间充质干细胞无血清培养基及其应用的制作方法

1.本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种包含植物蛋白水解物的间充质干细胞无血清培养基，及其制备方法和应用。


背景技术：

2.间充质干细胞（mesenchymal stem cells，mscs），又称多潜能基质细胞，是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，包括骨髓、脐带、脂肪、粘膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、羊膜、胎盘等。在适宜条件下可分化为脂肪、骨、软骨等多种组织细胞。研究发现间充质干细胞具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，受到人们广泛的关注。由于从脐带组织中分离提取间充质干细胞不会造成任何损伤，且脐带中的间充质干细胞数量多、质量高，细胞纯净，已成为目前最具有临床应用价值和保存价值的干细胞。
3.目前干细胞培养主要以传统二维培养为主，相当于仅在一个平面上支持干细胞生长，增殖效率和空间利用率都很低，无法满足临床干细胞日益增长的大剂量应用的需求。与二维平面细胞培养技术相比，三维培养将三维结构的基质与细胞在体外进行共培养，形成立体细胞聚集体，使细胞在体外进行立体式生长、分化和迁移，更真实地模拟机体内生存环境，更有利于细胞的增殖、存活以及本身特性的保持。细胞在不同的培养状态下营养需求存在差异，因此，适用于三维培养技术需要有适合的三维培养基以达到最优的大规模生产工艺。
4.间充质干细胞体外培养所使用的培养基大都需要补充血清，这就使得在细胞培养过程中存在污染外源病毒和致病因子的风险。而且，由于血清中未知成分较多，不同批次血清间的生物活性因子不一致，导致产品和实验结果的重现性差，残留的血清也易引起接种者对血清的过敏反应，无法应用于临床研究。因此，为了克服血清带来的种种弊端，在细胞培养过程中寻找血清替代物或采用无血清培养基，是非常必要的。植物蛋白水解物是将大豆、小麦、大米等植物原料，在酸或酶制剂的催化作用下，水解得到的氨基酸及氨基酸多肽的中间混合胶体，再经加工处理后得到的产物。如大豆蛋白水解物作为血清替代物，含有丰富的二肽与多肽，相对于游离氨基酸，蛋白水解物更有利于mscs增殖和状态维持。而且，大豆蛋白水解物富含有包含多肽的稳定型谷氨酸盐，被认为是细胞培养中重要的核酸原料，同时也是极好的能量来源。但是，植物蛋白水解物在mscs培养方面的应用尚无报道，因此本发明拟寻找一种基于植物蛋白水解物、效果显著、安全性高、适合于二维与三维培养的无血清培养基。


技术实现要素：

本发明的目的是提供新型的间充质干细胞无血清培养基，该培养基无血清和无动物源成分，可显著提高间充质干细胞在二维培养或三维培养中的活率及增殖能力，从而解决了现有技术中已有的间充质干细胞无血清培养基在用于三维大规模培养时效果不佳的
技术难题。
5.在一方面，本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基，其包括以下组分且含量如下所示：以及任选的一种或多种选自以下组的细胞培养用组分：谷氨酰胺、生长因子、激素、结合蛋白、谷胱甘肽、氢化可的松，和其他添加因子。
6.在一些实施方案中，所述基础培养基选自由α-mem培养基、d/f12培养基和dmem培养基组成的组，优选为所述基础培养基是α-mem培养基。
7.在一些实施方案中，所述血小板裂解物的含量为1-5% (v/v)，优选为2% (v/v)。
8.在一些实施方案中，所述植物蛋白水解物的含量为5-10g/l，优选为5g/l。
9.在一些实施方案中，所述谷氨酰胺是l-谷氨酰胺，其含量为2-4mm，优选为4mm。
10.在一些实施方案中，所述谷胱甘肽是还原型谷胱甘肽，其含量为80-120μg/l，优选为100μg/l。
11.在一些实施方案中，氢化可的松的含量为0.5-1.5mg/l，优选为1.0mg/l。
12.在一些实施方案中，所述生长因子包括选自以下组的一种或多种：表皮生长因子 (egf)、碱性成纤维细胞生长因子 (bfgf)、转化生长因子-β (tgf-β)，和血小板衍生生长因子-bb (pdgf-bb)；表皮生长因子 (egf) 的含量为5-20ng/ml，优选为20ng/ml；碱性成纤维细胞生长因子 (bfgf) 的含量为5-20ng/ml，优选为20ng/ml；转化生长因子-β (tgf-β) 的含量为5-15ng/ml，优选为10ng/ml：以及血小板衍生生长因子-bb (pdgf-bb) 的含量为5-15ng/ml，优选为10ng/ml。
13.在一些实施方案中，所述激素包括选自以下组的一种或多种：胰岛素例如重组人胰岛素，和黄体酮；重组人胰岛素的含量为5-15mg/l，优选为10mg/l；黄体酮的含量为15-25ng/ml，优选为20ng/l。
14.在一些实施方案中，所述结合蛋白包括转铁蛋白，例如重组人转铁蛋白，其含量为15-25mg/l，优选为20mg/l。
15.在一些实施方案中，所述其他添加因子包括选自以下组的一种或多种：维生素例如维生素c、葡萄糖和盐例如丙酮酸钠和亚硒酸钠；维生素c的含量为15-25mg/l，优选为20mg/l；葡萄糖的含量为20-30mm，优选为25mm；丙酮酸钠的含量为1-2mm，优选为1mm；亚硒酸钠的含量为25-35 mg/l，优选为30 mg/l。
16.在一些实施方案中，本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基，其包括以下组分且含量如下所示：
在优选实施方案中，本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基，其包括以下组分且含量如下所示：在另一方面，本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括：将各组分按比例加入到基础培养基中。
17.在一些替代性的实施方案中，本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括：
1) 将除了基础培养基外的其他组分按比例混合，制得营养添加组剂；和2) 将步骤1) 制得的营养添加组剂加入到基础培养基组剂中。
18.再一方面，本发明提供了一种间充质干细胞的培养方法。
19.二维培养方法包括以下步骤，1) 将包含细胞的细胞悬液与间充质干细胞完全培养基混合均匀；2) 收集细胞，用间充质干细胞完全培养基重悬细胞；3) 将细胞接种到细胞培养容器中，加入间充质干细胞完全培养基，置于培养箱中培养；和4) 收获细胞。
20.所述间充质干细胞完全培养基是本发明的间充质干细胞无血清培养基，其组成如以上所述。
21.三维培养方法包括以下步骤，1) 准备微载体：将微载体置于培养容器中，加入间充质干细胞完全培养基，使微载体均匀分散；2) 细胞接种及培养：将细胞悬液加入培养容器中，置于培养箱中培养；和3) 收获细胞。
22.所述间充质干细胞完全培养基是本发明的间充质干细胞无血清培养基，其组成如以上所述。
23.再一方面，本发明提供了间充质干细胞无血清培养基在培养间充质干细胞中的用途。在一些实施方案中，所述培养是二维培养。在一些实施方案中，所述培养是三维培养。
24.本发明的有益效果为：1. 本发明的培养基中不包含来源于血清的组分，避免了血清带来的污染外源病毒和致病因子的风险、产品和实验结果的重现性差、易引起过敏反应等弊端；2. 本发明的培养基在添加血小板裂解物的基础上加入植物蛋白水解物，有效降低了血小板裂解物的使用量，并显著提高了间充质干细胞三维培养的效果；3. 在适用于间充质干细胞二维培养的同时，本发明的培养基还特别地适用于间充质干细胞的三维培养，实现了间充质干细胞的大规模高质量扩增，且具有安全性高的优点。
附图说明
25.图1显示了实施例3中p0细胞形态图。
26.图2显示了实施例4中细胞形态图（p8）。
27.图3显示了实施例4中细胞连续培养活率大小。
28.图4显示了实施例4中细胞连续培养增殖倍数。
29.图5显示了实施例4中细胞连续培养的细胞直径大小。
30.图6显示了实施例6第4日时细胞染色结果（p6）。
31.图7显示了实施例6第4日时细胞连续培养活率大小。
32.图8显示了实施例6第4日时细胞连续培养增殖倍数。
33.图9显示了实施例6第4日时细胞连续培养细胞直径大小。
具体实施方式
34.除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义。
35.在本文中使用时，术语“包括”旨在指定所阐述的特征、整数、组件或步骤的存在，但它们不排除一个或更多个其他特征、整数、组件、步骤或其组的存在或添加。
36.间充质干细胞无血清培养基一方面，本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基，其可用于间充质干细胞的二维培养和三维培养。
37.在本文中使用时，术语“干细胞”是指一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，干细胞可以分化成多种功能细胞。术语“间充质干细胞”是指干细胞家族中的一项重要成员，其来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，最初在骨髓中发现，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点。间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、骨骼间充质干细胞、肌肉间充质干细胞、肺间充质干细胞、肝间充质干细胞、胰腺间充质干细胞、羊水间充质干细胞、脐带间充质干细胞等。术语“脐带间充质干细胞”是指来源于脐带的间充质干细胞。术语“脂肪间充质干细胞”是指来源于脂肪的间充质干细胞。
38.在本文中使用时，术语“无血清培养基”是指未补充有血清蛋白如胎牛血清的细胞培养基。无血清培养基是本领域公知的。
39.本发明的间充质干细胞无血清培养基包括基础培养基，约90-99% (v/v)；植物蛋白水解物，1-10 g/l；以及一种或多种选自以下组的细胞培养用组分：谷氨酰胺、生长因子、激素、结合蛋白、谷胱甘肽、氢化可的松，和其他添加因子。
40.在本文中使用时，术语“基础培养基”是指将细胞加入其中开始培养的起始培养基。基础培养基是包含滋养生长的细胞的营养素的溶液。通常，基础培养基提供细胞对于最小限度的生长和/或存活所需要的必需和非必需的氨基酸、维生素、能量来源、脂质和痕量元素。在一些实施方案中，基础培养基是商业上可以获得的培养基或本领域已知能够维持哺乳动物细胞的生长或增殖的培养基。基础培养基的非限定性实例包括但不限于dmem、f12、mem、α-mem、megm、rpmi-1640及其组合。在一些实施方案中，所述基础培养基包括d/f12 (例如1:1混合比例)、α-mem+dmem (例如1:1混合比例)和α-mem。在优选实施方案中，所述基础培养基是α-mem。在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基中，以体积比计，基础培养基占约90-99% (v/v)，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基中，以体积比计，基础培养基占约90-97% (v/v)，例如约92-97% (v/v)、约93-96% (v/v)、约94-95% (v/v)、约95% (v/v)等。
41.在本文中使用时，术语“血小板裂解物”是指可从血小板获得的制品。血小板可从供体，优选人供体获得，可从多个采集单位的全血分离并汇集，或通过血小板单采采集：从供体获取血液，并使血液通过去除血小板的装置。在分离后，血小板典型地例如通过一个或多个冷冻/解冻循环进行裂解。本发明中使用的血小板裂解物可以是能商业购买获得的市售血小板裂解物产品，例如elitecell biomedical corp购买获得的血小板裂解物产品elitegro-adv。在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基中，以体积比计，
血小板裂解物占约1-10% (v/v)，例如1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基中，以体积比计，血小板裂解物占约1-10% (v/v)，例如约1-5% (v/v)、约1-4% (v/v)、约1-3% (v/v)、约1-2% (v/v) 等。在优选实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基中，以间充质干细胞无血清培养基总体积为基准计算体积比计，血小板裂解物占约2% (v/v)。
42.在本文中使用时，术语“植物蛋白水解物”具有在本领域中公认的含义，并且通常是指植物原料，在酸或酶制剂的催化作用下，水解得到的氨基酸及氨基酸多肽的中间混合胶体，再经加工处理后得到的产物。在某些实施方式中，所述植物蛋白水解物是豆类例如大豆、豌豆、鹰嘴豆，或小麦、大米等谷物，或棉等的水解产物。在本发明的间充质干细胞无血清培养基中使用的水解物是能商业购买获得的市售植物蛋白水解物产品，例如可由sigma公司提供的植物蛋白水解物产品 (货号：51841)。在一些实施方案中，在本发明的间充质干细胞无血清培养基中，植物蛋白水解物的含量为约1-10g/l，例如约1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、8g/l、10g/l，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中，植物蛋白水解物的含量为约5-10g/l，例如约5-9g/l、约5-8g/l、约5-7g/l、约5-6g/l、约5g/l等。
43.在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基包括结合蛋白，例如转铁蛋白。大多数哺乳动物细胞上存在特定的转铁蛋白受体，受体与转铁蛋白与铁离子的复合物结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源，此外转铁蛋白还具有生长因子的性质并能与其他微量元素如钒等结合。不同细胞对转铁蛋白的需要量也不同。能添加到本发明的间充质干细胞无血清培养基的转铁蛋白可以是重组人转铁蛋白，例如能商业购买获得的市售重组人转铁蛋白产品，例如可由武汉禾元生物科技股份有限公司提供的重组人转铁蛋白产品 (货号：hyc044m01)。在一些实施方案中，在本发明的间充质干细胞无血清培养基中，重组人转铁蛋白的含量为约15-25mg/l，例如约15mg/l、16mg/l、17mg/l、18mg/l、19mg/l、20mg/l、21mg/l、22mg/l、23mg/l、24mg/l、25mg/l，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中，重组人转铁蛋白的含量为约20mg/l。
44.在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基包括激素，如胰岛素、生长激素、胰高糖素、黄体酮等。几乎所有的细胞系都需要胰岛素，它是一种多肽，能与细胞上的胰岛素受体结合形成复合物，促进rna、蛋白质和脂肪酸的合成，一致细胞凋亡，是重要的细胞存活因子。能添加到本发明的间充质干细胞无血清培养基的胰岛素可以是重组人胰岛素，例如能商业购买获得的市售重组人胰岛素产品，例如可由武汉禾元生物科技股份有限公司提供的重组人胰岛素产品 (货号：s454rv)。在一些实施方案中，在本发明的间充质干细胞无血清培养基中，重组人胰岛素的含量为约5-15mg/l，例如约5mg/l、6mg/l、7mg/l、8mg/l、9mg/l、10mg/l、11mg/l、12mg/l、13mg/l、14mg/l、15mg/l，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中，重组人胰岛素的含量为约10mg/l。黄体酮又称孕酮、黄体激素，是卵巢分泌的具有生物活性的主要孕激素。在一些实施方案中，在本发明的间充质干细胞无血清培养基中，黄体酮的含量为约15-25ng/ml，例如约15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、21ng/ml、22ng/ml、23ng/ml、24ng/ml、25ng/ml，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中，黄体酮的含量为约20 ng/ml。
45.在细胞培养时，绝大部分细胞对谷氨酰胺有较高的要求，因为谷氨酰胺是作为能
源及碳源物质同时被细胞利用，是是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。细胞所能利用的谷氨酰胺是l型同分异构体，d型谷氨酰胺不能被利用。在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基中，l-谷氨酰胺的含量为约2-4mm，例如2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基中，l-谷氨酰胺的含量为约4mm。
46.本发明的间充质干细胞无血清培养基还可以包括生长因子。生长因子是维持细胞体外培养生存、增殖和分化所必需的补充因子。生长因子是有效的促有丝分裂原，能缩短细胞群体倍增时间。按化学性质可分为多肽类生长因子和甾类生长因子。能加入到本发明的间充质干细胞无血清培养基的生长因子包括但不限于多肽类生长因子和甾类生长因子，例如天然生长因子或者通过基因重组手段获得相应的重组生长因子。在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基包括选自由表皮生长因子 (egf)；成纤维细胞生长因子 (fgf)，例如碱性成纤维细胞生长因子 (bfgf)；转化生长因子 (tgf)，例如转化生长因子-β (tgf-β)；血小板衍生生长因子-bb (pdgf-bb) 和神经生长因子 (ngf) 等组成的组一种或多种生长因子。在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基包括表皮生长因子 (egf)、碱性成纤维细胞生长因子 (bfgf)、转化生长因子-β (tgf-β)，和血小板衍生生长因子-bb (pdgf-bb)。在一些实施方案中，在本发明的间充质干细胞无血清培养基中，egf的含量为约5-20ng/ml，例如约5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基中，egf的含量为约20ng/ml。在一些实施方案中，在本发明的间充质干细胞无血清培养基中，bfgf的含量为约5-20ng/ml，例如约5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基中，bfgf的含量为约20ng/ml。在一些实施方案中，在本发明的间充质干细胞无血清培养基中，tgf-β的含量为约5-15ng/ml，例如约5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基中，tgf-β的含量为约10ng/ml。在一些实施方案中，在本发明的间充质干细胞无血清培养基中，pdgf-bb的含量为约5-15ng/ml，例如约5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基中，pdgf-bb的含量为约10ng/ml。
47.本发明的间充质干细胞无血清培养基还可以包括谷胱甘肽，例如还原型谷胱甘肽。还原型谷胱甘肽能参与体内氧化还原过程。在谷胱甘肽转移酶的作用下，还原型谷胱甘肽能和过氧化物及自由基相结合，以对抗氧化剂对巯基的破坏，保护细胞膜中含巯基的蛋白质和含巯基的酶不被破坏，亦对抗自由基对重要脏器的损害。谷胱甘肽参与体内三羧酸循环及糖代谢，使人体获得高能量。它能激活和保护各种酶，如体内的胆碱酯酶等巯基酶，使机体免受碘乙酸、芥子气、自由基、重金属、环氧化物等有害物质的毒害，从而促进糖类、脂肪及蛋白质代谢，也能影响细胞的代谢过程。在一些实施方案中，在本发明的间充质干细
胞无血清培养基中，还原型谷胱甘肽的含量为约80-120μg/l，例如约80μg/l、85μg/l、90μg/l、95μg/l、100μg/l、105μg/l、110μg/l、115μg/l、120μg/l，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基中，还原型谷胱甘肽的含量为约100μg/l。
48.在本文中使用时，术语“氢化可的松”也被称为可的松，是指具有糖皮质激素作用的肾上腺皮质激素剂。在间充质干细胞培养中，氢化可的松是一种常用的添加剂，可以影响细胞的信号传递途径，从而影响细胞的功能。还可以抑制细胞的免疫反应和炎症反应，从而减少细胞在培养中受到的应激，提高干细胞的存活率和生长速度。在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基中，氢化可的松的含量为约0.5-1.5mg/l，例如约0.5mg/l、0.6mg/l、0.7mg/l、0.8mg/l、0.9mg/l、1.0mg/l、1.1mg/l、1.2mg/l、1.3mg/l、1.4mg/l、1.5mg/l，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基中，氢化可的松的含量为约1.0mg/l。
49.在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基还包括其他添加因子，例如维生素、葡萄糖和盐包括无机盐和有机盐等。
50.维生素是维持细胞生长的一类生物活性物质，对细胞代谢有重大作用。它们在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，没有维生素，酶便没有活性，代谢活动将无法进行。能添加到本发明的间充质干细胞无血清培养基的维生素可以是维生素c，例如能商业购买获得的市售维生素c产品，维生素c具有抗氧化作用。在一些实施方案中，在本发明的间充质干细胞无血清培养基中，维生素c的含量为约15-25mg/l，例如约15mg/l、16mg/l、17mg/l、18mg/l、19mg/l、20mg/l、21mg/l、22mg/l、23mg/l、24mg/l、25mg/l，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中，维生素c的含量为约20mg/l。
51.葡萄糖为间充质干细胞在培养基中生长提供能量来源。在一些实施方案中，在本发明的间充质干细胞无血清培养基中，葡萄糖的含量为约20-30mm，例如约20mm、21mm、22mm、23mm、24mm、25mm、26mm、27mm、28mm、29mm、30mm，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中，葡萄糖的含量为约25mm。
52.盐例如无机盐或有机盐能够维持培养基渗透压平衡，参与细胞的代谢活动。主要有na
+
、k
+
、ca
2+
、mg
2+
等。na
+
是细胞外液中最主要的阳离子，对维持渗透压的恒定有决定性的作用。k
+
主要分布在细胞内液，细胞内k
+
对于激活某些酶是必需的，并在调节细胞内环境的酸碱平衡上也有极重要意义。ca
2+
在细胞外液中的作用是将组织内部细胞之间相互粘着，在细胞内参与许多重要的细胞生理活动，如传导、参与肌肉细胞收缩等。mg
2+
是构成细胞间质的重要成分，对于细胞间相互稳定结合有很重要的意义。磷的化合物对细胞物质代谢和生理功能调控有重要作用。
53.在一些实施方案中，在本发明的间充质干细胞无血清培养基中包含丙酮酸钠。在一些实施方案中，在本发明的间充质干细胞无血清培养基中，丙酮酸钠的含量为约1-2mm，例如约1mm、2mm，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中，丙酮酸钠的含量为约1mm。
54.在一些实施方案中，在本发明的间充质干细胞无血清培养基中包含亚硒酸钠。在一些实施方案中，在本发明的间充质干细胞无血清培养基中，亚硒酸钠的含量为约25-35 mg/l，例如约25mg/ml、26mg/ml、27mg/ml、28mg/ml、29mg/ml、30mg/ml、31mg/ml、32mg/ml、
33mg/ml、34mg/ml、35mg/ml，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中，亚硒酸钠的含量为约30mg/ml。
55.在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基还任选地包括余量的水。本领域技术人员应当理解的是，在无血清培养基的配制过程中，由于液体之间的混合互溶以及固体组分在液体组分中的溶解等因素，使得配制后得到的体积可能小于各组分体积之和，在这样的情况下，可以通过补充余量的水来得到具有预期总体积的间充质干细胞无血清培养基。
56.本领域技术人员应当理解的是，本发明的间充质干细胞无血清培养基中所包含的组分可以是能商业购买获得的市售产品。
57.在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基包括以下组分且含量如下所示：在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基包括以下组分且含量如下所示：
在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基是双组剂配方。该双组剂在储存时分开各自保存，在使用前再混合均匀，即配即用。在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基是双组剂配方，其中第一组剂是基础培养基组剂，包括基础培养基；第二组剂是营养添加组剂，包括除基础培养基以外的其他组分。各组剂中组分含量如本文中所限定。
58.在一些实施方案中，该双组剂在储存时分开各自保存，其中基础培养基组剂在2-8℃的温度条件下保存，营养添加组剂在-18至-22℃，例如-20℃的温度条件下保存。
59.间充质干细胞无血清培养基的制备另一方面，本发明提供了间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：将各组分按比例加入到基础培养基中。
60.在一些替代性的实施方案中，本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括：1) 将除了基础培养基外的其他组分按比例混合，制得营养添加组剂；和2) 将步骤1) 制得的营养添加组剂加入到基础培养基组剂中。
61.在一些实施方案中，在添加前，可以将组分溶解于水或有机溶剂中，有机溶剂例如dmso。在一些实施方案中，在添加前，用细胞培养用水溶解egf、bfgf、tgf-β、pdgf-bb、葡萄糖等。在一些实施方案中，在添加前，用dmso溶解氢化可的松。
62.在一些实施方案中，上述方法的各个步骤中，在组分添加过程中任选地进行搅拌或本领域中熟知的手段来促使各组分混合均匀。
63.在一些实施方案中，上述方法的各个步骤中，在组分混合后任选地可以使用本领域中已知的过滤方法进行过滤，例如使用滤膜进行过滤。在一些实施方案中，使用孔径不大于0.22μm的滤膜进行过滤。在一些实施方案中，使用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤。
64.本发明的间充质干细胞无血清培养基可以在制备后立即使用，替代性地，也可以在低温环境下保存供随后使用。在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞无血清培养基的双组剂在储存时分开各自保存，其中基础培养基组剂在2-8℃的温度条件下保存，营养添加组剂在-18至-22℃，例如-20℃的温度条件下保存。
65.间充质干细胞的培养方法再一方面，本发明提供了间充质干细胞的培养方法，其中使用本发明的间充质干细胞无血清培养基进行培养。
66.本发明的的间充质干细胞无血清培养基不仅适用于间充质干细胞的二维培养，而且能应用于间充质干细胞的三维培养，尤其是大规模三维培养。
67.在本文中使用时，术语“二维培养”是指其中细胞暴露于与细胞生长相容并允许细胞在单层中生长的条件的培养。适合这种生长的装置被称为“二维培养装置”。这种装置通常具有平坦的生长表面。用于二维培养的装置的非限制性实例是细胞培养皿和细胞培养板。
68.在本文中使用时，术语“三维培养”是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物，改变或减少细胞在培养的过程贴壁的特性，使细胞在空间上获得更多的生存空间，减少细胞接触抑制。
69.在本发明中，待培养的细胞是干细胞，例如是间充质干细胞，包括但不限于骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、骨骼间充质干细胞、肌肉间充质干细胞、肺间充质干细胞、肝间充质干细胞、胰腺间充质干细胞、羊水间充质干细胞、脐带间充质干细胞等。
70.二维培养方法包括以下步骤，1) 将包含细胞的细胞悬液与间充质干细胞完全培养基混合均匀；2) 收集细胞，用间充质干细胞完全培养基重悬细胞；3) 将细胞接种到细胞培养容器中，加入间充质干细胞完全培养基，置于培养箱中培养；4) 收获细胞。
71.所述间充质干细胞完全培养基是本发明的间充质干细胞无血清培养基，其组成如以上方面所描述。
72.在一些实施方案中，待培养的细胞可以是冷冻保存的细胞。在培养前，按照本领域技术人员熟知的程序解冻细胞，例如将冻存的细胞置入37℃水浴锅中摇晃解冻，例如肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出，从而得到可继续进行细胞培养的包含细胞的细胞悬液。
73.在一些实施方案中，间充质干细胞完全培养基在室温下制备后立即使用。在一些实施方案中，间充质干细胞完全培养基在低温下保存后已恢复至室温待使用。
74.在一些实施方案中，间充质干细胞完全培养基是通过逐滴加入的方式加入并与细胞悬液相混合均匀。
75.在一些实施方案中，采用离心的方式收集细胞，例如在200
×
g的转速下离心5 min。
76.在一些实施方案中，在使用间充质干细胞完全培养基重悬细胞后，精确计数。
77.在一些实施方案中，接种密度可以为6000-10000/cm2，例如6000/cm2、7000/cm2、8000/cm2、9000/cm2、10000/cm2，或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中，接种密度为8000/cm2。
78.在一些实施方案中，采用本领域常规温育条件进行培养，例如置于37℃，5% co2浓度，饱和湿度的培养箱中。
79.在一些实施方案中，连续培养时间随细胞汇合度达到合适标准，例如75-90%或80-85%所需的时间而变化，例如可以是连续培养2天、3天、4天等，在细胞汇合度达到合适标准，例如75-90%或80-85%以后按照本领域常规方法收获细胞，或者可以进行选择传代等后续步骤。
80.在具体实施方案中，本发明的间充质干细胞的二维培养方法包括如下步骤。
81.吸取细胞悬液至离心管中，加入恢复至室温的间充质干细胞完全培养基，轻柔混匀。离心收集细胞，随后吸去上清，加入间充质干细胞完全培养基重悬细胞。然后将细胞接种到细胞培养容器中，加入适量恢复至室温的新鲜间充质干细胞完全培养基，置于培养箱中培养。连续培养至合适细胞汇合度可选择传代。
82.三维培养方法包括以下步骤，1) 准备微载体：将微载体置于培养容器中，加入间充质干细胞完全培养基，使微载体均匀分散；2) 细胞接种及培养：将细胞悬液加入培养容器中，置于培养箱中培养；3) 收获细胞。
83.所述间充质干细胞完全培养基是本发明的间充质干细胞无血清培养基，其组成如以上所述。
84.在一些实施方案中，待培养的细胞可以是冷冻保存的细胞。在培养前，按照本领域技术人员熟知的程序解冻细胞，例如将冻存的细胞置入37℃水浴锅中摇晃解冻，例如肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出，从而得到可继续进行细胞培养的包含细胞的细胞悬液。
85.在一些实施方案中，间充质干细胞完全培养基在室温下制备后立即使用。在一些实施方案中，间充质干细胞完全培养基在低温下保存后已恢复至室温待使用。
86.在一些实施方案中，使用本领域中常规反应器，按照三维培养常规条件进行培养。在一些实施方案中，反应器的参数设定为变速培养和恒速培养相结合，例如40rpm，5min，1rpm，2h，持续1天。在任选地补充间充质干细胞完全培养基之后，反应器调为恒速40rpm，继续培养数天，例如1天、2天、3天、4天，根据细胞取样检测结果判定停止培养的时间。
87.在一些实施方案中中，可以采用本领域常规步骤进行细胞取样检测。例如，具体地，使用无菌移液管吸取少量微载体悬液置于微孔板例如96孔板中，通过荧光标记染色的方法进行细胞观察。
88.在一些实施方案中，可以采用本领域常规步骤进行细胞收获。在一些具体实施方案中，采用的微载体是可以用裂解液裂解的微载体，在微载体全部降解后，收集细胞悬液，离心，弃上清以收获细胞。也可用pbs重悬细胞，再离心，弃上清，任选地重复多次后收获细胞。在收获细胞以后，可以重悬至适合密度备用。
89.在一些实施方案中，任选地包括细胞计数，检测活细胞数、细胞活率、细胞直径等相关参数。在具体实施方案中，取少量裂解后重悬一次的细胞悬液，置于细胞计数仪进行计数，最后检测活细胞数、细胞活率、细胞直径等相关参数。
90.在具体实施方案中，本发明的间充质干细胞的三维培养方法包括如下步骤：1. 微载片及细胞准备：取微载片投入培养瓶中，加入间充质干细胞完全培养基，晃动培养瓶使微载片均匀分散；2. 细胞接种及培养：将细胞悬液加入培养瓶中，补加间充质干细胞完全培养基，置于培养箱中培养，期间任选地补充间充质干细胞完全培养基；3. 任选地细胞取样观察：使用无菌移液管吸取少量微载体悬液置于微孔板中，通过荧光标记染色的方法进行细胞观察；4. 细胞收获：停止搅拌生物反应器，待微载体沉降后弃上清，加入裂解液裂解消化，待微载体全部降解，收集细胞悬液，任选地进行离心、弃上清、pbs重悬细胞、再离心，和弃上清等步骤，任选地根据需求，将细胞重悬至适合密度，备用；5. 任选地细胞计数：取少量裂解后重悬一次的细胞悬液，置于细胞计数仪进行计数，最后检测活细胞数、细胞活率、细胞直径等相关参数。
91.相比细胞二维培养，细胞三维培养具有诸多优势：1、更接近体内环境，细胞在三维结构中可以形成更复杂的组织结构，更接近人体内部环境，这使得三维培养的细胞更具有生物学意义和临床价值。2、更好的细胞-细胞和细胞-基质相互作用：三维培养可以使细胞更好地进行细胞-细胞和细胞-基质相互作用，从而更好地模拟体内生物环境，增加细胞之间通讯，有利于生长和分化的可塑性。3、更好的药物筛选，三维培养可以更好地模拟体内生物环境，因此更适合用于药物筛选。这种方法可以帮助更好地预测新药物的疗效和安全性，从而更好地提高药物的研发效率。4、更好的组织工程和再生医学应用，三维培养可以为组织工程和再生医学提供更好的模型和方法。通过三维培养，可以将多种细胞类型组合成复杂的组织结构，这对于研究细胞间相互作用和细胞分化有很大的帮助。此外，三维培养还可以为组织修复和再生提供更好的方法，例如利用干细胞和多能细胞进行组织工程。
92.进行细胞三维培养时可以采用包含微载体的三维培养系统。在本文中使用时，术语“微载体”是指允许贴壁细胞例如间充质干细胞在生物反应器中生长的支持基质颗粒。在本发明中，微载体可以是球体、圆柱体或扁平载体。微载体可以是实心的或多孔的。微载体大小可为10-1000微米的多孔微球，其中有若干相互连通的大于10微米直径的小孔构成的多孔通透结构包裹细胞，如同蜂巢与蜜蜂的关系，微载体的多孔结构为细胞提供了巢穴保护其受到外界不利因素的影响。
93.微载体可以由多种不同的材料制成。在一些实施方案中，微载体由不可生物降解的材料制成，例如但不限于纤维素、deae-葡聚糖、羟基化甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷和硅酮。在一些实施方案中，微载体由可生物降解的材料制成，例如但不限于胶原蛋白、藻酸盐、葡聚糖、结冷胶和明胶。这些微载体材料以及不同的表面化学性质可以影响细胞行为，包括形态和增殖。
94.可用于细胞三维培养的微载体可通过市售从制造商处购买获得，例如global cell solutions、ge healthcare、cultispher percell、solohill engineering、思拓凡 (cytiva)，和北京华龛等。在一些实施方案中，三维培养中使用的微载体是三维多孔微载
体，优选地，所述三维多孔微载体具有80-400μm粒径和30-50μm孔径。本发明的间充质干细胞无血清培养基可以适用于使用各种市售三维培养用微载体进行的间充质干细胞的三维培养。
95.应当理解的是，使用本发明的间充质干细胞无血清培养基来培养间充质干细胞的方法不应局限于以上描述的实施方案。其中使用了本发明的的间充质干细胞无血清培养基的间充质干细胞培养方法均应落在本发明的范围内。
96.间充质干细胞无血清培养基在培养间充质干细胞中的用途再一方面，本发明提供了间充质干细胞无血清培养基在培养间充质干细胞中的用途。在一些实施方案中，所述培养是二维培养。在一些实施方案中，所述培养是三维培养。
97.实施例下面通过实施例，并结合附图，对本发明作进一步详细描述。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。
98.以下实施例中使用的血小板裂解物是购自elitecell biomedical corp的elitegro-adv。
99.实施例1 不同浓度植物蛋白水解物对mscs增殖的影响采用上述配方制备培养基，按照常规培养方法进行脐带间充质干细胞的培养。人脐带间充质干细胞p5复苏、接种（接种量2
×
105个）于t25培养瓶，培养3天，检测增殖倍数。
100.表1
表1结果显示，当植物蛋白水解物浓度在5g/l时，增殖倍数较高，培养效果较好。
101.实施例2本实施例提供了一种msc无血清培养基(hk-sfm)，基础培养基为α-mem，含量为95% (v/v)，其它各成分及浓度分别为：采用上述配方制备培养基，按照常规培养方法进行脐带间充质干细胞的培养。
102.实施例3 脐带间充质干细胞的原代分离培养按实施例2配制间充质干细胞完全培养基，无菌培养皿若干（6-10个），医用消毒酒精 1瓶，生理盐水1瓶，工具盒（2把剪刀、2把镊子），和取回的脐带（置于脐带保存液中）一起转入生物安全柜。吸弃脐带保存瓶中的脐带保存液，加入医用消毒酒精（75%）完全浸没脐带，浸泡消毒2分钟。取出脐带置于无菌培养皿中，使用生理盐水清洗2-3次，将残留脐血清洗干净。然后将脐带剪成约2-3 cm小段，再次使用生理盐水清洗2-3次，将残留脐血清洗干净。沿静脉剪开脐带并去除静脉壁，完全去除静脉壁后脐带会完全展开，随后去除2根动脉，完全去除静脉和动脉后，小心分离华通氏胶，注意避开表皮。将分离的华通氏胶转入50 ml离心管中，加入3-5滴生理盐水保持湿润，使用弯头手术剪将华通氏胶剪碎至2-3 mm3大小，随后称重。剪碎的华通氏胶加入实施例2间充质干细胞完全培养基重悬，接种到培养瓶中，放入培养箱中（37℃，5% co2，饱和湿度）培养。接种后第5天，开始有细胞从组织块爬出，将培养瓶直立倾斜30度，让组织块自然沉降到培养瓶一角，吸弃上清，缓慢加入新鲜复温的实施例2间充质干细胞完全培养基，轻柔混匀，放回培养箱继续培养。接种后第9-10天，爬出细胞状态良好，开始堆叠生长，将培养瓶直立倾斜30度，让组织块自然沉降到培养瓶一角，吸
弃上清，缓慢加入新鲜复温的实施例2间充质干细胞完全培养基，轻柔混匀，放回培养箱继续培养，第14日左右即可传代（见图1）。吸去培养上清和组织块，加入生理盐水清洗1次，吸弃。加入复温的消化液（科研级 0.125%胰蛋白酶消化液），37℃消化4-5分钟，随后加入等体积酶抑制剂/完全培养基终止消化，收集细胞离心（200
×
g，5min），细胞计数，共收获 4.46
×
105细胞（见表2），对细胞进行冻存。
103.表2实施例4 脐带间充质干细胞的二维连续传代本实施例对实施例2提供的无血清培养基与对照组培养基的细胞二维连续传代能力进行检测。对照组为市售不含植物蛋白水解物但含有血小板裂解物的培养基。
104.实验方法：人脐带间充质干细胞p2复苏、接种（接种量2
×
105个）于t25培养瓶中，培养3天，细胞计数仪检测细胞活率、增殖倍数及细胞直径大小。连续传至第8代。实验结果图2-5显示：hk-sfm与对照组mscs各代次细胞活率均较高，但使用hk-sfm培养基，mscs呈形态均一的长梭形，维持更高的增值倍数，均在10倍以上增殖，且维持更低的细胞直径。
105.实施例5 流式细胞仪检测二维培养细胞表型本实施例对实施例2提供的无血清培养基与对照组培养基 (市售不含植物蛋白水解物但含有血小板裂解物的培养基) 的p8代细胞表型进行检测。本实施例中检测的细胞是实施例4中所培养的间充质干细胞。
106.实验方法：用tryple 消化收集实验组无血清培养基和对照组培养基中的p8代细胞，分别与荧光标记的cd73、cd90、cd105、cd14、cd19、cd34、cd45和hla-dr等表面抗体孵育，并以fitc 和pe 标记的小鼠igg 同型抗体作为对照；在4℃下孵育45min，离心收集细胞；利用pbs 缓冲液清洗3 次后，将细胞重悬于400μl pbs 缓冲液中，上机进行流式细胞仪分析。实验结果表3显示：hk-sfm与对照组mscs均高表达间充质干细胞特异性抗原cd73、cd90、cd105，低表达造血及内皮细胞表面标志cd14、cd19、cd34、cd45与移植免疫排斥相关的表面标志物hla-dr，符合2006年isct对msc鉴定的描述。
107.表3实施例6 脐带间充质干细胞的三维连续传代本实施例对实施例2提供的无血清培养基与对照组培养基 (市售不含植物蛋白水解物但含有血小板裂解物的培养基) 的细胞三维连续传代能力进行检测。
108.实验方法：人脐带间充质干细胞p2复苏、接种（接种量6
×
105个）于t75培养瓶中，培养3天后，接种于125ml转瓶中，细胞接种量2.5
×
106个，微载体100mg，培养基体积50 ml，间速培养（40rpm，5min；1rpm，2h）。1天后（第1日）补充培养基25ml，转速调为恒速40 rpm，再培养3天（第4日）后染色、计数，连续传至第6代。实验结果图6-9显示：hk-sfm与对照组各代次mscs细胞活率均较高（图6-7），但使用hk-sfm培养基，mscs维持更高的增值倍数（图8）及更低的细胞直径（图9）。
109.实施例7 流式细胞仪检测三维培养细胞表型本实施例对实施例2提供的无血清培养基与对照组培养基 (市售不含植物蛋白水解物但含有血小板裂解物的培养基) 的三维p6代细胞表型进行检测。本实施例中检测的细胞是实施例6中所培养的间充质干细胞。
110.实验方法：用胰酶消化收集实验组无血清培养基和对照组培养基中的p8代细胞，分别与荧光标记的cd73、cd90、cd105、cd14、cd19、cd34、cd45和hla-dr等表面抗体孵育，并以fitc 和pe 标记的小鼠igg 同型抗体作为对照；在4℃下孵育45 min，离心收集细胞；利用pbs 缓冲液清洗3次后，将细胞重悬于400 μl pbs 缓冲液中，上机进行流式细胞仪分析。实验结果表4显示：hk-sfm与对照组mscs均高表达间充质干细胞特异性抗原cd73、cd90、cd105，低表达造血及内皮细胞表面标志cd14、cd19、cd34、cd45与移植免疫排斥相关的表面标志物hla-dr，符合2006年isct对msc鉴定的描述。
111.表4本发明所能达到的效果本发明中培养基在人脐带间充质干细胞二维培养与三维培养连续传代时均可维持较高的细胞活率及增殖倍数。
112.本发明的实施方案并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种间充质干细胞无血清培养基，其包括以下组分且含量如下所示：以该间充质干细胞无血清培养基总体积计，2.根据权利要求1所述的间充质干细胞无血清培养基，其中所述基础培养基是α-mem培养基。3. 根据权利要求1或2所述的间充质干细胞无血清培养基，其中所述血小板裂解物的含量为1-5% (v/v)；以及所述植物蛋白水解物的含量为5-10g/l。4. 根据权利要求1或2所述的间充质干细胞无血清培养基，其中所述血小板裂解物的含量为2% (v/v)；以及所述植物蛋白水解物的含量为5g/l。5.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞无血清培养基，其中l-谷氨酰胺含量为4mm；还原型谷胱甘肽含量为100μg/l；氢化可的松的含量为1.0mg/l。6.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞无血清培养基，其中egf含量为20ng/ml；bfgf含量为20ng/ml；tgf-β含量为10ng/ml；以及pdgf-bb含量为10ng/ml。7.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞无血清培养基，其中重组人胰岛素的含量为10mg/l；黄体酮的含量为20ng/l。8.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞无血清培养基，其中重组人转铁蛋白含量为20mg/l。9.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞无血清培养基，其中维生素c的含量为20mg/l；葡萄糖的含量为25mm；丙酮酸钠的含量为1mm；亚硒酸钠的含量为30mg/l。10.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞无血清培养基，其包括以下组分且含量如下所示：以该间充质干细胞无血清培养基总体积计，
11.一种根据权利要求1-10中任一项所述的间充质干细胞无血清培养基的制备方法，其包括：将各组分按比例加入到基础培养基中。12.一种间充质干细胞的二维培养方法，其包括以下步骤，1) 将包含细胞的细胞悬液与间充质干细胞完全培养基混合均匀；2) 收集细胞，用间充质干细胞完全培养基重悬细胞；3) 将细胞接种到细胞培养容器中，加入间充质干细胞完全培养基，置于培养箱中培养；和4) 收获细胞；其中，所述间充质干细胞完全培养基是根据权利要求1-10中任一项所述的间充质干细胞无血清培养基。13.一种间充质干细胞的三维培养方法，其包括以下步骤：1) 准备微载体：将微载体置于培养容器中，加入间充质干细胞完全培养基，使微载体均匀分散；2) 细胞接种及培养：将细胞悬液加入培养容器中，置于培养箱中培养；和3) 收获细胞；其中，所述间充质干细胞完全培养基是根据权利要求1-10中任一项所述的间充质干细胞无血清培养基。14.根据权利要求1-10中任一项所述的间充质干细胞无血清培养基在培养间充质干细
胞中的用途。

技术总结
本发明涉及一种间充质干细胞无血清培养基，具体地，该无血清培养基包括基础培养基、血小板裂解物、植物蛋白水解物和其他培养用组分例如但不限于L-谷氨酰胺、氢化可的松和生长因子等。本发明的干细胞无血清培养基在适用于间充质干细胞二维培养的同时还特别地适用于间充质干细胞的三维培养，具有干细胞扩增质量高、数量大、安全性高等优点。安全性高等优点。


技术研发人员：鄢晓君 刘伟 张元元 张志华
受保护的技术使用者：北京华龛生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/7/12