羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的CuET纳米颗粒、靶向递送CuET的纳米药物及其制备和应用

羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒、靶向递送cuet的纳米药物及其制备和应用
技术领域
1.本发明属于纳米材料技术领域，更具体地，涉及羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒、靶向递送cuet的纳米药物及其制备和应用。


背景技术：

2.cuet是临床中广泛使用的戒酒药双硫仑与cu(ⅱ)离子反应形成的配位化合物，研究表明，cuet是双硫仑发挥抗癌功能的主要功效成分。双硫仑进入体内先代谢成ddtc盐，再与cu(ⅱ)离子反应生成cuet来杀伤癌细胞。目前已有诸多的临床研究，联合双硫仑和cu(ⅱ)离子用于癌症的治疗。但是临床研究结果表明，其抗癌效果并不佳。主要原因是双硫仑水溶性不好，进入体内容易被代谢掉，不能有效的在肿瘤部位形成具有杀伤癌细胞功能的cuet。而直接使用cuet的方法亦面临着诸多的挑战，cuet的水溶性也非常不好，在体内容易被清除。这些因素都极大地限制了双硫仑和cuet用于抗癌的应用。
3.目前，已有诸多的技术利用各种纳米载体来装载递送双硫仑或cuet用于肿瘤治疗。蒲雨吉等人利用多种蛋白制备cuet纳米颗粒，改善了cuet的水溶性。唐含笑等利用pvp，plla-peg等高分子制备包载cuet的微球，改善了cuet的水溶性和稳定性。但是这些方法均存在以下一些问题：1.制备得到的药物载体缺乏肿瘤靶向性，难以在肿瘤部位富集；2.制备过程复杂，载药效率不高，载药量也不高；3.制备过程中需要用到有毒的有机试剂，这给除杂纯化和质量控制带来了困难。


技术实现要素：

4.针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒、靶向递送cuet的纳米药物及其制备和应用，以解决现有技术cuet在水中溶解性和稳定性差，不利于肿瘤治疗应用等的技术问题。
5.为实现上述目的，本发明提供了一种羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒，其为羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定cuet纳米晶而形成的纳米颗粒，其中羟烷基淀粉和聚多巴胺包覆于所述cuet纳米晶表面，形成所述羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒。
6.优选地，所述羟烷基淀粉为羟甲基淀粉、羟乙基淀粉、羟丙基淀粉或羟丁基淀粉，进一步优选为羟乙基淀粉。
7.优选地，所述羟烷基淀粉和cuet纳米晶的质量比为100：1～100，所述聚多巴胺和cuet纳米晶的质量比为10：1～10。
8.优选地，所述纳米颗粒的直径为40～300纳米。
9.按照本发明的另一个方面，提供了一种羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液，其包含所述的羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒，所述纳米颗粒为羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定cuet纳米晶而形成的纳米颗粒，其中羟烷基淀粉和聚多巴
胺包覆于所述cuet纳米晶表面使得所述cuet纳米晶稳定分散于水中形成所述羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液。
10.优选地，所述羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒在该分散液中的浓度为0.1～100mg/ml。
11.按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的纳米颗粒分散液的制备方法，包括如下步骤：
12.(1)将cu(ⅱ)离子盐溶液与ddtc盐溶液在羟烷基淀粉水溶液中混合使其发生反应，得到羟烷基淀粉稳定的cuet纳米颗粒分散液；
13.(2)将步骤(1)所述羟烷基淀粉稳定的cuet纳米颗粒分散液与多巴胺在碱性条件下混合，使多巴胺发生聚合反应，纯化后得到所述羟烷基淀粉与聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液。
14.优选地，步骤(1)中，所述羟烷基淀粉水溶液的浓度为0.1～100mg/ml；所述cu(ⅱ)离子盐溶液中铜(ⅱ)离子的浓度为0.000177～17.7mg/ml；
15.所述cu(ⅱ)离子盐为硝酸铜、硫酸铜或氯化铜；所述ddtc盐溶液为ddtc钠盐水溶液或ddtc钾盐水溶液；
16.将所述cu(ⅱ)离子盐溶液与ddtc盐溶液通过滴加方式加入至所述羟烷基淀粉水溶液中，在滴加同时进行搅拌，得到羟烷基淀粉稳定的cuet纳米颗粒分散液。
17.优选地，步骤(2)中，所述多巴胺与步骤(1)所述cu(ⅱ)离子的摩尔比为10：0.427～4.27；所述碱性条件其ph范围为9～11；步骤(2)所述纯化为超滤或透析。
18.按照本发明的另一个方面，提供了一种羟烷基淀粉和改性聚多巴胺共稳定的cuet纳米药物，其为在所述的羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液中的聚多巴胺表面修饰巯基化的羟烷基淀粉后得到的纳米药物。
19.优选地，所述的纳米药物，其制备方法包括如下步骤：将所述羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液与巯基化的羟烷基淀粉混合后反应，使其中聚多巴胺的表面修饰巯基化的羟烷基淀粉，即得到所述纳米药物。
20.按照本发明的另一个方面，提供了一种靶向递送cuet的纳米药物，其为在所述的羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液中的聚多巴胺表面修饰偶联靶向肿瘤的分子的巯基化的羟烷基淀粉后得到的纳米药物。
21.优选地，所述的纳米药物，其制备方法包括如下步骤：将所述羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液与偶联靶向肿瘤的分子的巯基化的羟烷基淀粉混合后反应，使其中聚多巴胺的表面修饰偶联靶向肿瘤的分子的巯基化的羟烷基淀粉，即得到所述纳米药物。
22.优选地，所述偶联靶向肿瘤的分子的巯基化的羟烷基淀粉与所述cuet中cu(ⅱ)离子的质量比为100：0.00177～17.7。
23.按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒、所述的羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液、所述的羟烷基淀粉和改性聚多巴胺共稳定的cuet纳米药物和/或所述的靶向递送cuet的纳米药物在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。
24.优选地，将所述的羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒、所述的羟烷基
淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液、所述的羟烷基淀粉和改性聚多巴胺共稳定的cuet纳米药物和/或所述的靶向递送cuet的纳米药物在高压氧环境中使用。
25.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下
26.有益效果：
27.(1)本发明提供的一种羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒及纳米颗粒分散液，通过采用羟烷基淀粉和聚多巴胺包覆于cuet纳米晶表面，形成羟烷基淀粉和聚多巴胺共修饰的cuet纳米颗粒，实验发现，该修饰改性方式解决了cuet的水溶性问题，提高了cuet在水溶液中的溶解性和稳定性。
28.(2)本发明在羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒基础上，通过在聚多巴胺表面修饰一层巯基修饰的羟乙基淀粉，实验发现，相较于未对聚多巴胺进行修饰，得到的cuet纳米药物在血液中稳定性更佳，肿瘤抑制效果更好。
29.(3)本发明在羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒基础上，进一步通过在聚多巴胺表面修饰一层偶联靶向肿瘤的分子的巯基修饰的羟乙基淀粉，得到了一种能够靶向递送的cuet纳米药物，可以特异性的在肿瘤部位富集，并且更多的被肿瘤细胞摄取，较未偶联靶向肿瘤的分子的纳米药物，抗肿瘤效果更好。
30.(4)本发明以临床上广泛使用的羟乙基淀粉作为辅料，在水溶液中通过简单的制备方法制备得到羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒、纳米颗粒分散液、羟烷基淀粉和改性聚多巴胺共稳定的cuet纳米药物以及靶向递送cuet的纳米药物，该制备过程无有毒的有机试剂或无机试剂，具有极大的临床应用前景。
31.(5)本发明提供的羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒、纳米颗粒分散液、羟烷基淀粉和改性聚多巴胺共稳定的cuet纳米药物、靶向递送cuet的纳米药物的制备过程载药效率高，无复杂的除杂纯化过程，即可用于抗癌药物的应用，包封率100％，载药量容易控制，且容易重复。
32.(6)本发明优选实施例设计和制备的靶向递送cuet的纳米药物解决了cuet的水溶性问题，修饰了肿瘤靶向基团的分子比如叶酸，可以特异性的在肿瘤部位富集，并且更多的被肿瘤细胞摄取。
33.(7)本发明设计和制备的共稳定cuet的纳米药物不仅可以杀伤多种癌细胞，还能杀伤肿瘤干细胞，抑制癌症发展。
34.(8)实验证明，将本发明提供的共稳定cuet的纳米药物联合高压氧治疗癌症，具有协同增效的作用。
35.(9)本发明优选实施例中提供的一种靶向递送cuet的纳米药物，由羟乙基淀粉与聚多巴胺共同稳定cuet纳米结晶而组成的纳米颗粒，在纳米颗粒外层还包裹了一层偶联叶酸的巯基化的羟乙基淀粉，提供靶向效果和稳定效果。先通过一步法制备得到羟乙基淀粉稳定的cuet纳米颗粒，再将多巴胺通过聚合反应装载进入纳米颗粒，最后在纳米颗粒外层包裹偶联叶酸的巯基化的羟乙基淀粉，进一步增强了cuet纳米颗粒的稳定性和靶向性。经过上述过程即可制备得到一种靶向递送cuet的纳米药物。本发明所制备的靶向递送cuet的纳米药物可以提高cuet的水溶性，延长cuet在血液中的循环时间，提高cuet在肿瘤部位的富集，增强cuet对肿瘤细胞和肿瘤干细胞的抑制作用，增强cuet在体内的抗肿瘤效果。并且结合高压氧治疗，可以进一步提高靶向递送cuet的纳米药物的抗肿瘤效果。
附图说明
36.图1为偶联叶酸的巯基化的羟乙基淀粉的合成路线图；
37.图2为实施例1和对比例1制备得到的不同样品的照片；
38.图3为样品1～5的动态光散射粒径分布结果；
39.图4为样品2的tem结果；
40.图5为样品2的ftem结果；
41.图6为不同样品在50％ fbs溶液中的粒径分布结果；
42.图7为不同样品的xrd结果；
43.图8为不同样品的紫外吸收波谱分析结果；
44.图9为不同浓度药物孵育后4t1细胞活力结果；
45.图10为不同样品不同浓度药物孵育后4t1干细胞活力结果；
46.图11为不同样品治疗4t1乳腺癌皮下瘤药效结果；
47.图12为不同样品治疗panc02胰腺癌药效结果；
48.图13为不同样品联合高压氧治疗panc02胰腺癌肿瘤照片。
具体实施方式
49.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
50.羟乙基淀粉作为血浆扩容剂在临床中广泛使用，具有良好的水溶性，优异的生物相容性。本发明为了提高cuet在水中的稳定性，最初尝试采用羟乙基淀粉来进行稳定，实验发现羟乙基淀粉一定程度上可以提高cuet在水中的溶解性和稳定性，可通过体内注射方式应用于癌症治疗，但将其用作静脉注射药物，未见明显肿瘤抑制效果，说明其稳定性还不能达到静脉注射的要求。为此，本发明进一步提供了一种羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒，其为羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定cuet纳米晶而形成的纳米颗粒，其中羟烷基淀粉和聚多巴胺包覆于所述cuet纳米晶表面，形成所述羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒。本发明通过在cuet纳米晶表面同时包覆羟烷基淀粉和聚多巴胺，实验发现，显著提高了cuet纳米晶在水溶液中的溶解性和稳定性，能够通过静脉注射用于癌症治疗。
51.本发明所述羟烷基淀粉为羟甲基淀粉、羟乙基淀粉、羟丙基淀粉或羟丁基淀粉，更佳为羟乙基淀粉。一些实施例中，所述羟烷基淀粉的分子量为25～480kda，所述羟烷基淀粉其羟烷基的摩尔取代度为0.4～0.6；比如当羟烷基淀粉为羟乙基淀粉时，所述羟乙基淀粉的分子量为25～480kda，所述羟乙基淀粉其羟乙基的摩尔取代度为0.4～0.6。
52.一些实施例中，所述羟烷基淀粉和cuet纳米晶的质量比为100：1～100，优选为100:5～20，所述聚多巴胺和cuet纳米晶的质量比为10：1～10，优选为10:3～5。
53.一些实施例中，本发明提供的羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的纳米颗粒的直径为40～300纳米。
54.本发明还提供了一种羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液，其包含羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒，所述纳米颗粒为羟烷基淀粉和聚多巴胺
共稳定cuet纳米晶而形成的纳米颗粒，其中羟烷基淀粉和聚多巴胺包覆于所述cuet纳米晶表面使得所述cuet纳米晶稳定分散于水中形成该分散液。
55.一些实施例中，所述羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒在该分散液中的浓度为0.1～100mg/ml，优选为1～10mg/ml。
56.本发明中采用羟烷基淀粉和聚多巴胺作为稳定剂，包覆cuet纳米晶体，可能借助于羟烷基淀粉、聚多巴胺与cuet存在弱的结合作用，阻止cuet纳米晶体聚集沉淀，从而提高了cuet纳米晶体的在水溶液中的溶解性和稳定性。
57.本发明还提供了所述的纳米颗粒分散液的制备方法，包括如下步骤：
58.(1)将cu(ⅱ)离子盐溶液与ddtc盐溶液在羟烷基淀粉水溶液中混合使其发生反应，得到羟烷基淀粉稳定的cuet纳米颗粒分散液；
59.(2)将步骤(1)所述羟烷基淀粉稳定的cuet纳米颗粒分散液与多巴胺在碱性条件下混合，使多巴胺发生聚合反应，纯化后得到所述羟烷基淀粉与聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液。
60.一些实施例中，步骤(1)中，所述羟烷基淀粉水溶液的浓度为0.1～100mg/ml；所述cu(ⅱ)离子盐溶液中铜(ⅱ)离子的浓度为0.000177～17.7mg/ml；所述ddtc离子与所述cu(ⅱ)离子的投料摩尔比为1.8～2.2：1，更佳为2:1；所述cu(ⅱ)离子盐为硝酸铜、硫酸铜或氯化铜；所述ddtc盐溶液为ddtc钠盐水溶液或ddtc钾盐水溶液；将所述cu(ⅱ)离子盐溶液与ddtc盐溶液通过滴加方式加入至所述羟烷基淀粉水溶液中，在滴加同时进行搅拌，得到羟烷基淀粉稳定的cuet纳米颗粒分散液。所述搅拌包括但不限于为磁力搅拌、机械搅拌、旋涡震荡或超声震荡。
61.一些实施例中，将所述cu(ⅱ)离子盐溶液与ddtc盐溶液通过滴加方式加入至所述羟烷基淀粉水溶液中，其滴加速度为0.01～10ml/s。搅拌方式为磁力搅拌、机械搅拌、旋涡震荡时，其搅拌速度为10～3000rpm/min。搅拌方式为超声振荡时，超声功率为10～200w。
62.一些实施例中，步骤(2)中，所述多巴胺与步骤(1)所述cu(ⅱ)离子的摩尔比为10：0.427～4.27；步骤(2)所述羟烷基淀粉稳定的cuet纳米颗粒分散液与多巴胺混合后，另外还引入氨水或氢氧化钠，以获得所述碱性环境，ph范围为9～11。步骤(2)所述纯化为超滤或透析。
63.为了进一步提高羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒在血液中的稳定性，本发明对该纳米颗粒中聚多巴胺表面修饰巯基化的羟烷基淀粉，使得聚多巴胺与巯基发生反应形成c-s共价键，进一步提高纳米药物在血液中的稳定性，而提供了一种羟烷基淀粉和改性聚多巴胺共稳定的cuet纳米药物。一些实施例中，将所述羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液与巯基化的羟烷基淀粉混合后反应，使其中聚多巴胺的表面修饰巯基化的羟烷基淀粉，即得到羟烷基淀粉和改性聚多巴胺共稳定的cuet纳米药物。一些实施例中，所述巯基化的羟烷基淀粉与所述cuet中cu(ⅱ)离子的质量比为100：0.00177～17.7。
64.一些实施例中，巯基化的羟烷基淀粉可由3个步骤制备得到：步骤s1、将羟乙基淀粉与丁二酸酐反应得到羧基化的羟乙基淀粉；s2、将羧基化的羟乙基淀粉与2-(吡啶二硫)-乙胺盐酸盐反应得到羟乙基淀粉-2-(吡啶二硫)；s3、羟乙基淀粉-2-(吡啶二硫)巯基化得到巯基化的羟烷基淀粉。
65.更进一步地，为了提高cuet纳米药物的靶向性，本发明还提供了一种靶向递送cuet的纳米药物，其为在本发明所述的羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒中的聚多巴胺的表面修饰一层偶联靶向肿瘤的分子的巯基化的羟烷基淀粉后得到的纳米药物。所述靶向肿瘤的分子包括但不限于为叶酸、乳糖酸或irgd肽。
66.以靶向肿瘤的分子为叶酸为例，偶联叶酸的巯基化的羟烷基淀粉可由4个步骤制备得到：步骤s1、将羟乙基淀粉与叶酸通过酯键偶联；步骤s2、将偶联叶酸的羟乙基淀粉与丁二酸酐反应得到偶联叶酸的羧基化的羟乙基淀粉；s3、将偶联叶酸的羧基化的羟乙基淀粉与2-(吡啶二硫)-乙胺盐酸盐反应得到偶联叶酸的羟乙基淀粉-2-(吡啶二硫)；s4、偶联叶酸的羟乙基淀粉-2-(吡啶二硫)巯基化得到偶联叶酸的巯基化的羟烷基淀粉，其反应路线如图1所示。
67.一些实施例中，该纳米药物其制备方法包括如下步骤：将所述羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液与偶联靶向肿瘤的分子的巯基化的羟烷基淀粉混合后反应，使其中聚多巴胺的表面修饰一层偶联靶向肿瘤的分子的巯基化的羟烷基淀粉，即得到所述纳米药物。
68.一些实施例中，所述偶联叶酸的巯基化的羟烷基淀粉与所述cuet中cu(ⅱ)离子的质量比为100：0.00177～17.7。混合后反应其反应时间为4～48h。
69.本发明所述的羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒、羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液、羟烷基淀粉和改性聚多巴胺共稳定的cuet纳米药物和/或所述靶向递送cuet的纳米药物可用于制备治疗和/或预防肿瘤的药物。
70.高压氧在临床中广泛被用作一氧化碳中毒后的治疗，本发明研究发现，高压氧也有助于促进抗肿瘤纳米药物发挥抗肿瘤效果。本发明将羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒、羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液、羟烷基淀粉和改性聚多巴胺共稳定的cuet纳米药物和/或所述靶向递送cuet的纳米药物联合高压氧用于小鼠抗肿瘤治疗，取得了很好的抗肿瘤效果。
71.以下为实施例：
72.实施例1
73.本实施例提供了一种靶向递送cuet的纳米药物，羟乙基淀粉选取200/0.5规格，以cucl2和ddtc钠盐水溶液作为反应离子溶液，进行如下制备步骤：
74.(1)将羟乙基淀粉10mg溶解于1ml水中，再加入1ml浓度为0.374mg/ml的cucl2水溶液，在25℃下混匀，得到混合溶液a；其中羟乙基淀粉分子量为200kda，羟乙基取代度为0.5；
75.(2)向获得的混合溶液a中边混匀边逐滴加入1ml浓度为0.954mg/ml的ddtc钠盐水溶液，其中滴加时间为60s，其中混匀方式为磁力搅拌1000rpm/min，混匀温度为25℃。滴加完成后，获得混合溶液b。所述混合溶液b即为羟乙基淀粉稳定的cuet纳米颗粒溶液。
76.(3)向获得的混合溶液b中加入1ml浓度为2.5mg/ml的多巴胺水溶液，再加入1ml氨水和5ml超纯水。在25℃下磁力搅拌8h，搅拌速度为1000rpm/min，得到混合溶液c。将混合溶液c置于3500da透析袋中，用超纯水透析3天，得到混合溶液d。所述混合溶液d，即为羟乙基淀粉与聚多巴胺共同稳定的cuet纳米颗粒分散液。
77.(4)向获得的混合溶液d中加入10mg偶联叶酸的巯基化的羟乙基淀粉，磁力搅拌48h，转速为1000rpm/min。即得到靶向递送cuet的纳米药物，命名为样品1。其中，偶联叶酸
的巯基化的羟乙基淀粉的合成方法，羟乙基淀粉选取200/0.5，制备过程如下：
78.s1：将羟乙基淀粉1g溶于10ml dmso中，加入0.1g叶酸，0.32g edci和0.21g dmap，在45℃下反应48h。将反应产物置于截流分子量为3500da的透析袋中，在超纯水中透析3天，将样品在-50℃下冷冻干燥96h，得到产物1。
79.s2：将1g产物1溶于10ml dmso中，加入0.14g丁二酸酐和0.2g dmap，在45℃下反应24h。将反应产物置于截流分子量为3500da的透析袋中，在超纯水中透析3天，将样品在-50℃下冷冻干燥96h，得到产物2。
80.s3：将1g产物2溶于30ml超纯水中，加入0.38g edci，0.12g nhs和0.22g 2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸盐，25℃反应48h，将反应产物置于截流分子量为3500da的透析袋中，在超纯水中透析3天，将样品在-50℃下冷冻干燥96h，得到产物3。
81.s4：将0.5g产物4溶解于15ml dmso中，加入0.8g二硫苏糖醇，在氮气保护下，25℃反应24h，将反应产物置于截流分子量为3500da的透析袋中，在超纯水中透析3天，将样品在-50℃下冷冻干燥96h，得到产物4。产物4即为偶联叶酸的巯基化的羟乙基淀粉。
82.对比例1
83.cuet的制备，包括如下步骤：
84.向1ml浓度为0.374mg/ml的cucl2水溶液逐滴加入1ml浓度为0.954mg/ml的ddtc钠盐水溶液，其中滴加时间为60s，其中混匀方式为磁力搅拌1000rpm/min，混匀温度为25℃。滴加完成，即可获得cuet样品。
85.图2为本对比例制备的cuet样品、实施例1步骤(2)获得的混合溶液b、实施例1步骤(3)获得的混合溶液d以及实施例1制备的样品1放置12h后的照片，可以看出，本对比例制备的cuet样品其中cuet明显团聚沉淀，而实施例1混合溶液b、混合溶液d和样品1均为稳定的分散液。
86.实施例2
87.本实施例提供了一种靶向递送cuet的纳米药物，羟乙基淀粉选取200/0.5规格，以cucl2和ddtc钠盐水溶液作为反应离子溶液，进行如下制备步骤：
88.(1)将羟乙基淀粉10mg溶解于1ml水中，再加入1ml浓度为0.374mg/ml的cucl2水溶液，在25℃下混匀，得到混合溶液a；其中羟乙基淀粉分子量为200kda，羟乙基取代度为0.5；
89.(2)向获得的混合溶液a中边混匀边逐滴加入1ml浓度为0.954mg/ml的ddtc钠盐水溶液，其中滴加时间为60s，其中混匀方式为磁力搅拌1000rpm/min，混匀温度为25℃。滴加完成，获得混合溶液b。所述混合溶液b即为羟乙基淀粉稳定的cuet纳米颗粒溶液。
90.(3)向获得的混合溶液b中加入1ml浓度为2.5mg/ml的多巴胺水溶液，再加入1ml氨水和5ml超纯水。在25℃下磁力搅拌8h，搅拌速度为1000rpm/min，得到混合溶液c。将混合溶液c置于3500da透析袋中，用超纯水透析3天，得到混合溶液d。所述混合溶液d，即为羟乙基淀粉与聚多巴胺共同稳定的cuet纳米颗粒分散液。
91.(4)向获得的混合溶液d中加入10mg偶联叶酸的巯基化的羟乙基淀粉(制备步骤同实施例1)，磁力搅拌48h，转速为1000rpm/min。即得到靶向递送cuet的纳米药物，命名为样品2。
92.实施例3
93.本实施例提供了一种靶向递送cuet的纳米药物，羟乙基淀粉选取130/0.4规格，以
cucl2和ddtc钠盐水溶液作为反应离子溶液，进行如下制备步骤：
94.(1)将羟乙基淀粉10mg溶解于1ml水中，再加入1ml浓度为0.374mg/ml的cucl2水溶液，在60℃下混匀，得到混合溶液a；其中羟乙基淀粉分子量为130kda，羟乙基取代度为0.4；
95.(2)向获得的混合溶液a中边混匀边逐滴加入1ml浓度为0.954mg/ml的ddtc钠盐水溶液，其中滴加时间为60s，其中混匀方式为磁力搅拌1000rpm/min，混匀温度为60℃。滴加完成，获得混合溶液b。所述混合溶液b即为羟乙基淀粉稳定的cuet纳米颗粒溶液。
96.(3)向获得的混合溶液b中加入1ml浓度为2.5mg/ml的多巴胺水溶液，再加入1ml氨水和5ml超纯水。在25℃下磁力搅拌8h，搅拌速度为1000rpm/min，得到混合溶液c。将混合溶液c置于3500da透析袋中，用超纯水透析3天，得到混合溶液d。所述混合溶液d，即为羟乙基淀粉与聚多巴胺共同稳定的cuet纳米颗粒分散液。
97.(4)向获得的混合溶液d中加入10mg偶联叶酸的巯基化的羟乙基淀粉(制备步骤同实施例1)，磁力搅拌48h，转速为1000rpm/min。即得到靶向递送cuet的纳米药物，命名为样品3。
98.实施例4
99.本实施例提供了一种靶向递送cuet的纳米药物，羟乙基淀粉选取480/0.5规格，以cucl2和ddtc钠盐水溶液作为反应离子溶液，进行如下制备步骤：
100.(1)将羟乙基淀粉10mg溶解于1ml水中，再加入1ml浓度为0.374mg/ml的cucl2水溶液，在25℃下混匀，得到混合溶液a；其中羟乙基淀粉分子量为480kda，羟乙基取代度为0.5；
101.(2)向获得的混合溶液a中边混匀边逐滴加入1ml浓度为0.954mg/ml的ddtc钠盐水溶液，其中滴加时间为60s，其中混匀方式为磁力搅拌1000rpm/min，混匀温度为25℃。滴加完成，获得混合溶液b。所述混合溶液b即为羟乙基淀粉稳定的cuet纳米颗粒溶液。
102.(3)向获得的混合溶液b中加入1ml浓度为2.5mg/ml的多巴胺水溶液，再加入1ml氨水和5ml超纯水。在25℃下磁力搅拌8h，搅拌速度为1000rpm/min，得到混合溶液c。将混合溶液c置于3500da透析袋中，用超纯水透析3天，得到混合溶液d。所述混合溶液d，即为羟乙基淀粉与聚多巴胺共同稳定的cuet纳米颗粒分散液。
103.(4)向获得的混合溶液d中加入10mg偶联叶酸的巯基化的羟乙基淀粉(制备步骤同实施例1)，磁力搅拌48h，转速为1000rpm/min。即得到靶向递送cuet的纳米药物，命名为样品4。
104.实施例5
105.本实施例提供了一种靶向递送cuet的纳米药物，羟乙基淀粉选取200/0.5规格，以cucl2和ddtc钠盐水溶液作为反应离子溶液，进行如下制备步骤：
106.(1)将羟乙基淀粉10mg溶解于1ml水中，再加入1ml浓度为0.374mg/ml的cucl2水溶液，在25℃下混匀，得到混合溶液a；其中羟乙基淀粉分子量为200kda，羟乙基取代度为0.5；
107.(2)向获得的混合溶液a中边混匀边逐滴加入1ml浓度为0.954mg/ml的ddtc钠盐水溶液，其中滴加时间为60s，其中混匀方式为磁力搅拌1000rpm/min，混匀温度为25℃。滴加完成，获得混合溶液b。所述混合溶液b即为羟乙基淀粉稳定的cuet纳米颗粒溶液。
108.(3)向获得的混合溶液b中加入1ml浓度为2.5mg/ml的多巴胺水溶液，再加入1ml氨水和5ml超纯水。在25℃下磁力搅拌8h，搅拌速度为1000rpm/min，得到混合溶液c。将混合溶液c置于3500da透析袋中，用超纯水透析3天，得到混合溶液d。所述混合溶液d，即为羟乙基
淀粉与聚多巴胺共同稳定的cuet纳米颗粒分散液。
109.(4)向获得的混合溶液d中加入10mg巯基化的羟乙基淀粉，磁力搅拌48h，转速为1000rpm/min。即得到羟烷基淀粉和改性聚多巴胺共稳定的cuet纳米药物，命名为样品5，其中巯基化的羟乙基淀粉其制备步骤如下：
110.s1：将1g羟乙基淀粉(羟乙基淀粉选取200/0.5，)溶于10ml dmso中，加入0.14g丁二酸酐和0.2g dmap，在45℃下反应24h。将反应产物置于截流分子量为3500da的透析袋中，在超纯水中透析3天，将样品在-50℃下冷冻干燥96h，得到产物1。
111.s2：将1g产物1溶于30ml超纯水中，加入0.38g edci，0.12g nhs和0.22g 2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸盐，25℃反应48h，将反应产物置于截流分子量为3500da的透析袋中，在超纯水中透析3天，将样品在-50℃下冷冻干燥96h，得到产物2。
112.s3：将0.5g产物2溶解于15ml dmso中，加入0.8g二硫苏糖醇，在氮气保护下，25℃反应24h，将反应产物置于截流分子量为3500da的透析袋中，在超纯水中透析3天，将样品在-50℃下冷冻干燥96h，得到产物3。产物3即为巯基化的羟乙基淀粉。
113.实验例1
114.靶向递送cuet的纳米药物的形态学测定：取实施例1～5中制备的样品1～5溶液，在动态光散射仪上测定纳米颗粒的粒径大小及其分布。将实施例2中制备的样品2，滴加到铜网碳膜上，干燥之后在tem和ftem上观察其形貌及其元素分布。图3中结果显示在实施例1～5中制备的样品1～5的粒径分布均较为均一，分布范围在40～200纳米范围内。其中实施例1和实施例5溶液d，为羟乙基淀粉与聚多巴胺共同稳定的cuet纳米颗粒分散液，其经过实施例5步骤(4)巯基化的羟乙基淀粉修饰后，纳米颗粒直径从74纳米增加到样品5中的107纳米；其经过实施例1步骤(4)偶联叶酸的巯基化的羟乙基淀粉修饰后，纳米颗粒直径从74纳米增加到样品2中的102纳米。图4中样品2的tem结果表明，制备得到的靶向递送cuet的纳米药物为羟乙基淀粉和聚多巴胺包裹cuet纳米结晶表面修饰有偶联叶酸的巯基化的羟乙基淀粉形成的纳米颗粒，图5中纳米颗粒的ftem的元素分布也证实了这一结论。
115.实验例2
116.将实施例2中制备得到的混合溶液b，混合溶液d和样品2溶液分别与50％fbs(胎牛血清)混合，分别在第0、1、2、3、4、5、6、7天，在动态光散射仪上测定混合溶液中纳米颗粒的粒径大小及其分布。图6结果表明，混合溶液d(羟乙基淀粉与聚多巴胺共同稳定的cuet纳米颗粒分散液)和样品2溶液中的纳米颗粒均较为稳定，而混合溶液b(羟乙基淀粉稳定的cuet纳米颗粒溶液)中的纳米颗粒由于吸附了fbs中的蛋白质，而导致了纳米颗粒粒径变大，进而导致了聚集。
117.实验例3
118.纳米颗粒的波谱表征：将实施例2中制备得到的样品2溶液，冷冻干燥后，得到靶向递送cuet的纳米药物的固体。对该固体样品进行xrd，以确证其结构。图7的xrd结果表明，在样品2的xrd结果中，其10.15
°
，11.79
°
，12.35
°
，14.44
°
，21.3
°
，24.14
°
处出现的峰与cuet和标准卡片的结果一致，这表明cuet是以纳米结晶的形式存在于纳米颗粒中的。将样品溶液2通过紫外吸收波谱测定，图8的uv结果显示样品2在450nm波长处出现了吸收峰，这进一步确证了在纳米颗粒中cuet的存在。比较cuet@hes和cuet@pda/hes的uv结果表明，300-400nm处的波长有明显的吸收增强，这表明pda成功聚合进入cuet纳米颗粒中。比较cuet@pda/hes与
样品2的uv吸收谱，在280nm处的紫外吸收峰有显著增强，这表明偶联叶酸的巯基化的羟乙基淀粉成功修饰到纳米颗粒的表面。
119.实验例4
120.细胞毒性实验：将乳腺癌4t1细胞接种到96孔板中，接种密度为5000个细胞/孔，培养基体积为0.1ml，置于细胞培养箱中(37℃，5％ co2)孵育过夜。移除培养基，加入含有不同浓度药物的培养基，0.2ml，孵育24h。用cck8法测定细胞活力。图9结果表明实施例2中制备得到的样品2具有最低的ic50值，为53.50ng/ml。
121.实验例5
122.干细胞杀伤实验：4t1干细胞接种到96孔低粘附板中，接种密度为5000个细胞/孔，培养基体积为0.1ml，置于细胞培养箱中(37℃，5％ co2)孵育过夜。加入含有不同浓度药物的培养基，0.1ml，孵育24h。用cck8法测定细胞活力。图10结果表明实施例2中制备得到的样品2具有最低的ic50值，为64.08ng/ml。
123.实验例6
124.动物药效实验：在雌性balb/c小鼠背部右后侧皮下接种小鼠乳腺癌4t1细胞悬液，4
×
105个细胞/0.1ml，建立小鼠乳腺癌4t1皮下移植瘤小鼠模型。当皮下瘤体积为50～120mm3时，将小鼠随机分成4组，每组8只，分别经尾静脉注射生理盐水、双硫仑+cucl2、cuet和样品2，其中cuet的剂量为4mg/kg，记第一天给药时间为第1天，再在第3，5，7，9，11天时按上述剂量尾静脉给药5次。自1天起，每隔一天用游标卡尺测量小鼠皮下瘤的长边a和短边b，肿瘤体积计算公式为：v＝a
×b×
b/2。绘制瘤体积-时间曲线。
125.图11中cuet@hes为实施例2混合溶液b，即羟乙基淀粉稳定的cuet纳米颗粒溶液；cuet为对比例1制备的cuet样品；dsf+cucl2组为双硫仑dsf与cucl2摩尔浓度1:1的混合溶液，二者均为市场采购，摩尔浓度与cuet的浓度一致；溶液d组为实施例2混合溶液d羟乙基淀粉与聚多巴胺共同稳定的cuet纳米颗粒分散液。从第15天抑瘤效果来看，cuet@hes组、cuet组和dsf+cucl2组抑瘤效果不佳，与生理盐水组相比并没有表现出抑瘤效果；溶液d组与生理盐水组相比，抑瘤效果有一定的提升；而实施例5得到的样品5即羟乙基淀粉与改性聚多巴胺共同稳定的cuet纳米药物已表现出明显的抑瘤效果，说明对聚多巴胺采用巯基化的羟乙基淀粉进行改性，进一步提高了cuet纳米药物在血液中的稳定性；实施例2得到的样品2(进一步修饰偶联叶酸的巯基化的羟基乙淀粉后的靶向递送的cuet纳米药物)由于叶酸的靶向作用具有最佳的肿瘤抑制效果。
126.实验例7
127.动物药效实验：在雄性c57小鼠胰腺部位接种小鼠胰腺癌panc02细胞悬液，1
×
106个细胞/0.05ml，建立小鼠胰腺癌模型。小鼠造模10天后，将小鼠随机分成3组，每组8只，分别经尾静脉注射生理盐水、双硫仑+cucl2和样品5，其中cuet的剂量为4mg/kg，记第一天给药时间为第1天，再在第3，5，7，9，11天时按上述剂量尾静脉给药5次。在第23天将小鼠处死，剥离胰腺癌肿瘤，进行称重，图12结果表明与对照组相比，实施例5中制备的样品5具有最佳的肿瘤抑制效果。
128.实验例8
129.动物药效实验：在雄性c57小鼠胰腺部位接种小鼠胰腺癌panc02细胞悬液，1
×
106个细胞/0.05ml，建立小鼠胰腺癌模型。小鼠造模7天后，将小鼠随机分成6组，每组8只，其中
高压氧组在小鼠造模第7天，第8天，第9天分别进行一次高压氧处理，高压氧条件为2.5个大气压90min。在小鼠造模第10天分别经尾静脉注射生理盐水、双硫仑+cucl2和样品5，其中cuet的剂量为4mg/kg，其中高压氧组在给药后立马对小鼠进行高压氧处理。记第一天给药时间为第1天，再在第3，5，7，9，11天时按上述剂量尾静脉给药5次。在第23天将小鼠处死，剥离胰腺癌肿瘤，进行拍照，图13结果表明，相较于其他对照组，实施例5中制备的样品5具有较好的肿瘤抑制效果，联合高压氧治疗后效果更佳。
130.本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒，其特征在于，其为羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定cuet纳米晶而形成的纳米颗粒，其中羟烷基淀粉和聚多巴胺包覆于所述cuet纳米晶表面，形成所述羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒。2.如权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述羟烷基淀粉为羟甲基淀粉、羟乙基淀粉、羟丙基淀粉或羟丁基淀粉，优选为羟乙基淀粉。3.如权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述羟烷基淀粉和cuet纳米晶的质量比为100：1～100，所述聚多巴胺和cuet纳米晶的质量比为10：1～10；所述纳米颗粒的直径为40～300纳米。4.一种羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液，其特征在于，其包含如权利要求1至3任一项所述的羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒，所述纳米颗粒为羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定cuet纳米晶而形成的纳米颗粒，其中羟烷基淀粉和聚多巴胺包覆于所述cuet纳米晶表面使得所述cuet纳米晶稳定分散于水中形成所述羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液。5.如权利要求4所述的纳米颗粒分散液，其特征在于，所述羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒在该分散液中的浓度为0.1～100mg/ml。6.如权利要求4或5所述的纳米颗粒分散液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将cu(ⅱ)离子盐溶液与ddtc盐溶液在羟烷基淀粉水溶液中混合使其发生反应，得到羟烷基淀粉稳定的cuet纳米颗粒分散液；(2)将步骤(1)所述羟烷基淀粉稳定的cuet纳米颗粒分散液与多巴胺在碱性条件下混合，使多巴胺发生聚合反应，纯化后得到所述羟烷基淀粉与聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述羟烷基淀粉水溶液的浓度为0.1～100mg/ml；所述cu(ⅱ)离子盐溶液中铜(ⅱ)离子的浓度为0.000177～17.7mg/ml；所述cu(ⅱ)离子盐为硝酸铜、硫酸铜或氯化铜；所述ddtc盐溶液为ddtc钠盐水溶液或ddtc钾盐水溶液；将所述cu(ⅱ)离子盐溶液与ddtc盐溶液通过滴加方式加入至所述羟烷基淀粉水溶液中，在滴加同时进行搅拌，得到羟烷基淀粉稳定的cuet纳米颗粒分散液；步骤(2)中，所述多巴胺与步骤(1)所述cu(ⅱ)离子的摩尔比为10：0.427～4.27。8.一种羟烷基淀粉和改性聚多巴胺共稳定的cuet纳米药物，其特征在于，其为在如权利要求4或5所述的羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液中的聚多巴胺表面修饰巯基化的羟烷基淀粉后得到的纳米药物。9.如权利要求8所述的纳米药物，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：将所述羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液与巯基化的羟烷基淀粉混合后反应，使其中聚多巴胺的表面修饰巯基化的羟烷基淀粉，即得到所述纳米药物。10.一种靶向递送cuet的纳米药物，其特征在于，其为在如权利要求4或5所述的羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液中的聚多巴胺表面修饰偶联靶向肿瘤的分子的巯基化的羟烷基淀粉后得到的纳米药物。11.如权利要求10所述的纳米药物，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：将所述羟
烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液与偶联靶向肿瘤的分子的巯基化的羟烷基淀粉混合后反应，使其中聚多巴胺的表面修饰偶联靶向肿瘤的分子的巯基化的羟烷基淀粉，即得到所述纳米药物。12.如权利要求1至3任一项所述的羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒、如权利要求4或5所述的羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液、如权利要求9或10所述的羟烷基淀粉和改性聚多巴胺共稳定的cuet纳米药物和/或权利要求9至11任一项所述的靶向递送cuet的纳米药物在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，将如权利要求1至4任一项所述的羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒、如权利要求5或6所述的羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的cuet纳米颗粒分散液、如权利要求8或9所述的羟烷基淀粉和改性聚多巴胺共稳定的cuet纳米药物和/或权利要求10或11所述的靶向递送cuet的纳米药物在高压氧环境中使用。

技术总结
本发明属于纳米材料技术领域，更具体地，涉及羟烷基淀粉和聚多巴胺共稳定的CuET纳米颗粒、靶向递送CuET的纳米药物及其制备和应用。由羟乙基淀粉与聚多巴胺共同稳定CuET纳米结晶而组成纳米颗粒，在该纳米颗粒外层还包裹了一层偶联叶酸的巯基化的羟乙基淀粉，提供靶向效果和稳定效果。本发明所制备的靶向递送CuET的纳米药物可以提高CuET的水溶性，延长CuET在血液中的循环时间，提高CuET在肿瘤部位的富集，增强CuET对肿瘤细胞和肿瘤干细胞的抑制作用，增强CuET在体内的抗肿瘤效果。并且结合高压氧治疗，可以进一步提高靶向递送CuET的纳米药物的抗肿瘤效果。纳米药物的抗肿瘤效果。纳米药物的抗肿瘤效果。


技术研发人员：李子福 肖晨 李佳原 王幸 杨祥良
受保护的技术使用者：华中科技大学
技术研发日：2023.03.06
技术公布日：2023/7/12