整合素蛋白ITGA5作为标志物在制备治疗高白细胞性急性髓系白血病药物中的应用

整合素蛋白itga5作为标志物在制备治疗高白细胞性急性髓系白血病药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及整合素蛋白itga5作为标志物在制备治疗高白细胞性急性髓系白血病药物中的应用。


背景技术：

2.急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，aml)是一种克隆性造血干细胞恶性肿瘤，其特征是未成熟祖细胞的积累，分化受阻，导致造血功能的抑制。aml外周血象中白细胞计数超过100
×
109/l时称为高白细胞性急性髓细胞白血病(hyperleukocytic acute myeloid leukemia，haml)，约占aml的5％-20％。haml起病急骤，进展迅速，缓解率相对较低，早期死亡率高，一周内死亡率高达40％，属急性白血病中的高危类型。白血病细胞在骨髓中大量增殖并迁移至外周，在组织中淤滞导致组织缺氧、栓塞是早期死亡的主要原因，但其恶性增殖浸润的机制尚不明确。
3.整合素是细胞膜上最重要的力学敏感受体之一，介导细胞与细胞周围基质或邻近细胞发生力学作用，并将力学刺激信号转导为生化信号，进而激活细胞内一系列应答反应，最终影响细胞分化、迁移等功能，在细胞微观力学研究中至关重要。以整合素和相关粘着斑蛋白为介导的细胞和细胞外基质(ecm)之间的粘附和力学传导细胞迁移中基础而又重要的环节。目前关于整合素介导的细胞迁移行为的力学生物学机制还缺乏统一的认识。
4.由于早期致死率高，部分haml患者没有接受常规治疗及药物治疗的时机，有效的标志物对haml的诊断和治疗将具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供整合素蛋白itga5作为标志物在制备治疗高白细胞性急性髓系白血病药物中的应用。本发明的目的还在于提供整合素蛋白itga5在制备诊断高白细胞性急性髓系白血病的产品中的应用。
6.本发明的目的通过下述技术方案实现：
7.本发明通过收集haml患者、nhaml(非高白细胞性急性髓细胞白血病)患者及健康对照者骨髓细胞，进行单细胞转录组、蛋白组学测序，绘制haml单细胞分子图谱，解析haml特异群体及异常表达分子，发现haml白血病细胞中整合素itga5表达异常。进一步扩大样本量，收集正常人、初治haml患者和nhaml患者骨髓cd34+细胞和骨髓上清，提取核酸，pcr验证整合素基因水平表达，明确了haml患者特异高表达整合素itga5。本发明还发现抑制整合素蛋白itga5的表达或活性能够有效的抑制haml白细胞迁移、侵袭、增殖等。
8.整合素蛋白itga5作为标志物在制备治疗haml药物中的应用。
9.整合素蛋白itga5的抑制剂在制备治疗haml药物中的应用。
10.整合素蛋白itga5的抑制剂在制备抑制haml白细胞迁移、侵袭、增殖的药物中的应用。
11.所述的药物以itga5为靶标抑制itga5基因表达或抑制itga5蛋白活性。
12.所述的itga5的抑制剂包括：抑制itga5基因表达的物质，抑制itga5蛋白活性的物质。进一步的，所述的itga5的抑制剂为atn161；或所述的itga5的抑制剂为itga5蛋白的抗体。
13.检测整合素蛋白itga5表达水平的试剂在制备诊断haml试剂或试剂盒中的应用。所述的检测整合素蛋白itga5表达水平的试剂包括qpcr引物。
14.本发明的优点和有益效果：本发明通过抑制整合素蛋白itga5的表达，能够有效的抑制haml白细胞的迁移侵袭等。itga5可以作为haml的检测靶点，也可以作为治疗haml的靶点。
附图说明
15.图1是itga5抑制剂atn161抑制haml患者白细胞迁移。
16.图2是itga5抑制剂atn161抑制haml患者白细胞侵袭。
17.图3是qpcr检测itga5在haml/nhaml/正常人白细胞中的表达情况。
18.图4是elisa检测itga5在haml/nhaml/正常人骨髓上清中的表达情况。
19.图5是转录组测序发现itga5在不同haml患者白细胞中表达升高，图中基线为正常人水平。
具体实施方式
20.以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
21.下述实施例中所使用的haml患者白细胞的获取：抽取haml患者骨髓低温保存，尽快送至实验室分离培养。将骨髓液轻轻加至装有等体积percoll工作液(密度1.073g/l)的15ml无菌离心管中，注意操作要尽可能轻柔、平稳。随后可观察到离心管中形成明显的两层，上层是骨髓，下层是percoll液。将离心管放入离心机，设定转速500g，离心时间25min，离心后，此时离心管中由上至下分为四层。吸管将中间的白膜层轻轻吸出，用含2％ fbs的pbs缓冲液反复洗涤2次。依次以250g转速分别离心10min、5min，弃上清后留单个核细胞沉淀，即为haml患者白细胞。
22.实施例1整合素itga5抑制剂抑制haml患者白细胞迁移和侵袭
23.(1)细胞迁移实验：
24.磁珠分选haml患者白细胞采分离物cd34+细胞；在transwell上室中加入0.1ml不含血清的细胞悬液，使细胞终浓度为7.5
×
104cells/well，再加入一定浓度的itga5抑制剂atn161；在transwell下室加入0.8ml含10％血清的培养液作为chemoattractant，吸引细胞进行迁移及分泌基质蛋白酶侵袭；将细胞培养板放在37℃、5％ co2培养箱孵育24-48小时；移除培养液，pbs洗涤两次，用棉签轻轻擦除未迁移的细胞；加入1ml 100％甲醇室温固定30分钟，再以pbs清洗2次；加入1ml 0.1％结晶紫染液室温染色20分钟，再以pbs清洗2次；将transwell移至载玻片上，在显微镜下随机6-9个视野观察计算迁移的细胞数，发现itga5抑制剂atn161能明显减少下室迁移细胞数，能明显抑制haml细胞迁移(图1)。
25.(2)细胞侵袭实验：
26.提前准备好0.5
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的c缓冲溶液、1
×
的a胶、适用24孔板的transwell装置；用37℃的c缓冲溶液将a胶稀释15-20倍，根据transwell上室底部面积加入a胶稀释液0.2ml到transwell上室中，然后置于4℃冰箱孵育2-3小时；在transwell上室中加入0.1ml不含血清的细胞悬液，使细胞终浓度为7.5
×
104cells/well，再加入一定量的itga5抑制剂atn161；在transwell下室加入0.8ml含10％血清的培养液作为chemoattractant，吸引细胞进行迁移及分泌基质蛋白酶侵袭；将细胞培养板放在37℃、5％ co2培养箱孵育24-48小时；移除培养液，pbs洗涤两次，用棉签轻轻擦除未迁移的细胞；加入1ml 100％甲醇室温固定30分钟，再以pbs清洗2次；加入1ml 0.1％结晶紫染液室温染色20分钟，再以pbs清洗2次；将transwell移至载玻片上，在显微镜下随机6-9个视野观察计算迁移的细胞数，发现itga5抑制剂atn161能明显减少下室侵袭细胞数，能明显抑制haml细胞侵袭(图2)。
27.实施例2qpcr检测itga5在haml患者白细胞的表达情况：
28.1.rna提取及浓度检测：收集1
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107个haml患者(或nhaml患者、正常人)白细胞，加入1ml trizol反复吹打混匀，颠倒10次，待液体澄清后，室温静置5min；加入0.2ml的氯仿颠倒混匀10下后，室温静置5min，4℃12000g离心15min；取上层水相约400μl于另一rnafree的1.5ml ep管中；加入同等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min；4℃12000g离心10min后弃上清，加入预冷的75％乙醇(用depc水稀释)1ml，4℃7500g离心5min；弃上清，空气干燥5-10min后溶于20μl depc水中，-80℃保存；用核酸浓度检测仪检测所得rna浓度，a260/280值在2.0左右为最佳。
29.2.cdna合成
30.(1)
[0031][0032]
42℃2min(或者室温5min)，4℃保存。
[0033]
(2)《tb green qpcr法》
[0034]
[0035]
pcr上机：37℃15min-85℃5sec
‑‑
4℃冷却
‑‑
合成产物-20℃保存
[0036]
3.rt-pcr反应：以20μl反应体系为例。
[0037][0038]
其中，检测itga5的引物序列如下：
[0039]
itga5-f：tggaaggtcagcagctcctatat，
[0040]
itga5-r：ctgcagactttggctctcttgtt。
[0041]
反应条件(三步法)：预变性95℃10min；变性95℃15s，退火55-64℃30s，延伸72℃32s，39个循环数。
[0042]
qpcr结果如图3所示，itga5在haml患者细胞高表达，高于aml(nhaml)和正常人。
[0043]
实施例3elisa检测haml患者、nhaml患者、正常人骨髓上清中itga5表达情况
[0044]
(1)准备试剂、样品和标准品。
[0045]
(2)在每孔中加入100μl标准品或样品，在37℃下孵育2小时。吸去每孔中的液体，不要清洗。
[0046]
(3)在每孔中加入100μl生物素抗体(1倍)。在37℃下孵育1小时。吸去每孔中的液体，洗3次。
[0047]
(4)在每孔中添加100μl hrp-avidin(1
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)。在37℃下培养1小时，
[0048]
(5)吸去每孔中的液体，洗5次。
[0049]
(6)在每孔中加入90μl tmb底物。在37℃的温度下孵育15-30分钟。避免光线。
[0050]
(7)在每孔中加入50μl的停止液。在5分钟内在450nm处读取。
[0051]
结果见图4，itga5在haml患者骨髓上清中高表达，高于aml(nhaml)和正常人。
[0052]
实施例4转录组测序
[0053]
(1)样品准备：准备好haml患者白细胞、nhaml患者、正常人白细胞后，使用无酶枪头将实验细胞混匀，并转移到于无酶1.5ml离心管中，低温高速离心机设置为13000rpm10s，离心结束后，完全吸取弃掉上清，只留下细胞沉淀。
[0054]
(2)总rna提取：使用试剂盒进行rna的提取，全程使用无酶枪头和ep管。
①
轻轻弹松沉淀，使用无酶枪头吸取350μl裂解液，并加入到细胞沉淀中。快速吹打混匀，并用涡旋器振荡30s，使其充分裂解；
②
加入350μl 70％乙醇，再次吹打混匀，将混合物转移至试剂盒的吸附柱中，低温高速离心机设置为13000rpm 30s，快速离心后，可见下层废液，将其直接倒掉；
③
向吸附柱中加入700μl去蛋白液，不立即离心，先室温放置，计时30s。计时结束，依旧用低温高速离心机13000rpm离心30s，将下层废液倒在废液桶中；
④
向吸附柱中加入500μl漂洗液进行漂洗，离心条件同前，将下层废液倒在废液桶中，再用重复洗涤1次，离心倒掉废液后再在13000rpm条件下离心2min；
⑤
将上层吸附柱转移到新的无酶ep管中，根据细胞沉
淀的量向吸附柱中加入适量depc水，一般为30-50μl，尽量避免因depc水太多导致提取浓度低。将样品室温放置，计时1min，低温高速离心机13000rpm离心1min，便可以得到提取的rna。将提取的rna进行分装，储存于-80℃冰箱中，避免反复冻融。
[0055]
(3)转录组测序：将提取的rna交由商业化测序公司完成。
[0056]
(4)分析差异基因：用deseq2对readcount数据进行标准化得到差异基因结果。筛选标准为差异倍数大于2，校正后的p值小于0.05，得到显著差异表达的基因(differentially expressed gene，deg)。利用r语言绘制差异基因火山图和差异基因聚类热图。
[0057]
(5)差异基因富集分析：使用david数据库对差异基因进行了基因本体论(gene onotology，go)分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，kegg)分析。结果见图5，itga5在不同haml患者中表达升高。

技术特征：
1.整合素蛋白itga5作为标志物在制备治疗haml药物中的应用。2.整合素蛋白itga5的抑制剂在制备治疗haml药物中的应用。3.整合素蛋白itga5的抑制剂在制备抑制haml白细胞迁移、侵袭、增殖的药物中的应用。4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述的药物以itga5为靶标抑制itga5基因表达或抑制itga5蛋白活性。5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述的itga5的抑制剂包括：抑制itga5基因表达的物质，抑制itga5蛋白活性的物质。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的itga5的抑制剂为atn161。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的itga5的抑制剂为itga5蛋白的抗体。8.检测整合素蛋白itga5表达水平的试剂在制备诊断haml试剂或试剂盒中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的检测整合素蛋白itga5表达水平的试剂包括qpcr引物。

技术总结
本发明公开了整合素蛋白ITGA5作为标志物在制备治疗高白细胞性急性髓系白血病药物中的应用，属于医药技术领域。本发明发现高白细胞性急性髓系白血病(HAML)患者特异高表达整合素ITGA5，抑制整ITGA5的表达或活性能够有效的抑制HAML细胞迁移、侵袭、增殖。本发明提供了ITGA5作为标志物在制备治疗HAML药物中的应用，以及ITGA5的抑制剂在制备治疗HAML药物中的应用和抑制HAML白细胞迁移、侵袭、增殖的药物中的应用，还提供了检测ITGA5表达水平的试剂在制备诊断HAML试剂或试剂盒中的应用。剂在制备诊断HAML试剂或试剂盒中的应用。剂在制备诊断HAML试剂或试剂盒中的应用。


技术研发人员：周芙玲 黎鑫琦 刘晓燕 吴金娴 张楠 王倩 陈国鹏 谭御心 马琳璐
受保护的技术使用者：武汉大学中南医院
技术研发日：2023.03.10
技术公布日：2023/7/12