一种微流控芯片的制作方法

1.本发明涉及微流控即时检测技术领域，具体涉及一种能进行不同浓度梯度标记物检测的微流控芯片。
2.

背景技术：
用于暗场并行检测的微流控芯片
3.在医学、生物学、化学等领域，常常需要利用一份样本进行多种测试和操作，需要利用样本分配技术。微流控技术是以微流控芯片为载体，与化学、生物学等学科相互结合，在平台上小型化、集成化、自动化实现分析检测过程的技术。微流控技术为流体的自动化运输、分配提供了可能。如授权公开号为cn114471753a的中国专利公开了一种，专利中虽然设计了一种四个并行的检测区但其四个检测区检测的是同一样品，仅将样品分流并未做浓度梯度分级的设计，在非均相体系在芯片中无法做到充分混合，反应效率低；而如授权公开号为cn 113769806 a的中国专利公开了一种微流控芯片及其制备方法与结合两步微球竞争法在c-反应蛋白检测中的应用，其中磁珠与试剂的混合采用的是片外人工混合的方式，增加了人工操作，不易实现标准化。另外，在大多数专利中试剂均为片外人工配制及稀释，专利cn 113171807 a浓度梯度与细菌检测一体化的微流控芯片及其设计方法中采用了浓度芯片与细菌检测芯片一体化的设计，但是该设计采用的是电化学检测方法，并-未结合elisa反应其反应池穿行或并行连接，利用气动微阀实现反应仓之间的隔离，但是样本在持续流动的过程中可能造成不同位置反应池之间的交叉污染，不利于反应结果的准确分析。
4.或是如授权公开号为cn110075935b的发明专利公开了多指标检测微流控卡盒及应用方法，该方法基于旋转阀进行样本分配，当旋转阀转至不同档位时，使用注射泵驱动样本，可使样本进入不同反应仓，但该方法结构复杂，成本高，且受到空间限制，可实现的分配数量有限。并且，由于微流控芯片整体尺寸较小，可操作空间有限，通常两种试剂在反应仓中不能够完全混合，需要外置气泵或震动装置进行被动混合，十分不利于检测芯片的集成及应用。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种能进行浓度梯度标记物检测的微流控芯片，尤其适用于多组平行或多标记物的检测。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：该微流控芯片，包括有基片和设置在基片上的检测模块，其特征在于：所述检测模块被限定在所述基片的下层区域，而所述基片的上层区域设置有与所述检测模块相流体连通的浓度梯度分级模块，所述浓度梯度分级模块包括有至少二个供待混合的试剂进液的入口、设置在各个入口下游设置有供各个待混合的试剂混合的混合通道，所述混合通道设置有至少两级，相邻级的混合通道数量相差为至少一个，各个所述入口通过各自的开放端部与其相邻的混合通道均通过连接通道连通，所述连接连通的数量与其相邻的上游混合通道的数量相同。
7.为了使免疫反应充分进行，优选地，各个所述混合通道包括有多个转弯部，至少部分所述转弯部为折角结构和/或弧形结构。转弯部能实现对流体的流向和流速的持续改变，
特别是折角结构和/或弧形结构的设计，能够有效增强流体的混乱对流，以实现更为均匀地混合效果，进而实现高效、快速地进行试样和试剂球的混合和反应。
8.为了使免疫能发生反应，优选地，所述检测模块包括有与最下游处的混合通道一一对齐设置的反应仓，各个反应仓的上游处还开设有用于供洗涤液进液的进液口。设置有反应仓能使得免疫反应能有效进行。
9.进一步地，每个所述反应仓上还开设有用于供显色液进液的进口、供磁珠和供二抗进入的进入口。
10.进一步地，每个所述反应仓的底部设置有磁铁，该磁铁能将免疫反应产生的结合物吸附于反应仓中。一般在免疫反应中，常采用具有捕获试剂球和标记试剂球的试剂球，其中，捕获试剂球具有包被了抗体、抗原或二抗的磁珠，而标记试剂球为包被了抗体、抗原或二抗的荧光微球；试样进入混合仓使试剂球溶化，得到混合试样，混合试样进入反应仓后发生免疫反应，这时位于反应仓底部的磁铁将免疫反应产生的包被了抗体、抗原或二抗的磁珠的结合物吸附于反应仓中，反应仓中只含有被吸附的磁珠结合物。
11.为了方便对每个反应仓进行洗涤剂的清洗，优选地，每个所述反应仓上还开设有用于出液的出口。经过洗涤剂清洗后，洗涤剂可以从出口中流出。
12.为了提高混合通道的混合效果，优选地，各个所述混合通道由至少两个相互连通的子混合通道构成，各个子混合通道由呈上窄下宽的八字型的上通道和呈上宽下窄的八字型的下通道连接而成。既保证了免疫反应充分进行的时间，在流动过程可以促进试剂球与试样保持充分混匀状态，利于免疫反应充分进行的同时还能节省空间。
13.为了实现微流控芯片整体的密闭性，优选地，所述基片的检测模块和浓度梯度分级模块为凹陷结构，还包括有位于基片上的封片，所述封片将基片形成密闭的通道。
14.与现有技术相比，本发明的优点在于：1、将基片分成浓度梯度分级模块，即可自动生成标准浓度梯度的试剂品，减少人工配制及加样的操作，不但可以缩短时间还可以实现试剂配制标准化；2、浓度梯度模块的设计可以快速辅助最优反应参数的筛选，并且保证实验地统一性，减少系统误差；3、本发明将梯度浓度模块和磁珠免疫elisa检测模块有效结合，可以在获得标准梯度浓度样本的同时完成目标蛋白的浓度的定量检测。
附图说明
15.图1为本发明实施例中微流控芯片的结构示意图；
16.图2为本发明实施例中微流控芯片中基片的结构示意图。
具体实施方式
17.以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
18.如图1和2所示，为本发明的最佳实施方式。本实施例中的微流控芯片包括有基片和设置在基片上的检测模块，检测模块被限定在基片的下层区域，而基片4的上层区域设置有与检测模块相流体连通的浓度梯度分级模块，浓度梯度分级模块包括有至少二个供待混合的试剂进液的入口、设置在各个入口下游设置有供各个待混合的试剂混合的混合通道，混合通道设置有至少两级，相邻级的混合通道数量相差为至少一个，各个入口通过各自的开放端部与其相邻的混合通道均通过连接通道连通，连接连通的数量与其相邻的上游混合
通道的数量相同。
19.本实施例中，供待混合的试剂进液的入口有两个，即第一入口1和第二入口2，混合通道设置有两级，第一级的混合通道3具有平行设置的三个，而第二级的混合通道3则具有平行设置的四个；为了使免疫反应充分进行，各个混合通道3包括有多个转弯部，至少部分转弯部为折角结构和/或弧形结构。转弯部能实现对流体的流向和流速的持续改变，特别是折角结构和/或弧形结构的设计，能够有效增强流体的混乱对流，以实现更为均匀地混合效果，进而实现高效、快速地进行试样和试剂球的混合和反应。具体地，本实施例的各个混合通道3由至少两个相互连通的子混合通道构成，各个子混合通道由呈上窄下宽的八字型的上通道和呈上宽下窄的八字型的下通道连接而成，以形成“菱形”状。既保证了免疫反应充分进行的时间，在流动过程可以促进试剂球与试样保持充分混匀状态，利于免疫反应充分进行的同时还能节省空间。
20.而为了使免疫能发生反应，检测模块则包括有与最下游处的混合通道一一对齐设置的反应仓，各个反应仓的上游处还开设有用于供洗涤液进液的进液口。每个反应仓上还开设有用于供显色液进液的进口、供磁珠和供二抗进入的进入口。并且，每个反应仓的底部设置有磁铁，该磁铁能将免疫反应产生的结合物吸附于反应仓中。一般在免疫反应中，常采用具有捕获试剂球和标记试剂球的试剂球，其中，捕获试剂球具有包被了抗体、抗原或二抗的磁珠，而标记试剂球为包被了抗体、抗原或二抗的荧光微球；试样进入混合仓使试剂球溶化，得到混合试样，混合试样进入反应仓后发生免疫反应，这时位于反应仓底部的磁铁将免疫反应产生的包被了抗体、抗原或二抗的磁珠的结合物吸附于反应仓中，反应仓中只含有被吸附的磁珠结合物。由于第二级的混合通道设置有四个，为此反应仓也对应的设置有四个，分别为第一反应仓a、第二反应仓b、第三反应仓c和第四反应仓d，洗涤液进液的进液口也分别对应设置有四个，分为第一进液口a-1、第二进液口b-1、第三进液口c-1、第四进液口d-1；
21.供显色液进液的进口也对应设置有四个，分为第一进口a-2、第二进口b-2、第三进口c-2、第四进口d-2；
22.供磁珠和二抗进入的进入口也对应设置有四个，分为第一进入口a-3、第二进入口b-3、第三进入口c-3和第四进入口d-3；
23.用于出液的出口也对应设置有四个，分为第一出口a-4、第二出口b-4、第三出口c-4和第四出口d-4；
24.最后，为了方便对每个反应仓进行洗涤剂的清洗，每个反应仓上还开设有用于出液的出口。经过洗涤剂清洗后，洗涤剂可以从出口中流出。为了实现微流控芯片整体的密闭性，基片的检测模块和浓度梯度分级模块为凹陷结构，还包括有位于基片4上的封片3，封片将基片形成密闭的通道。本实施例的微流控芯片中的基片4分成浓度梯度分级模块，即可自动生成标准浓度梯度的试剂品，减少人工配制及加样的操作，不但可以缩短时间还可以实现试剂配制标准化；浓度梯度模块的设计可以快速辅助最优反应参数的筛选，并且保证实验地统一性，减少系统误差；同时本发明将梯度浓度模块和磁珠免疫elisa检测模块有效结合，可以在获得标准梯度浓度样本的同时完成目标蛋白的浓度的定量检测。
25.实施例1：crp梯度浓度检测实验
26.1、免疫磁珠制备：将15ug磁珠与50ul一抗溶液(浓度为3.3ug/ml)在体外离心管中
混合，在摇床中37℃下孵育30min，清洗后加入1％bsa进行封闭，在摇床中37℃下孵育30min，清洗后用保护液稀释20倍后4℃保存备用；
27.2、芯片预处理：将键合后的芯片在80℃烘箱中烘干，通过第一入口和第二入口通入5％bsa对沟道进行封闭，持续通液10min，封闭后清洗，将芯片烘干备用；
28.3、磁珠加样：用移液器吸取1.5ul上述免疫磁珠，分别通过第一进入口a-3、第二进入口b-3、第三进入口c-3和第四进入口d-3加入至第一反应仓a、第二反应仓b、第三反应仓c和第四反应仓d中，加样完成后在反应仓下方放置永磁铁(剩磁150mt)防止磁珠流失；
29.4、crp标准品加样及孵育：从第一入口1和第二入口2分别通过注射泵通入56ng/ml crp和pbs稀释液(即0ng/ml crp)，在反应仓入口处获得不同浓度的crp溶液(理论上，三级分流结构最终得到的crp蛋白浓度由低到高依次为0-18.5-37-56ng/ml)，直至液体充满第一反应仓a、第二反应仓b、第三反应仓c和第四反应仓d，取走永磁铁，将微震动电机固定至反应仓上方，震动孵育30min；
30.5、洗涤：在反应仓下方放置永磁铁，使用注射泵300ul/min流速下通过第一进液口a-1、第二进液口b-1、第三进液口c-1、第四进液口d-1通入洗涤液(1.5
×
tbst)，洗涤过程持续2min重复3次；
31.6、二抗-hrp孵育：用移液器吸取50ul二抗-hrp溶液(浓度0.25ug/ml)，通过第一进入口a-3、第二进入口b-3、第三进入口c-3和第四进入口d-3加入至第一反应仓a、第二反应仓b、第三反应仓c和第四反应仓d中，取走永磁铁，将微震动电机固定至反应仓上方，震动孵育15min；
32.7、洗涤：在第一反应仓a、第二反应仓b、第三反应仓c和第四反应仓d下方分别放置四块永磁铁，通过第一进液口a-1、第二进液口b-1、第三进液口c-1、第四进液口d-1通入洗涤液，持续洗涤10min重复3次
33.8、显色：用移液器吸取50ul显色液，通过第一进口a-2、第二进口b-2、第三进口c-2、第四进口d-2加入至第一反应仓a、第二反应仓b、第三反应仓c和第四反应仓d中，取走永磁铁，将微震动电机固定至反应仓上方，震动孵育10min；
34.9、加入终止液，测定溶液吸光度值。
35.实施例2：二抗浓度参数优化实验
36.1、免疫磁珠制备：将15ug磁珠与50ul一抗溶液(浓度为3.3ug/ml)混合，在摇床中37℃下孵育30min，清洗后加入1％bsa进行封闭，在摇床中37℃下孵育30min，清洗后用保护液稀释20倍后4℃保存备用；
37.2、芯片预处理：将键合后的芯片在80℃烘箱中烘干，通过第一入口和第二入口通入5％bsa对沟道进行封闭，清洗后芯片烘干备用；
38.3、磁珠预置：用移液器吸取1.5ul上述免疫磁珠，分别通过第一进入口a-3、第二进入口b-3、第三进入口c-3和第四进入口d-3加入至第一反应仓a、第二反应仓b、第三反应仓c和第四反应仓d中，加样完成后在反应仓下方放置永磁铁(150mt)防止磁珠流失；
39.4、crp加样及孵育：用移液器吸取50ul 56ng/ml的crp，分别通过第一进入口a-3、第二进入口b-3、第三进入口c-3和第四进入口d-3加入至第一反应仓a、第二反应仓b、第三反应仓c和第四反应仓d，取走永磁铁，将微震动电机固定至反应仓上方，震动孵育30min；
40.5、洗涤：在反应仓下方放置永磁铁，使用注射泵300μl/min流速下通过第一进液口
a-1、第二进液口b-1、第三进液口c-1、第四进液口d-1通入洗涤液(1.5
×
tbst)，洗涤过程持续2min重复3次；
41.6、二抗-hrp孵育：从第一入口和第二入口同时通过注射泵通入二抗-hrp(1ug/ml)和pbs稀释液，在第一进液口a-1、第二进液口b-1、第三进液口c-1、第四进液口d-1获得不同浓度的二抗溶液(理论上，三级分流结构最终得到的二抗-hrp浓度由低到高依次为0-0.33-0.66-1ug/ml，即3300
x
,1500
x
,1000
x
)，直至液体充满第一反应仓a、第二反应仓b、第三反应仓c和第四反应仓d，取走永磁铁，将微震动电机固定至反应仓上方，震动孵育15min；
42.7、洗涤：在反应仓下方放置永磁铁，通过第一进液口a-1、第二进液口b-1、第三进液口c-1、第四进液口d-1通入洗涤液，持续洗涤10min重复3次
43.8、显色：用移液器吸取50ul显色液tmb，通过a-2、b-2、c-2、d-2第二入口加入至第一反应仓a、第二反应仓b、第三反应仓c和第四反应仓d中，取走永磁铁，将微震动电机固定至反应仓上方，震动孵育10min；
44.9、加入终止液，测定溶液吸光度值。
45.实施例3：洗涤液浓度参数优化实验
46.1、免疫磁珠制备：将15ug磁珠与50ul一抗溶液(浓度为3.3ug/ml)在体外离心管中混合，在摇床中37℃下孵育30min，清洗后加入1％bsa进行封闭，在摇床中37℃下孵育30min，清洗后用保护液稀释20倍后4℃保存备用；
47.2、芯片预处理：将键合后的芯片在80℃烘箱中烘干，通过第一入口1和第二入口2通入5％bsa对沟道进行封闭，持续通液10min，封闭后清洗，将芯片烘干备用；
48.3、磁珠加样：用移液器吸取1.5ul上述免疫磁珠，分别通过第一进入口a-3、第二进入口b-3、第三进入口c-3和第四进入口d-3加入至第一反应仓a、第二反应仓b、第三反应仓c和第四反应仓d中，加样完成后在反应仓下方放置永磁铁(剩磁150mt)防止磁珠流失；
49.4、crp加样及孵育：用移液器吸取50ul 56ng/ml的crp，分别通过第一进入口a-3、第二进入口b-3、第三进入口c-3和第四进入口d-3加入至第一反应仓a、第二反应仓b、第三反应仓c和第四反应仓d，取走永磁铁，将微震动电机固定至反应仓上方，震动孵育30min；
50.5、洗涤：在反应仓下方放置永磁铁，从第一入口和第二入口分别利用通入5x洗涤液和稀释液，在第一进液口a-1、第二进液口b-1、第三进液口c-1、第四进液口d-1获得不同浓度的洗涤液tbst(理论上，三级分流结构最终得到的洗涤液浓度由低到高依次为0-1.5
x-3.3
x-5
x
)，洗涤过程持续2min重复3次；
51.6、二抗-hrp孵育：用移液器吸取50ul二抗-hrp(浓度0.25ug/ml)，通过第一进入口a-3、第二进入口b-3、第三进入口c-3和第四进入口d-3加入至第一反应仓a、第二反应仓b、第三反应仓c和第四反应仓d中，取走永磁铁，将微震动电机固定至反应仓上方，震动孵育15min；
52.7、洗涤：洗涤：在反应仓下方放置永磁铁，从第一入口和第二入口分别利用通入5x洗涤液和稀释液，在第一进液口a-1、第二进液口b-1、第三进液口c-1、第四进液口d-1获得不同浓度的洗涤液tbst(理论上，三级分流结构最终得到的洗涤液浓度由低到高依次为0-1.5
x-3.3
x-5
x
)，洗涤过程持续10min重复3次；
53.8、显色：用移液器吸取50ul显色液，通过第一进口a-2、第二进口b-2、第三进口c-2、第四进口d-2加入至第一反应仓a、第二反应仓b、第三反应仓c和第四反应仓d中，取走永
磁铁，将微震动电机固定至反应仓上方，震动孵育10min；
54.9、加入终止液，测定溶液吸光度值。

技术特征：
1.一种微流控芯片，包括有基片和设置在基片上的检测模块，其特征在于：所述检测模块被限定在所述基片的下层区域，而所述基片的上层区域设置有与所述检测模块相流体连通的浓度梯度分级模块，所述浓度梯度分级模块包括有至少二个供待混合的试剂进液的入口、设置在各个入口下游设置有供各个待混合的试剂混合的混合通道，所述混合通道设置有至少两级，相邻级的混合通道数量相差为至少一个，各个所述入口通过各自的开放端部与其相邻的混合通道均通过连接通道连通，所述连接连通的数量与其相邻的上游混合通道的数量相同。2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：各个所述混合通道包括有多个转弯部，至少部分所述转弯部为折角结构和/或弧形结构。3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于：所述检测模块包括有与最下游处的混合通道一一对齐设置的反应仓，各个反应仓的上游处还开设有用于供洗涤液进液的进液口。4.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于：每个所述反应仓上还开设有用于供显色液进液的进口、供磁珠和供二抗进入的进入口。5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于：每个所述反应仓的底部设置有磁铁，该磁铁能将免疫反应产生的结合物吸附于反应仓中。6.根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于：每个所述反应仓上还开设有用于出液的出口。7.根据权利要求1～6任意一项所述的微流控芯片，其特征在于：各个所述混合通道由至少两个相互连通的子混合通道构成，各个子混合通道由呈上窄下宽的八字型的上通道和呈上宽下窄的八字型的下通道连接而成。8.根据权利要求7所述的微流控芯片，其特征在于：所述基片的检测模块和浓度梯度分级模块为凹陷结构，还包括有位于基片上的封片，所述封片将基片形成密闭的通道。

技术总结
本发明涉及一种微流控芯片，包括有基片和检测模块，其特征在于：检测模块被限定在基片的下层区域，而基片的上层区域设置有与检测模块相流体连通的浓度梯度分级模块，浓度梯度分级模块包括有至少二个供待混合的试剂进液的入口、设置在各个入口下游设置有供各个待混合的试剂混合的混合通道，混合通道设置有至少两级，相邻级的混合通道数量相差为至少一个，各个入口通过各自的开放端部与其相邻的混合通道均通过连接通道连通，与现有技术相比，本发明的优点在于：将基片分成浓度梯度分级模块，即可自动生成标准浓度梯度的试剂品，减少人工配制及加样的操作，不但可以缩短时间还可以实现试剂配制标准化。现试剂配制标准化。现试剂配制标准化。


技术研发人员：付玉 梁百慧 王姗 郭国良 郑军妹
受保护的技术使用者：宁波方太厨具有限公司
技术研发日：2023.03.03
技术公布日：2023/7/12