一种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法与流程

1.本发明涉及材料技术领域，尤其涉及一种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法。


背景技术：

2.周围神经损害是临床常见的损伤，在其修复技术中组织工程作为一种新兴的交叉学科受到越来越多的关注，支架材料是组织工程的基本要素之一，其选择逐步成为组织工程研究中的重点，作为细胞外基质的代替物，支架材料应具备可降解性、良好的生物相容性、一定的力学强度和多孔结构。
3.蚕丝是一种天然高分子蛋白质聚合物，在蚕的上皮细胞的特殊腺体中合成，分泌到腔内，最后纺成纤维，纺纤是由两种蛋白质组成，丝素蛋白的中心蛋白，被丝胶蛋白的蛋白质包裹着，丝素蛋白(sf)纤维直径约10-25um，由轻链和重链两个蛋白质链以1:1比例和一个二硫键连接，由于其良好的生物相容性和可控的降解速率，sf在生物医学应用领域的研究越来越多，sf可以被制作成不同的支架形式(膜，纤维、网格等)。
4.但现有技术中，通常是采用生物相容性材料制备单一界面神经支架，比如采用丝素蛋白纤维制备单一界面神经支架，继而在单一界面神经支架的修复过程中，其稳定性较差，容易出现塌陷的情况，继而导致其促进周围神经再生的效果较低，因此本发明提出一种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法以解决现有技术中存在的问题。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明的目的在于提出一种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法，该种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法具有稳定性高的优点，解决现有技术中的问题。
6.为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：一种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法，包括以下步骤：
7.步骤一、蚕丝处理
8.收集新鲜家蚕生丝，并定量称取新鲜家蚕生丝，将其放置于加热容器内，利用蒸馏水煮沸处理20min，之后再放置于具有碳酸钠溶液的加热容器内，煮沸处理30min，重复多次后，再用去离子水洗涤，洗涤后自然晾干，得到脱胶蚕丝；
9.步骤二、丝素蛋白膜制备
10.将步骤一中得到的脱胶蚕丝与溶剂混合，在65-75℃的恒温浴中搅拌溶解，在完全溶解后加入丝素蛋白，继续搅拌，直至丝素蛋白完全溶解，再采用纯水透析，透析时间为3-4d，透析后再经过滤纸过滤，得到丝素溶液，之后将收集的丝素溶液平铺在含有硅胶材料的平皿中，并在室温下，利用超净台晾干，得到再生丝素蛋白膜；
11.步骤三、支架内芯制备
12.将步骤二中得到的再生丝素蛋白膜，利用98％的甲酸溶液进行搅拌溶解，之后在
正负高压条件下进行静电纺丝，并在纺丝完毕后，截取矩形静电纺丝膜，并用圆棒或者导管将其卷入，形成神经再生修复支架的内芯；
13.步骤四、支架外层生物墨水制备
14.选择生物响应性可降解材料为神经再生修复支架外层原料，利用等离子清洗机对原料进行处理，之后，将处理后的原料加入溶剂，进行搅拌溶解，搅拌溶解后得到的液体作为3d打印生物墨水；
15.步骤五、3d打印成型
16.将步骤四中制备的3d打印生物墨水注入3d打印机的注射器中，并利用接收棒安装步骤三中所制备的神经再生修复支架的内芯，之后通过3d打印机进行打印，将溶解后的生物响应性可降解材料打印至神经再生修复支架的内芯的外层，由此形成一种基于丝素蛋白纤维的复合神经再生修复支架。
17.进一步改进在于：所述步骤一中，碳酸钠溶液浓度为0.05g/l。
18.进一步改进在于：所述步骤一中，洗涤后将蚕丝置于超净台内进行自然晾干。
19.进一步改进在于：所述步骤二中溶剂为无水氯化钙、三蒸水以及无水乙醇的混合溶剂。
20.进一步改进在于：所述步骤二中，在透析的过程中，每隔30min换一次水。
21.进一步改进在于：所述步骤三中，在充分搅拌溶解后，需静置一定的时间，用于去除气泡。
22.进一步改进在于：所述步骤四中，生物响应性可降解材料为聚己内酯。
23.进一步改进在于：所述步骤四中，溶剂为二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺中的一种。
24.进一步改进在于：所述步骤五中，接收棒自身是安装在3d打印机上，且接收棒转速为200rpm，所述接收棒横向移动速度为0.3mm/sec。
25.本发明的有益效果为：该种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法通过基于丝素蛋白纤维，并结合生物响应性可降解材料，采用静电纺丝技术及3d打印技术，采取“壳-芯”的结构制备神经再生修复支架，利用生物响应性可降解材料制备相对坚硬的疏水界面外层，构建再生空间以满足长期神经再生中对结构完整性的机械需求，防止成纤维细胞附着或渗透，再采用天然高分子材料丝素蛋白纤维，其具有良好的生物相容性和可控的降解速率，有效的提升了神经再生修复支架的稳定性，且由于采用的均为可降解的材料，继而不会残留在患者体内，避免因残留物导致患者炎症的产生，同时利用等离子清洗机对原料进行处理，改善原料的表面性能，使其具有良好的表面活性，有利于细胞的结合，创造良好的微环境，促进组织细胞的再生，提升促进周围神经再生的效果。
附图说明
26.图1是本发明的步骤流程示意图。
具体实施方式
27.为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
28.实施例一
29.根据图1所示，本实施例提出了一种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法，包括以下步骤：
30.步骤一、蚕丝处理
31.收集新鲜家蚕生丝，并定量称取新鲜家蚕生丝，将其放置于加热容器内，利用蒸馏水煮沸处理20min，之后再放置于具有碳酸钠溶液的加热容器内，碳酸钠溶液浓度为0.05g/l，煮沸处理30min，重复多次后，再用去离子水洗涤，洗涤后将蚕丝置于超净台内进行自然晾干，得到脱胶蚕丝；
32.步骤二、丝素蛋白膜制备
33.将步骤一中得到的脱胶蚕丝与溶剂混合，该溶剂为无水氯化钙、三蒸水以及无水乙醇的混合溶剂，在65-75℃的恒温浴中搅拌溶解，在完全溶解后加入丝素蛋白，继续搅拌，直至丝素蛋白完全溶解，再采用纯水透析，在透析的过程中，每隔30min换一次水，透析时间为3-4d，透析后再经过滤纸过滤，得到丝素溶液，之后将收集的丝素溶液平铺在含有硅胶材料的平皿中，并在室温下，利用超净台晾干，得到再生丝素蛋白膜；
34.步骤三、支架内芯制备
35.将步骤二中得到的再生丝素蛋白膜，利用98％的甲酸溶液进行搅拌溶解，在充分搅拌溶解后，需静置一定的时间，用于去除气泡，之后在正负高压条件下进行静电纺丝，并在纺丝完毕后，截取矩形静电纺丝膜，并用圆棒或者导管将其卷入，形成神经再生修复支架的内芯；
36.步骤四、支架外层生物墨水制备
37.选择生物响应性可降解材料为神经再生修复支架外层原料，该生物响应性可降解材料为聚己内酯，利用等离子清洗机对原料进行处理，之后，将处理后的原料加入溶剂，该溶剂为二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺中的一种，进行搅拌溶解，搅拌溶解后得到的液体作为3d打印生物墨水；
38.步骤五、3d打印成型
39.将步骤四中制备的3d打印生物墨水注入3d打印机的注射器中，并利用接收棒安装步骤三中所制备的神经再生修复支架的内芯，之后通过3d打印机进行打印，将溶解后的生物响应性可降解材料打印至神经再生修复支架的内芯的外层，由此形成一种基于丝素蛋白纤维的复合神经再生修复支架，步骤五中，接收棒自身是安装在3d打印机上，且接收棒转速为200rpm，接收棒横向移动速度为0.3mm/sec。
40.实施例二
41.本实施例提出了一种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法，包括以下步骤：
42.步骤一：收集新鲜家蚕生丝，并根据单次处理的重量称取新型家蚕生丝，之后对其进行脱胶精炼作业，具体的先将称取的新型家蚕生丝放置于加热容器内，该加热容器内预先放入有蒸馏水，并且蒸馏水处于煮沸的状态，继而利用蒸馏水煮沸处理20min作为第一道煮沸手续，接着再放置具有碳酸钠溶液的加热容器内，其中碳酸钠溶液浓度为0.05g/l，该过程中，碳酸钠溶液与家蚕生丝是一起被加热的，由此，利用碳酸钠溶液对家蚕生丝进行第二道煮沸手续，煮沸处理30min，并重复多次，在本实施例中，重复三次，之后，利用去离子水洗涤，该洗涤次数最少为两次，在洗涤后，将蚕丝置于超净台内进行自然晾干，超净台是一
种供单人操作的通用型局部净化设备，气流形式为垂直层流与水平层流，它可造就局部高清洁度空气环境，避免蚕丝附着其他异物，得到脱胶蚕丝，在本实施例中，通过采用蒸馏水煮沸处理、多次碳酸钠溶液煮沸处理以及用去离子水洗涤的方式，确保处理后的蚕丝表面没有残留的碱性物质以及蚕丝表面的丝胶蛋白；
43.步骤二：在步骤一得到的脱胶蚕丝的基础上，进行称量，即在制备的过程中，需要根据相应的需求，分多个批次进行制备，继而将脱胶蚕丝与溶剂混合，该溶剂为无水氯化钙、三蒸水以及无水乙醇的混合溶剂，混合后，盖上保鲜膜，防止乙醇蒸发，之后在65-75℃的恒温浴中搅拌溶解，在本实施例中，采用的是75℃的恒温环境下，时间为1-1.5h，在完全溶解后加入丝素蛋白，继续搅拌，直至丝素蛋白完全溶解，之后在室温下，将溶解后的溶液置纤维素管中，利用纯水透析，在透析的过程中，每隔30min换一次水，透析时间为3-4d，在本实施例中为3d，透析后再将溶液经过滤纸过滤，得到丝素溶液，再将利用冰箱进行保存，保存温度为4℃；
44.步骤三：在本实施例中，采用静电纺丝的方法制备神经再生修复支架的内芯，具体的将步骤二中得到的再生丝素蛋白膜以一定的质量分数，通过98％的甲酸溶液进行搅拌溶解，同时在充分搅拌溶解后，需静置一定的时间，用于去除气泡，之后在正负高压条件下进行静电纺丝，在本实施例中，正负高压条件为正高压12kv，负高压-4kv条件下进行静电纺丝，截取矩形静电纺丝膜，该矩形静电纺丝膜的大小根据需求进行调整，之后用圆棒或者不锈钢导管将其卷入，圆棒和不锈钢导管自身均具有圆柱体的特性，继而形成神经再生修复支架的内芯；
45.步骤四：选择生物响应性可降解材料为神经再生修复支架外层原料，该原料为聚己内酯，由于聚己内酯的疏水性和较低的表面活性同时也限制了细胞的粘附、生长和增殖，而细胞粘附和增殖的不足会导致与植入物结合不佳，可能引发感染，炎症，严重时甚至会致使植入物完全失效，继而采用等离子清洗机对原料进行处理，等离子清洗机采用低温等离子体表面改性技术主要是为了改善聚己内酯的表面性能，尤其是细胞的亲和性；
46.步骤五：将步骤四中制备的3d打印生物墨水注入3d打印机的注射器中，并利用接收棒安装步骤三中所制备的神经再生修复支架的内芯，接收棒自身为圆柱体，与卷入矩形静电纺丝膜的圆棒或者导管对应，即成型的内芯可以安装在接收棒上，并进行固定，进一步的将3d打印机注射器的针头置于接收棒上方的位置，并设定其注射泵推进速度为3ml/h，接收棒转速为200rpm，所述接收棒横向移动速度为0.3mm/sec，将溶解后的生物响应性可降解材料打印至神经再生修复支架的内芯的外层，由此形成一种基于丝素蛋白纤维的复合神经再生修复支架。
47.步骤六：将制备的神经再生修复支架，利用动物进行体内验证实验，并设立对照组，比如利用spf级雄性sprague-dawly(sd)大鼠(体重200克-250克)随机分为2组，每组5只，其中a组为本技术神经再生修复支架组，b组为自体神经移植组(标准对照组)，在同样的饲养条件以及实验条件下进行实验，继而对制备的神经再生修复支架进行功能性验证。
48.结合实施例一和实施例二，本发明主要是基于丝素蛋白纤维，并结合生物响应性可降解材料，采取“壳-芯”的结构制备神经再生修复支架，利用生物响应性可降解材料制备相对坚硬的疏水界面外层，构建再生空间以满足长期神经再生中对结构完整性的机械需求，防止成纤维细胞附着或渗透，再采用天然高分子材料丝素蛋白纤维，其具有良好的生物
相容性和可控的降解速率，有效的提升了神经再生修复支架的稳定性，且由于采用的均为可降解的材料，继而不会残留在患者体内，避免因残留物导致患者炎症的产生。
49.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：
1.一种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、蚕丝处理收集新鲜家蚕生丝，并定量称取新鲜家蚕生丝，将其放置于加热容器内，利用蒸馏水煮沸处理20min，之后再放置于具有碳酸钠溶液的加热容器内，煮沸处理30min，重复多次后，再用去离子水洗涤，洗涤后自然晾干，得到脱胶蚕丝；步骤二、丝素蛋白膜制备将步骤一中得到的脱胶蚕丝与溶剂混合，在65-75℃的恒温浴中搅拌溶解，在完全溶解后加入丝素蛋白，继续搅拌，直至丝素蛋白完全溶解，再采用纯水透析，透析时间为3-4d，透析后再经过滤纸过滤，得到丝素溶液，之后将收集的丝素溶液平铺在含有硅胶材料的平皿中，并在室温下，利用超净台晾干，得到再生丝素蛋白膜；步骤三、支架内芯制备将步骤二中得到的再生丝素蛋白膜，利用98％的甲酸溶液进行搅拌溶解，之后在正负高压条件下进行静电纺丝，并在纺丝完毕后，截取矩形静电纺丝膜，并用圆棒或者导管将其卷入，形成神经再生修复支架的内芯；步骤四、支架外层生物墨水制备选择生物响应性可降解材料为神经再生修复支架外层原料，利用等离子清洗机对原料进行处理，之后，将处理后的原料加入溶剂，进行搅拌溶解，搅拌溶解后得到的液体作为3d打印生物墨水；步骤五、3d打印成型将步骤四中制备的3d打印生物墨水注入3d打印机的注射器中，并利用接收棒安装步骤三中所制备的神经再生修复支架的内芯，之后通过3d打印机进行打印，将溶解后的生物响应性可降解材料打印至神经再生修复支架的内芯的外层，由此形成一种基于丝素蛋白纤维的复合神经再生修复支架。2.根据权利要求1所述的一种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法，其特征在于：所述步骤一中，碳酸钠溶液浓度为0.05g/l。3.根据权利要求1所述的一种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法，其特征在于：所述步骤一中，洗涤后将蚕丝置于超净台内进行自然晾干。4.根据权利要求1所述的一种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法，其特征在于：所述步骤二中溶剂为无水氯化钙、三蒸水以及无水乙醇的混合溶剂。5.根据权利要求1所述的一种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法，其特征在于：所述步骤二中，在透析的过程中，每隔30min换一次水。6.根据权利要求1所述的一种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法，其特征在于：所述步骤三中，在充分搅拌溶解后，需静置一定的时间，用于去除气泡。7.根据权利要求1所述的一种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法，其特征在于：所述步骤四中，生物响应性可降解材料为聚己内酯。8.根据权利要求1所述的一种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法，其特征在于：所述步骤四中，溶剂为二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺中的一种。9.根据权利要求1所述的一种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法，其特征在于：所述步骤五中，接收棒自身是安装在3d打印机上，且接收棒转速为200rpm，所述接
收棒横向移动速度为0.3mm/sec。

技术总结
本发明提出一种基于丝素蛋白纤维的神经再生修复支架制备方法，包括蚕丝处理、丝素蛋白膜制备、支架内芯制备、支架外层生物墨水制备以及3D打印成型五个步骤，本发明通过基于丝素蛋白纤维，并结合生物响应性可降解材料，采用静电纺丝技术及3D打印技术，采取“壳-芯”的结构制备神经再生修复支架，利用生物响应性可降解材料制备相对坚硬的疏水界面外层，构建再生空间以满足长期神经再生中对结构完整性的机械需求，防止成纤维细胞附着或渗透，再采用天然高分子材料丝素蛋白纤维，其具有良好的生物相容性和可控的降解速率，有效的提升了神经再生修复支架的稳定性，再利用等离子清洗机对原料进行处理，改善原料的表面性能，有利于细胞的结合。胞的结合。胞的结合。


技术研发人员：钱运 王旭 范存义
受保护的技术使用者：上海市第六人民医院
技术研发日：2023.04.03
技术公布日：2023/7/12