层中丝素蛋白的重量百分比为50％～100％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
18.优选地，所述生物可降解材料选自聚乳酸、聚己内酯或聚羟基丁酸戊酸共聚酯中的任意一种或至少两种的组合。
19.优选地，所述交联使用的交联剂为碳化二亚胺盐(edc)和羟基丁二酰亚胺(nhs)。
20.优选地，所述碳化二亚胺盐和羟基丁二酰亚胺的质量比为20％～30％，例如20％、23％、25％、28％或30％。
21.在本发明中，在多孔疏松层和致密层进行交联的过程中，能够诱导丝素蛋白形成β-折叠结构，形成的丝素基超薄双层膜与牙周组织有更好的贴合性，相比而言，市售双层胶原膜手感僵硬、贴附效果不佳。
22.另一方面，本发明提供了如上所述的用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
23.(1)以含有丝素蛋白与纳米羟基磷灰石的溶液为静电纺丝液，通过静电纺丝得到多孔疏松层；
24.(2)以含有丝素蛋白与生物可降解材料的溶液为静电纺丝液，通过静电纺丝，在得到的多孔疏松层上接收并得到致密层；
25.(3)使用交联剂使得多孔疏松层和致密层发生交联，得到所述用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜。
26.在本发明中，通过静电纺丝在多孔疏松层上形成丝素蛋白与生物可降解材料的致
密层，而后通过发生交联，能够诱导丝素蛋白形成β-折叠结构，形成的丝素基超薄双层膜与牙周组织有更好的贴合性，相比而言，市售双层胶原膜手感僵硬、贴附效果不佳。
27.本发明将天然高分子材料丝素蛋白(sf)、生物可降解材料与无机成分纳米羟基磷灰石(nha)复合在一起形成复合材料，优势互补，构建丝素基三维结构双层膜。丝素蛋白膜作为主体材料，具有良好的生物降解性和生物相容性；生物可降解材料，具有良好的生物相容性和良好的生物降解性，可与纳米羟基磷灰石共同作为辅助材料，改善丝素蛋白纳米纤维的力学性能不足的缺点，同时提高表面粗糙度和骨诱导性能。
28.本发明依据材料优化设计和仿生骨膜结构的研究思路进行生物材料的合成设计，将天然材料丝素蛋白和纳米羟基磷灰石复合后纺丝制备得到多孔疏松膜，再在其上纺丝素蛋白/聚l-丙交酯-己内酯致密膜，而后交联，构建了仿生骨膜结构的丝素基三维结构双层膜。该再生膜外层致密，阻挡成纤维细胞长入；内层疏松，有利于成骨细胞粘附和增殖。
29.优选地，步骤(1)所述含有丝素蛋白与纳米羟基磷灰石的溶液中丝素蛋白与纳米羟基磷灰石的总质量百分比为15％～25％，例如15％、18％、20％、22％、24％或25％。
30.优选地，步骤(1)所述含有丝素蛋白与纳米羟基磷灰石的溶液的溶剂为六氟异丙醇(hfip)。
31.优选地，步骤(1)所述含有丝素蛋白与纳米羟基磷灰石的溶液的配制过程为：将冷冻干燥后的丝素蛋白与纳米羟基磷灰石颗粒加入至六氟异丙醇中，得到混合溶液，将混合溶液利用超声波震荡处理，而后搅拌，得到所述含有丝素蛋白与纳米羟基磷灰石的溶液。
32.优选地，所述超声波震荡处理时的超声功率为19-23khz，例如19khz、20khz、21khz、22khz或23khz，处理时间为10-40min，例如10min、15min、20min、25min、30min、35min或40min。
33.在本发明中，如上所述搅拌可以为磁力搅拌，所述搅拌的时间为3-48小时。
34.优选地，步骤(1)所述静电纺丝时电压设定为10～20kv(例如10kv、13kv、15kv、18kv或20kv)，进样速率设定为0.8～1.5ml/h(例如0.8ml/h、1.0ml/h、1.2ml/h或1.5ml/h)，利用滚筒接收纤维，滚筒转速为800～3000r/min(例如800r/min、1000r/min、1300r/min、1500r/min、2000r/min、2500r/min或3000r/min)，接收距离为10～15cm(例如10cm、11cm、12cm、13cm、14cm或15cm)。
35.在本发明中，步骤(1)所述静电纺丝液分批次转移到10ml的医用注射器中，给注射器连接上型号为20g的针头，随后将注射器置入静电纺丝装置的推进泵中。
36.优选地，步骤(1)所述静电纺丝在室温下进行，空气湿度为15-20％，例如15％、17％、18％、19％或20％。
37.优选地，步骤(2)含有丝素蛋白与生物可降解材料的溶液中丝素蛋白与生物可降解材料的质量百分比为10％～20％，例如10％、13％、15％、18％或20％。
38.优选地，步骤(2)含有丝素蛋白与生物可降解材料的溶液的溶剂为六氟异丙醇(hfip)、三氟乙酸(tfa)、乙酸(hac)或四氢呋喃(thf)中的至少一种。
39.优选地，步骤(2)所述含有丝素蛋白与生物可降解材料的溶液的配制过程为：将丝素蛋白与生物可降解材料加入至六氟异丙醇中得到混合溶液，搅拌，得到所述含有丝素蛋白与生物可降解材料的溶液。
40.在本发明中，如上所述搅拌可以为磁力搅拌，所述搅拌的时间为3-24小时。优选
地，步骤(2)所述静电纺丝时电压设定为10～20kv(例如10kv、13kv、15kv、18kv或20kv)，进样速率设定为0.8～1.5ml/h(例如0.8ml/h、1.0ml/h、1.2ml/h或1.5ml/h)，利用滚筒接收纤维，滚筒转速为800～3000r/min(例如800r/min、1000r/min、1300r/min、1500r/min、2000r/min、2500r/min或3000r/min)，接收距离为10～15cm(例如10cm、11cm、12cm、13cm、14cm或15cm)。
41.在本发明中，步骤(2)所述静电纺丝液分批次转移到10ml的医用注射器中，给注射器连接上型号为20g的针头，随后将注射器置入静电纺丝装置的推进泵中。
42.优选地，步骤(2)所述静电纺丝在室温下进行，空气湿度为15-20％，例如15％、17％、18％、19％或20％。
43.优选地，步骤(3)所述交联剂为碳化二亚胺盐(edc)和羟基丁二酰亚胺(nhs)。
44.优选地，所述碳化二亚胺盐和羟基丁二酰亚胺的质量比为20％～30％，例如20％、23％、25％、28％或30％。
45.优选地，步骤(3)所述交联在室温下进行，所述交联的时间为1-6小时，例如1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。
46.优选地，步骤(3)所述交联在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为无水乙醇。
47.优选地，步骤(3)在交联前，将步骤(2)得到的双层膜进行干燥，除去膜上残留的有机溶剂。
48.在步骤(3)交联后，用去离子水将残留交联剂冲洗干净后置于冷冻干燥机中干燥。
49.另一方面，本发明提供了如上所述用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜在口腔种植材料制备中的应用。
50.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
51.在本发明中，将丝素蛋白与纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite，nha)复合，增加表面粗糙度并大幅提高机械强度。此外，添加高分子生物可降解材料可以进一步增加纳米纤维膜的稳定性和力学强度。多孔疏松层和外层的致密层形成交联结构，能够诱导丝素蛋白形成β-折叠结构，使得本发明的牙周再生的丝素基双层膜具有三维结构，作为口腔修复膜，其致密层具有良好的机械屏障作用，疏松层起到诱导骨组织再生作用，实现双层结构的同时仍具有“超薄”的物理特性，膜结构更为柔软与牙周组织更好贴合，在临床手术过程中操作更为便利，实现超薄结构的同时仍具有较好的力学性能和降解性能。并且本发明的制备方法操作简单，实验制备条件温和的优点，适于大规模批量生产，具有较好的应用前景。
附图说明
52.图1为实施例3制备得到的丝素基三维结构双层膜的结构示意图和扫描电镜图，其中(a)丝素基三维结构双层膜的结构示意图，其包括一层疏松面(其中小球代表纳米羟基磷灰石)和一层致密面，(b)内层nha@sf纳米纤维膜的扫描电镜图，标尺为10μm，(c)外层5sf/5p纳米纤维膜的扫描电镜图，标尺为10μm，(d)nha@sf-5sf/5p双层纳米纤维膜横切面的扫描电镜图，标尺为10μm；
53.图2为实施例3制备得到的膜的红外图谱，(a)多孔疏松膜nha@sf的红外图谱，(b)致密膜5sf/5p的红外图谱；
54.图3为实施例3制备得到的膜的x射线衍射图谱；
55.图4为实施例3制备得到的膜的接触角测试结果；
56.图5为实施例1-3制备得到的丝素基三维结构双层膜的力学性能测试结果图，(a)应力-应变曲线，(b)断裂强度测试结果图，(c)断裂伸长率测试结果图，(d)杨氏模量测试结果图；
57.图6为实施例3、实施例4、实施例5制备得到的内层纳米纤维膜的扫描电镜图，其中(a)为实施例3制备得到的内层纳米纤维膜的扫描电镜图，标尺为10μm，(b)为实施例4制备得到的内层纳米纤维膜的扫描电镜图，标尺为10μm，(c)为实施例5制备得到的内层纳米纤维膜的扫描电镜图，标尺为10μm；
58.图7为实施例2和对比例1制备得到的膜的体外降解曲线；
59.图8为实施例2和对比例2制备得到的膜的扫描电镜图；
60.图9为实施例1和对比例3制备得到的膜的表面拍摄图。
具体实施方式
61.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
62.在本发明的实施例中使用的丝素蛋白的制备方法为：将40g天然家蚕丝放入2l浓度为0.05％的碳酸钠溶液中煮沸处理30min，重复三次，用去离子水充分洗涤干净后烘干得到家蚕丝素纤维。然后将丝素纤维以1:10的浴比溶解在9.3mol/l的溴化锂(libr)溶液中，于60℃中搅拌1h得到丝素蛋白混合溶液。待混合溶液冷却后，将混合溶液装入透析袋(截留分子量8-12kd)，用去离子水透析5天，每12h换一次水，透析完后过滤得到丝素蛋白溶液。将丝素蛋白溶液置于-80℃冰箱，随后冷冻干燥获得丝素蛋白。
63.实施例1
64.本实施例提供一种丝素基三维结构双层膜及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
65.(1)多孔疏松膜的制备方法为：将冷冻干燥后的丝素蛋白与纳米羟基磷灰石颗粒以质量比5:1溶解在10ml六氟异丙醇(hfip)中，配置成质量体积比为15％的混合溶液，超声波震荡处理30min使其分散，在室温条件下用磁力搅拌器搅拌24小时后得到乳白色的sf/nha静电纺丝液。将sf/nha静电纺丝液分批次转移到10ml的医用注射器中，给注射器连接上型号为20g的针头，随后将注射器置入推进泵中，连接上高压发生器，电压设定为15kv，推进泵速率设定为1.0ml/h，并在推进泵下方放置静电纺滚筒接收纤维，转速为1000r/min，接收距离固定为12cm。整个过程都在室温条件下进行，空气湿度为15-20％，制备的单层膜命名为nha@sf。
66.(2)致密膜的制备方法为：取丝素蛋白溶解于六氟异丙醇中，配置成质量体积比为15％的混合溶液。在室温条件下用磁力搅拌器搅拌12小时后得到澄清透明的sf静电纺丝液。将sf静电纺丝液转移到10ml的医用注射器中，给注射器连接上型号为20g的针头，随后将注射器置入推进泵中，连接上高压发生器，电压设定为15kv，推进泵速率设定为1.2ml/h，并在推进泵下方放置静电纺滚筒接收纤维，转速为1000r/min，接收距离固定为15cm。整个过程都在室温条件下进行，空气湿度为15-20％。该步骤制备的单层膜命名为10sf。
67.(3)基于丝素蛋白的纳米纤维双层膜的制备方法为：在sf/nha层形成的多孔疏松膜基础上再纺sf/plcl层致密膜，形成丝素基三维结构双层膜。制备的双层膜命名为nha@sf-10sf。纺丝完毕后将电纺膜放置于真空干燥箱48小时除去膜上残留的有机溶剂，随后于edc-nhs交联剂溶液(edc：nhs质量比为2:1溶于无水乙醇中，edc-nhs与无水乙醇的质量体积比为3:10)中交联4h，用去离子水将残留交联剂冲洗干净后置于冷冻干燥机中，最终干燥的丝素基三维结构双层膜。
68.实施例2
69.本实施例提供一种丝素基三维结构双层膜及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
70.(1)多孔疏松膜的制备方法为：将冷冻干燥后的丝素蛋白与纳米羟基磷灰石颗粒以质量比5:1溶解在10ml六氟异丙醇(hfip)中，配置成质量体积比为15％的混合溶液。超声波震荡处理30min使其分散，在室温条件下用磁力搅拌器搅拌24小时后得到乳白色的sf/nha静电纺丝液。将sf/nha静电纺丝液分批次转移到10ml的医用注射器中，给注射器连接上型号为20g的针头，随后将注射器置入推进泵中，连接上高压发生器，电压设定为15kv，推进泵速率设定为1.0ml/h，并在推进泵下方放置静电纺滚筒接收纤维，转速为1000r/min，接收距离固定为12cm。整个过程都在室温条件下进行，空气湿度为15-20％，制备的单层膜命名为nha@sf。
71.(2)致密膜的制备方法为：分别取丝素蛋白和聚l-丙交酯-己内酯以质量比分别为8:2比例溶解六氟异丙醇中，配置成质量体积比为15％的混合溶液。在室温条件下用磁力搅拌器搅拌12小时后得到澄清透明的sf/plcl静电纺丝液。将sf/plcl静电纺丝液转移到10ml的医用注射器中，给注射器连接上型号20g的针头，随后将注射器置入推进泵中，连接上高压发生器，电压设定为15kv，推进泵速率设定为1.2ml/h，并在推进泵下方放置静电纺滚筒接收纤维，转速为1000r/min，接收距离固定为15cm。整个过程都在室温条件下进行，空气湿度为15～20％。该步骤制备的单层膜命名为8sf/2p。
72.(3)基于丝素蛋白的纳米纤维双层膜的制备方法为：在sf/nha层形成的多孔疏松膜基础上再纺sf/plcl层致密膜，形成丝素基三维结构双层膜。制备的双层膜分别命名为nha@sf-8sf/2p。纺丝完毕后将电纺膜放置于真空干燥箱48小时除去膜上残留的有机溶剂，随后于edc-nhs交联剂溶液(edc：nhs质量比为2:1溶于无水乙醇中，edc-nhs与无水乙醇的质量体积比为3:10)中交联4h，溶剂为无水乙醇，用去离子水将残留交联剂冲洗干净后置于冷冻干燥机中，最终干燥的丝素基三维结构双层膜。
73.实施例3
74.本实施例提供一种丝素基三维结构双层膜及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
75.(1)多孔疏松膜的制备方法为：将冷冻干燥后的丝素蛋白与纳米羟基磷灰石颗粒以质量比5:1溶解在10ml六氟异丙醇(hfip)中，配置成质量体积比为15％的混合溶液。超声波震荡处理30min使其分散，在室温条件下用磁力搅拌器搅拌24小时后得到乳白色的sf/nha静电纺丝液。将sf/nha静电纺丝液分批次转移到10ml的医用注射器中，给注射器连接上型号维20g的针头，随后将注射器置入推进泵中，连接上高压发生器，电压设定为15kv，推进泵速率设定为1.0ml/h，并在推进泵下方放置静电纺滚筒接收纤维，转速为3000r/min，接收
距离固定为12cm。整个过程都在室温条件下进行，空气湿度为15-20％，制备的单层膜命名为nha@sf。
76.(2)致密膜的制备方法为：分别取丝素蛋白和聚l-丙交酯-己内酯以质量比分别为5:5比例溶解六氟异丙醇中，配置成质量体积比为15％的混合溶液。在室温条件下用磁力搅拌器搅拌12小时后得到澄清透明的sf/plcl静电纺丝液。将sf/plcl静电纺丝液转移到10ml的医用注射器中，给注射器连接上型号维20g的针头，随后将注射器置入推进泵中，连接上高压发生器，电压设定为15kv，推进泵速率设定为1.2ml/h，并在推进泵下方放置静电纺滚筒接收纤维，转速为3000r/min，接收距离固定为15cm。整个过程都在室温条件下进行，空气湿度为15～20％。该步骤制备的单层膜命名为5sf/5p。
77.(3)基于丝素蛋白的纳米纤维双层膜的制备方法为：在sf/nha层形成的多孔疏松膜基础上再纺sf/plcl层致密膜，形成丝素基三维结构双层膜。制备的双层膜分别命名为nha@sf-5sf/5p。纺丝完毕后将电纺膜放置于真空干燥箱48小时除去膜上残留的有机溶剂，随后于edc-nhs交联剂溶液(edc：nhs质量比为2:1溶于无水乙醇中，edc-nhs与无水乙醇的质量体积比为3:10)中交联4h，溶剂为无水乙醇，用去离子水将残留交联剂冲洗干净后置于冷冻干燥机中，最终干燥的丝素基三维结构双层膜。
78.本发明制备得到的丝素基三维结构双层膜的结构示意图如图1中a所示，本实施例制备得到的外层5sf/5p纳米纤维膜的扫描电镜(hitachi，tm-1000)图如图1中b所示，内层nha@sf纳米纤维膜的扫描电镜图如图1中c所示，丝素基三维结构双层膜的扫描电镜图如图1中d所示，由图可以看出，在nha@sf纳米纤维膜表面含有羟基磷灰石的纤维上观察到了突起的鼓包或者结节，而掺杂了羟基磷灰石的纳米纤维膜的孔隙率高于未掺杂的纳米纤维膜。侧切图结果表明nha@sf较为疏松，而5sf/5p较为致密，且两层之间结合紧密度较高。
79.测量纳米纤维膜的厚度取平均，所得数据如下表1所示。在实现双层结构的同时仍具有较小的厚度，预计在临床使用过程中能够较好的贴合牙周组织。
80.表1
81.实施例10.1093mm实施例20.0982mm实施例30.9734mm
82.利用红外(thermo fisher，nicoletin 10)对制备得到的膜进行了表征，图2为纳米纤维膜的红外图谱，其中(a)内层nha@sf纳米纤维膜，(b)外层5sf/5p纳米纤维膜；由图可以看出，根据吸收峰的位置和强度，可以验证丝素基纳米纤维双层膜的化学组成。具体而言，所有含有丝素(sf)的纳米纤维膜在1623cm-1
、1518cm-1
和1233cm-1
处表现出明显的吸收峰，分别对应sf中的silk-i和silk-ii(n-h)和silk-iii(c-n)。在负载了纳米羟基磷灰石(nha)之后，nha/sf和plcl/sf/nha复合膜在1045cm-1
处出现吸收峰，表明膜中存在p-o键，而在601cm-1
处出现的吸收峰则源于nha中的o-p-o磷酸基团，这些结果证实了nha成功地加载到sf/plcl/nha复合膜中。此外，在1752cm-1
处观察到了强吸收峰，对应了聚乳酸(pla)酯羰基的典型不对称拉伸。位于2995cm-1
和2945cm-1
的吸收峰则分别属于pla的不对称和对称的c-h拉伸震动。1454cm-1
和1382cm-1
的吸收峰属于pla对称和不对称弯曲的c-h变形。1181cm-1
、1130cm-1
和1085cm-1
处的峰值则是因为pla的c-o拉伸。综上所述，通过ftir图谱分析可以得出结论：制备的丝素基纳米纤维双层膜具有组成物质基本的特征基团，且成功地负载了
nha。
83.利用x射线衍射(rigaku，d/max-2550pc)对制备得到的膜进行了表征，结果如图3所示，由图可以看出，纯plcl材料的xrd图谱中出现了两个主要特征衍射峰，分别位于2θ＝16.7
°
和19.0
°
处，这表明plcl中存在典型的半晶体结构。这是由于plcl所用溶剂为hfip，hfip对于plcl是一种良性溶剂。在稀溶液中，plcl分子链可以完全被hfip分子所包围，分子链彼此无关，高分子在溶液中以孤立线团形式存在，减少了聚合物之间的接触，分子链完全伸展，避免了互相缠结，这些伸展聚合物链趋向有序排列。而掺杂了sf和nha的纤维膜没有出现尖峰，说明这些复合材料没有明显的晶体结构。plcl和sf大部分都以无定型结构存在于纤维膜中，只有少部分有序结构以宽峰的形式展现出来。在plcl和sf复合之后，部分聚合物链的有序结构被打乱。
84.利用接触角测量仪(kruss，dsa-30)对制备得到的膜进行了接触角测试，结果如图4所示，可以看出，10sf、8sf/2p、5sf/5p和nha@sf的接触角分别为74.76
°±
3.22
°
、98.76
°±
1.72
°
、108.69
°±
2.49
°
、67.72
°±
2.29
°
。通过实验结果可以得出，随着sf含量占比的减少，丝素基纳米纤维双层膜的疏水性增加。因为sf中的羟基可以与水分子形成氢键，使得膜表面具有较为显著的亲水性。同时，nha@sf由于nha加入使得表面粗糙程度大，且在用静电纺制备nha@sf时参数设置上使得该层膜本身就有较大的孔隙率，故最为亲水。薄膜材料具有不同粗糙度和表面积，产生的表面张力将不同，这对接触角有影响。通常当接触角小于90
°
时，粗糙面的较大作用面积和表面张力更大，更容易润湿。实验结果显示，10sf、nha@sf接触角小于90
°
，8sf/2p、5sf/5p接触角也接近90
°
，因此该实验制备的双层膜内外两层都具有较好的亲水性，对于细胞在膜表面的粘附、生长和繁殖具有一定程度的帮助。
85.对实施例1-3得到的丝素基三维结构双层膜利用电脑式拉压力试验机(上海恒驭，hy-940fs)进行了力学性能的测试，如图5所示。其中(a)应力-应变曲线，(b)断裂强度，(c)断裂伸长率，(d)杨氏模量；适量plcl的加入能显著增强纤维膜的断裂韧性。不含plcl的nha@sf-10sf组最大拉伸强度值为2.576mpa，而sf与plcl比例为5:5的nha@sf-5sf/5p为最大拉伸强度为1.455mpa，plcl一定程度上削弱了拉伸强度。通过本实验结果可以得出，适量添加plcl可以提高丝素纳米纤维复合膜的力学性能，而过多的plcl添加则会对其力学性能造成一定的负面影响。因此，对于丝素纳米纤维复合膜的制备，需要在保证力学性能的同时，适当控制plcl的加入量。
86.实施例4
87.本实施例提供一种丝素基三维结构双层膜及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
88.(1)多孔疏松膜的制备方法为：将冷冻干燥后的丝素蛋白与纳米羟基磷灰石颗粒以质量比4:1溶解在10ml六氟异丙醇(hfip)中，配置成质量体积比为15％的混合溶液。超声波震荡处理30min使其分散，在室温条件下用磁力搅拌器搅拌24小时后得到乳白色的sf/nha静电纺丝液。将sf/nha静电纺丝液分批次转移到10ml的医用注射器中，给注射器连接上型号为20g的针头，随后将注射器置入推进泵中，连接上高压发生器，电压设定为15kv，推进泵速率设定为1.0ml/h，并在推进泵下方放置静电纺滚筒接收纤维，转速为1000r/min，接收距离固定为12cm。整个过程都在室温条件下进行，空气湿度为15-20％，制备的单层膜命名为nha@sf。
89.(2)致密膜的制备方法为：分别取丝素蛋白和聚l-丙交酯-己内酯以质量比分别为8:2比例溶解六氟异丙醇中，配置成质量体积比为15％的混合溶液。在室温条件下用磁力搅拌器搅拌12小时后得到澄清透明的sf/plcl静电纺丝液。将sf/plcl静电纺丝液转移到10ml的医用注射器中，给注射器连接上型号20g的针头，随后将注射器置入推进泵中，连接上高压发生器，电压设定为15kv，推进泵速率设定为1.2ml/h，并在推进泵下方放置静电纺滚筒接收纤维，转速为1000r/min，接收距离固定为15cm。整个过程都在室温条件下进行，空气湿度为15～20％。该步骤制备的单层膜命名为8sf/2p。
90.(3)基于丝素蛋白的纳米纤维双层膜的制备方法为：在sf/nha层形成的多孔疏松膜基础上再纺sf/plcl层致密膜，形成丝素基三维结构双层膜。制备的双层膜分别命名为nha@sf-8sf/2p。纺丝完毕后将电纺膜放置于真空干燥箱48小时除去膜上残留的有机溶剂，随后于edc-nhs体系中交联4h，溶剂为无水乙醇，用去离子水将残留交联剂冲洗干净后置于冷冻干燥机中，最终干燥的丝素基三维结构双层膜。
91.实施例5
92.本实施例提供一种丝素基三维结构双层膜及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
93.(1)多孔疏松膜的制备方法为：将冷冻干燥后的丝素蛋白与纳米羟基磷灰石颗粒以质量比20:3溶解在10ml六氟异丙醇(hfip)中，配置成质量体积比为15％的混合溶液。超声波震荡处理30min使其分散，在室温条件下用磁力搅拌器搅拌24小时后得到乳白色的sf/nha静电纺丝液。将sf/nha静电纺丝液分批次转移到10ml的医用注射器中，给注射器连接上型号为20g的针头，随后将注射器置入推进泵中，连接上高压发生器，电压设定为15kv，推进泵速率设定为1.0ml/h，并在推进泵下方放置静电纺滚筒接收纤维，转速为1000r/min，接收距离固定为12cm。整个过程都在室温条件下进行，空气湿度为15-20％，制备的单层膜命名为nha@sf。
94.(2)致密膜的制备方法为：分别取丝素蛋白和聚l-丙交酯-己内酯以质量比分别为8:2比例溶解六氟异丙醇中，配置成质量体积比为15％的混合溶液。在室温条件下用磁力搅拌器搅拌12小时后得到澄清透明的sf/plcl静电纺丝液。将sf/plcl静电纺丝液转移到10ml的医用注射器中，给注射器连接上型号20g的针头，随后将注射器置入推进泵中，连接上高压发生器，电压设定为15kv，推进泵速率设定为1.2ml/h，并在推进泵下方放置静电纺滚筒接收纤维，转速为1000r/min，接收距离固定为15cm。整个过程都在室温条件下进行，空气湿度为15～20％。该步骤制备的单层膜命名为8sf/2p。
95.(3)基于丝素蛋白的纳米纤维双层膜的制备方法为：在sf/nha层形成的多孔疏松膜基础上再纺sf/plcl层致密膜，形成丝素基三维结构双层膜。制备的双层膜分别命名为nha@sf-8sf/2p。纺丝完毕后将电纺膜放置于真空干燥箱48小时除去膜上残留的有机溶剂，随后于edc-nhs体系中交联4h，溶剂为无水乙醇，用去离子水将残留交联剂冲洗干净后置于冷冻干燥机中，最终干燥的丝素基三维结构双层膜。
96.实施例3、实施例4、实施例5制备得到的内层纳米纤维膜的扫描电镜(hitachi，tm-1000)图分别如图6中a、b、c所示，均观察到了纤维间掺杂了nha，实施例4中nha含量最多，但纤维相较于实施例3较细，推测是nha含量过多堵塞静电纺丝针头，使得纤维直径偏小；而实施例5相较于实施例3，nha含量过低，使得nha在纤维中分布不均。综上，实施例3中sf与nha
的比例最为合适。
97.对比例1
98.与实施例1不同之处仅在于，所述制备方法中不包括步骤(3)，即不发生交联。
99.对比例2
100.与实施例1不同之处仅在于将步骤(1)和步骤(2)中使用的溶剂六氟异丙醇替换为三氟乙酸。
101.对比例3
102.与实施例1不同之处仅在于将步骤(3)中交联剂edc-nhs体系替换为单宁酸。
103.对实施例2和对比例1得到的膜进行体外降解测试，测试方法为采用人工唾液(ph＝6.8)模拟丝素基纳米纤维双层膜的降解过程。将交联的nha@sf-8sf/2p和未交联的nha@sf-8sf/2p样品裁剪成2.5cm
×
2.5cm大小，并在烘干称重后记录其质量为w0。随后，将样品转移至5ml的人工唾液中，放置在37℃摇床上。在3、7、14、21、28和49d时，取出样品后，使用去离子水对其进行几遍重洗并将其冻干，此时质量记为w。通过公式计算样品的剩余质量百分比(remaining mass)：remaining mass(％)＝(w/w0)
×
100％。
104.测试结果如图7所示。可以看出，交联后的nha@sf-8sf/2p双层膜整体呈现出较为平稳的降解曲线，经过7周的降解，双层膜质量下降仍保持在75％以上。而未交联的nha@sf-8sf/2p双层膜在第一周基本完全降解。说明交联剂的使用对材料的降解性能具有较大的作用。
105.对实施例2和对比例2得到的膜进行sem观察，测试方法为：将静电纺溶剂为六氟异丙醇的8sf/2p与溶剂为三氟乙酸的8sf/2p样品切割成1.0cm
×
1.0cm大小的正方形。随后选择合适的扫描电镜样品台，用导电胶将切割好的样品固定在样品台上，在一定真空度下以直流4ma的状态对样品喷金60秒，从而使样品表面具有导电性。最后放置入扫描电镜下进行拍摄。
106.测试结果如图8所示，(a)溶剂为六氟异丙醇，(b)溶剂为三氟乙酸，可以看出，当静电纺丝溶剂为六氟异丙醇时能够形成较为连续，且粗细、大小一致的纤维结构，当静电纺丝溶剂为三氟乙酸时不能形成完整的纤维结构，且有液滴滴落。
107.对实施例1和对比例3得到的膜进行观测。
108.测试结果如图9所示，(a)交联剂为单宁酸，(b)交联剂为edc-nhs，可以看出，交联剂为单宁酸的膜在动干后表面较为粗糙，且在接触后易发生破碎；交联剂为edc-nhs表面较为光滑，且多次折叠弯曲而不易破碎。
109.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一种用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜，其特征在于，其包括内层的多孔疏松层和外层的致密层，所述多孔疏松层是丝素蛋白和纳米羟基磷灰石组成的纳米纤维膜，所述致密层是丝素蛋白与生物可降解材料组成的纳米纤维膜，所述多孔疏松层和致密层之间形成交联结构。2.根据权利要求1所述的用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜，其特征在于，所述多孔疏松层中纳米羟基磷灰石的质量比为10％～30％；优选地，所述纳米羟基磷灰石的粒径为20～40nm。3.根据权利要求1或2所述的用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜，其特征在于，所述致密层中丝素蛋白的重量百分比为50％～100％；优选地，所述生物可降解材料选自聚乳酸、聚己内酯或聚羟基丁酸戊酸共聚酯中的任意一种或至少两种的组合。4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜，其特征在于，所述交联使用的交联剂为碳化二亚胺盐和羟基丁二酰亚胺；优选地，所述碳化二亚胺盐和羟基丁二酰亚胺的质量比为20％～30％。5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)以含有丝素蛋白与纳米羟基磷灰石的溶液为静电纺丝液，通过静电纺丝得到多孔疏松层；(2)以含有丝素蛋白与生物可降解材料的溶液为静电纺丝液，通过静电纺丝，在得到的多孔疏松层上接收并得到致密层；(3)使用交联剂使得多孔疏松层和致密层发生交联，得到所述用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述含有丝素蛋白与纳米羟基磷灰石的溶液中丝素蛋白与纳米羟基磷灰石的总质量百分比为15％～25％；优选地，步骤(1)所述含有丝素蛋白与纳米羟基磷灰石的溶液的溶剂为六氟异丙醇；优选地，步骤(1)所述含有丝素蛋白与纳米羟基磷灰石的溶液的配制过程为：将冷冻干燥后的丝素蛋白与纳米羟基磷灰石颗粒加入至六氟异丙醇中，得到混合溶液，将混合溶液利用超声波震荡处理，而后搅拌，得到所述含有丝素蛋白与纳米羟基磷灰石的溶液；优选地，所述超声波震荡处理时的超声频率为19-23khz，处理时间为10-40min；优选地，所述搅拌的时间为3-48小时；优选地，步骤(1)所述静电纺丝时电压设定为10～20kv，进样速率设定为0.8～1.5ml/h，利用滚筒接收纤维，滚筒转速为800～3000r/min，接收距离为10～15cm；步骤(1)所述静电纺丝在室温下进行，空气湿度为15-20％。7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)含有丝素蛋白与生物可降解材料的溶液中丝素蛋白与生物可降解材料的质量百分比为10％～20％；优选地，步骤(2)含有丝素蛋白与生物可降解材料的溶液的溶剂为六氟异丙醇、三氟乙酸、乙酸或四氢呋喃中的至少一种；优选地，步骤(2)所述含有丝素蛋白与生物可降解材料的溶液的配制过程为：将丝素蛋白与生物可降解材料加入至六氟异丙醇中得到混合溶液，搅拌，得到所述含有丝素蛋白与
生物可降解材料的溶液；优选地，所述搅拌的时间为3-24小时；优选地，步骤(2)所述静电纺丝时电压设定为10～20kv，进样速率设定为0.8～1.5ml/h，利用滚筒接收纤维，滚筒转速为800～3000r/min，接收距离为10～15cm；优选地，步骤(2)所述静电纺丝在室温下进行，空气湿度为15-20％。8.根据权利要求5-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述交联剂为碳化二亚胺盐和羟基丁二酰亚胺；优选地，所述碳化二亚胺盐和羟基丁二酰亚胺的质量比为20％～30％。9.根据权利要求5-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述交联在室温下进行，所述交联的时间为1-6小时；优选地，步骤(3)所述交联在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为无水乙醇；优选地，步骤(3)在交联前，将步骤(2)得到的双层膜进行干燥，除去膜上残留的有机溶剂。10.根据权利要求1-4中任一项所述的用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜在口腔种植材料制备中的应用。

技术总结
本发明提供一种用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜及其制备方法和应用，所述用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜包括内层的多孔疏松层和外层的致密层，所述多孔疏松层是丝素蛋白和纳米羟基磷灰石组成的纳米纤维膜，所述致密层是丝素蛋白与生物可降解材料组成的纳米纤维膜，所述多孔疏松层和致密层之间形成交联结构。本发明的丝素基三维结构双层膜具有三维结构，具有良好的机械屏障作用，可以诱导骨组织再生作用，膜结构柔软，与牙周组织贴合良好，具有较好的力学性能和降解性能，制备方法操作简单，实验制备条件温和的优点，适于大规模批量生产。规模批量生产。规模批量生产。


技术研发人员：王驰巍 仇可新
受保护的技术使用者：上海栎元医疗科技有限公司
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/7/12