葡萄酒中虎杖苷的液相色谱-串联质谱检测方法与流程

1.本发明涉及食品安全检测领域，具体涉及一种葡萄酒中虎杖苷的液相色谱-串联质谱检测方法。


背景技术：

2.白藜芦醇及其糖苷是广泛存在于葡萄属植物中的一种具有保健作用的植物应激素。前者是大部分植物包括葡萄属植物自然产生的一种抗氧化剂，也是植物毒素反应产生的主要物质。它主要积聚在葡萄叶片和果皮中，以抵御不同霉菌的侵染、紫外线辐射和化学损伤。天然白藜芦醇分子中的羟基还能与葡萄糖结合，以葡萄糖苷，即虎杖苷的形式存在。虎杖苷具有和白藜芦醇同样的生物活性，在肠道中糖苷酶的作用下，虎杖苷可分离为白藜芦醇。葡萄酒是人类摄人白藜芦醇以及白藜芦醇衍生物的途径之一。虎杖苷也逐渐成为检测葡萄酒质量的一个指标。但是葡萄酒中虎杖苷的含量取决于较多因素。由于白藜芦醇是对抗自然界不良刺激的一种应激素。所以其在葡萄酒中的含量与气候、环境、年份、病虫害等密切相关。但是，目前还没有一个高效便捷的方法对葡萄酒中虎杖苷进行定性定量分析，检测效率低下，难以有效监控葡萄酒的产品质量。


技术实现要素：

3.针对现有技术的不足，本发明提供了一种葡萄酒中虎杖苷的液相色谱-串联质谱检测方法，其操作便捷，处理简单，检测选择性好，灵敏度高，有效实现定性定量分析，具有良好的检测效果。
4.为实现上述目的，本发明提供了一种葡萄酒中虎杖苷的液相色谱-串联质谱检测方法，包括以下步骤，步骤一，葡萄酒样品用水直接稀释1000倍，过0.22μm微孔滤膜后，供uplc-ms/ms测定；
5.步骤二，标准曲线的配制，取虎杖苷的标准品10mg，用甲醇溶解并转移至100ml容量瓶中，用甲醇定容，制得100μg/ml虎杖苷标准储备液；取100μg/ml的虎杖苷标准储备液0.1ml，分别用水稀释定容至10ml，配制成1.0μg/ml的虎杖苷标准工作液；制作校准曲线用工作溶液的制备：各取1、2、5、20、50、100μl的1.0μg/ml虎杖苷标准工作液，各加入979、978、975、960、930、880μl空白基质，制得1、2、5、20、50、100μg/l的系列浓度基质标准曲线溶液；
6.步骤三，待测样品溶液的检测：将步骤一中制备的待测样品溶液和步骤二中制备的基质标准曲线溶液在液相色谱-串联质谱仪上分别进样，根据基质标准曲线对定量离子进行外标法定量计算，获得待测样品溶液中虎杖苷的浓度，继而获得葡萄酒中虎杖苷的含量。
7.作为本发明的进一步设置，所述步骤三中液相色谱-串联质谱仪中色谱条件为：色谱柱：c18柱(150
×
2.1mm，3.5μm)；流动相：a为乙腈，b为5mmol/l乙酸铵溶液；梯度洗脱程序：0～1min，5％a；1-3min，5％-90％a；4-6min，90％a；流速：400μl/min，柱温：30℃，进样量：5μl；所述步骤三中液相色谱-串联质谱仪中质谱条件为：电喷雾离子源：负离子扫描；离
子源温度：500℃；电喷雾电压：4500v；雾化气(gs1)压力：344.5kpa；辅助气压力(gs2)：275.6kpa；气帘气压力：68.9kpa；碰撞气cad压力：137.8kpa；监测模式：多反应监测(mrm)，mrm母离子：389.1m/z；mrm子离子227.1m/z，185.0m/z，保留时间4.28min，去簇电压dp：-60v，碰撞能量ce：-22ev，-28ev。
8.这样设置的有益效果是，采用上述方案，通过对葡萄酒样品的直接稀释，并将稀释液进超高效液相色谱-串联质谱进行检测。第一步稀释：先将样品用水进行稀释；第二步进液相色谱-串联质谱仪分析：将第一步稀释液，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到净化的待检液。该净化后的待检液则不会对检测仪器造成污染。其次，本发明对于葡萄酒中花青素的定性定量检测分析是通过液相色谱-串联质谱仪分析。先配置一组阶梯形的标准曲线溶液，然后将标准曲线溶液和待检液在液相色谱-串联质谱仪上分别进样。待检液中出现的色谱峰保留时间与标准工作溶液一致，允许偏差小于
±
2.5％，该色谱峰所对应的质谱定性离子对的相对丰度与浓度相当的标准工作溶液的相对丰度一致，而且相对丰度偏差不超过规定，则可确定该待检液中花青素含量。本方法直接对葡萄酒样品用水稀释、溶剂使用量少、重现性好、提取效率高、更安全的特点。
附图说明
9.图1为本发明具体实施例中的虎杖苷化学结构式；
10.图2为虎杖苷标准溶液的提取离子对谱图；
11.图3为本发明具体实施例中虎杖苷扫描离子对的二级质谱图。
具体实施方式
12.本发明一种葡萄酒中虎杖苷的液相色谱-串联质谱检测方法的实施例如图1至图3所示：包括以下步骤：
13.步骤一：葡萄酒样品用水直接稀释1000倍，过0.22μm微孔滤膜后，供uplc-ms/ms测定。
14.步骤二：标准曲线的配制：取虎杖苷的标准品10mg，用甲醇溶解并转移至100ml容量瓶中，用甲醇定容，制得100μg/ml虎杖苷标准储备液；取100μg/ml的虎杖苷标准储备液0.1ml，分别用水稀释定容至10ml，配制成1.0μg/ml的虎杖苷标准工作液。制作校准曲线用工作溶液的制备：各取1、2、5、20、50、100μl的1.0μg/ml虎杖苷标准工作液，各加入979、978、975、960、930、880μl基质空白，制得1、2、5、20、50、100μg/l的系列浓度基质标准曲线溶液。
15.步骤三：待测样品溶液的检测：将步骤一中制备的待测样品溶液和步骤二中制备的标准曲线溶液在液相色谱-串联质谱仪上分别进样，根据标准曲线对定量离子进行外标法定量计算，获得待测样品溶液中虎杖苷的浓度，继而获得葡萄酒中虎杖苷的含量。
16.步骤三中液相色谱-串联质谱的参数条件如下：
17.色谱条件：色谱柱：c18柱(150
×
2.1mm，3.5μm)；流动相：a为乙腈，b为5mmol/l乙酸铵溶液。梯度洗脱程序：0～1min，5％a；1-3min，5％-90％a；4-6min，90％a；流速：400μl/min，柱温：30℃，进样量：5μl。
18.质谱条件：电喷雾离子源：负离子扫描；离子源温度：500℃；电喷雾电压：4500v；雾化气(gs1)压力:344.5kpa；辅助气压力(gs2):275.6kpa；气帘气压力：68.9kpa；碰撞气cad
压力：137.8kpa。监测模式：多反应监测(mrm)，mrm离子对及电压如下表所示。
19.化合物线性方程相关系数定量限μg/l虎杖苷y＝8.12
×
103x+21350.99930.05
20.由下表所示，为本发明具体实施例中标准工作曲线，结果表明虎杖苷在1.0～50μg/l范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9993，以10倍信噪比(s/n)计算该方法定量限(loq)，花青素的定量限在0.05μg/l之间，显示了该方法具有较高的灵敏度，结果如表2。
[0021][0022]
取已知虎杖苷含量分别为0.85、2.45、3.06、18.5mg/l的葡萄酒样品，平行6份，然后分别精确加入虎杖苷浓度分别为0.5、2.0、2.0、20.0mg/l的标准溶液1ml，按照本方法进行测定，计算回收率，平均回收率为86.4％～105％，rsd不大于11％。
[0023]
以上实例，只是本发明优选地具体实例的一种，本领域技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都包含在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种葡萄酒中虎杖苷的液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于：包括以下步骤，步骤一，葡萄酒样品用水直接稀释1000倍，过0.22μm微孔滤膜后，供uplc-ms/ms测定；步骤二，标准曲线的配制，取虎杖苷的标准品10mg，用甲醇溶解并转移至100ml容量瓶中，用甲醇定容，制得100μg/ml虎杖苷标准储备液；取100μg/ml的虎杖苷标准储备液0.1ml，分别用水稀释定容至10ml，配制成1.0μg/ml的虎杖苷标准工作液；制作校准曲线用工作溶液的制备：各取1、2、5、20、50、100μl的1.0μg/ml虎杖苷标准工作液，各加入979、978、975、960、930、880μl空白基质，制得1、2、5、20、50、100μg/l的系列浓度基质标准曲线溶液；步骤三，待测样品溶液的检测：将步骤一中制备的待测样品溶液和步骤二中制备的基质标准曲线溶液在液相色谱-串联质谱仪上分别进样，根据基质标准曲线对定量离子进行外标法定量计算，获得待测样品溶液中虎杖苷的浓度，继而获得葡萄酒中虎杖苷的含量。2.根据权利要求1所述的葡萄酒中虎杖苷的液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于：所述步骤三中液相色谱-串联质谱仪中色谱条件为：色谱柱：c18柱(150
×
2.1mm，3.5μm)；流动相：a为乙腈，b为5mmol/l乙酸铵溶液；梯度洗脱程序：0～1min，5％a；1-3min，5％-90％a；4-6min，90％a；流速：400μl/min，柱温：30℃，进样量：5μl；所述步骤三中液相色谱-串联质谱仪中质谱条件为：电喷雾离子源：负离子扫描；离子源温度：500℃；电喷雾电压：4500v；雾化气(gs1)压力：344.5kpa；辅助气压力(gs2)：275.6kpa；气帘气压力：68.9kpa；碰撞气cad压力：137.8kpa；监测模式：多反应监测(mrm)，mrm母离子：389.1m/z；mrm子离子227.1m/z，185.0m/z，保留时间4.28min，去簇电压dp：-60v，碰撞能量ce：-22ev，-28ev。

技术总结
本发明公开了一种葡萄酒中虎杖苷的液相色谱-串联质谱检测方法，包括以下步骤：步骤一，样品准备；步骤二，标准曲线绘制；步骤三，待测样品溶液检测；该方法操作便捷，处理简单，检测选择性好，灵敏度高，有效实现定性定量分析，具有良好的检测效果。具有良好的检测效果。具有良好的检测效果。


技术研发人员：陈祥准 张莎莎 张凯 程洁 刘俊 戴伟婷 韩超
受保护的技术使用者：温州海关综合技术服务中心
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/7/12