一种植物根际酶活热点微生物原位取样方法

1.本发明属于包含酶、核酸或微生物的测定或检验方法，具体涉及一种植物根际酶活热点微生物原位取样方法。


背景技术：

2.根际是植物吸收和循环养分的主要场所，也是植物与土壤微生物相互作用的重要区域。与非根际土壤相比，植物根际为土壤微生物提供了独特的生态位，定殖了积极参与养分循环的根际微生物群落。为了解施用植物养分转化的过程，有必要对植物根际微生物进行调查。具体来说，根际刺激特定的微生物类群生长，从而逐渐形成一个与非根际土壤不同的微生物群落。这些活跃的根际微生物群落积极推动有机质的矿化和循环过程，从而促进植物的养分循环。
3.根际土壤的采集是根际微生物研究的基础，但现行的根际土壤采集存在诸多局限。自然状态下，根际与非根际土壤之间实际上没有明显的物理边界，且沿着植物根轴土壤理化参数变化较大，造成了根际微生物群落沿植物根系分布存在较高的空间异质性。目前常见的根际土壤的采集办法是抖根法，即植物根系抖落下来的土壤被视为非根际土，抖动后仍附着在植物根系上的土壤颗粒被视为根际土收集。这种破坏性取样办法忽略了根际微生物分布的空间异质性，掩盖了根际的真实边界及沿着植物根轴根际微生物分布的差异，无法提供对根际微生物定殖土壤区域的原位洞察。
4.因此，原位采集未被破坏的根际土壤是洞察根际微生物真实分布的重要前提。土壤原位酶谱技术是一种以荧光底物为基础的测定根际土壤表面酶活分布的方法。简言之，在紫外照射下，酶谱荧光信号强的区域则酶活越高，酶活高的土壤区域(酶活热点)则为定殖有活跃的微生物群落的特定区域(即微生物生长速率快，代谢功能更强)。现行对酶活热点的定义较为模糊，存在人为划分的误差，例如：将肉眼可见的荧光信号强的区域划分为酶活热点，或者将酶谱照片上的每个像素转化为灰度值，人为定义前25％灰度值对应的像素区域划分为酶活热点。上述对酶活热点的定义存在较大主观性，实验结果可重复性差。
5.基于此，本发明将酶谱照片转化为灰度后(灰度值通常呈正态分布)，结合最大期望算法(em算法)对灰度值分布进行阈值划分从而确定酶活热点，通过imagej软件在酶谱上显示出酶活热点，再针对酶活热点进行微观土壤取样。本发明的取样方法不需要破坏根土界面和混合土壤样品，充分将根际微生物分布的空间异质性纳入考虑，能够反映根际微生物沿着根轴的真实分布，提供了对根际微生物定殖区域的原位洞察。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种植物根际酶活热点微生物原位取样方法，在土壤原位酶谱的基础上对酶活热点的阈值进行划分，避免了主观人为偏差，而且与传统根际土壤破坏性取样不同，本发明针对酶活热点的根际土壤原位取样不需要破坏根土界面和混合土壤样品，且充分将根际微生物的空间异质性纳
入考虑，能够反映根际微生物沿着根轴的真实分布。
7.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
8.提供一种植物根际酶活热点微生物原位取样方法，具体步骤如下：
9.1)采用根盒培养待研究植物，培养过程中将根盒倾斜放置，使植物根系自然暴露于土壤表面；
10.2)采用土壤原位酶谱技术测试待研究植物暴露于土壤表面的根际对多种酶的酶谱，随后将酶谱照片导入计算机，采用最大期望算法对酶谱照片灰度值分布进行阈值划分从而确定酶活热点区域；
11.3)在环形紫外线光源照射下，用记号笔在酶谱上标记步骤2)测试的所有酶谱共有酶活热点区域，对应至步骤2)测试酶谱的土壤表面，用注射器收集酶活热点区域的土壤颗粒，收集后将土壤颗粒后处理用于微生物分析。
12.按上述方案，步骤2)中酶为β-葡萄糖苷酶(bg)，酸性磷酸酶(acp)，亮氨酸氨基肽酶(alp)。这三种酶分别对应碳、磷、氮循环过程。
13.按上述方案，步骤2)采用土壤原位酶谱技术测试待研究植物暴露于土壤表面的根际对多种酶的酶谱的具体方法为：在待研究植物暴露于土壤表面的根系上覆盖带有荧光底物的微孔滤膜，测试不同的酶时采用带有不同荧光底物的微孔滤膜，三种水解酶β-葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶和亮氨酸氨基肽酶对应的荧光底物分别为：
14.4-甲基伞形酮酰-β-d-吡喃葡萄糖苷(muf-g)，4-甲基伞形酮磷酸酯(muf-p)，
15.l-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素盐酸盐(amc-l)，测试每种酶的酶谱时覆膜1小时，随后在环形紫外线光源照射下使用单反相机拍摄酶谱，且测试酶谱过程中保持温度和空气湿度恒定，测试两种不同的酶的酶谱之间间隔1小时以上。这样可以避免荧光信号相互干扰，以及温度、含水量的变化对土壤酶活扩散的影响。采用环形紫外线光源能够避免照射不均对酶谱结果造成的不良影响。
16.按上述方案，步骤2)采用最大期望算法对酶谱照片灰度值分布进行阈值划分从而确定酶活热点区域的具体方法为：使用imagej软件将酶谱照片转换为灰度(8bit)格式，然后使用r语言mixtools包中的normalmixem函数计算灰度值正态分布，数值密度低(即酶活区域)的正态分布的平均值为灰度划分的阈值，高于阈值的区间被划分为酶活热点区域。
17.按上述方案，步骤2)用注射器收集所述荧光区域的土壤颗粒质量为0.1～2g。
18.按上述方案，步骤2)将土壤颗粒后处理方法包括冷冻干燥，自然风干，无菌pbs溶液保存中的一种。处理后的土壤样品用于后续微生物分析，例如dna提取或代谢物分析。
19.与现有的破坏性根际采样方法相比，本发明将酶谱照片转化为灰度后(灰度值通常呈正态分布)，结合最大期望算法(em算法)对灰度值分布进行阈值划分从而确定酶活热点，通过imagej软件在酶谱上显示出酶活热点，再针对酶活热点进行微观土壤取样。本发明的取样方法不需要破坏根土界面和混合土壤样品，充分将根际微生物分布的空间异质性纳入考虑，能够反映根际微生物沿着根轴的真实分布，精确度达到了mm级，提供了对根际微生物定殖区域的原位洞察。
20.本发明的有益效果在于：本发明通过土壤原位酶谱技术定位酶活热点后，通过阈值划分确定根系酶活热区，避免了肉眼划分的人为偏差，在定位根际酶活热区分布的基础上，采用注射器针头对根际酶活热区土壤进行原位取样，便于后续样品分析，避免了现有取
样办法对根际微生物真实分布的破坏。
附图说明
21.图1为本发明实施例1中根盒培养的装置图；
22.图2为实施例1中酶谱灰度分布正态拟合图；
23.图3为实施例1中酶谱阈值划分后指示出的酶活热点(红色区域)；
24.图4为实施例1中三种酶所共有的玉米根际酶活热点区域(伪彩表示)；
25.图5为实施例1中从根际酶活热点区域土壤提取出的dna的凝胶电泳结果；
26.图6为实施例2中三种酶所共有的美洲商陆根际酶活热点区域(伪彩表示)；
27.图7为实施例2中从根际酶活热点区域土壤提取出的dna的凝胶电泳结果。
具体实施方式
28.为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步详细描述。这些实施方式是示例性的，本发明公开内容不限于此，且本文中所使用的附图，仅仅是为了更好地说明本发明所公开内容，对保护范围并不具有限制作用。如果无特殊说明，本发明以下具体实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
29.实施例1
30.一种植物根际酶活热点微生物原位取样方法，具体步骤如下：
31.1)种植于南方红壤中的玉米经根盒(内尺寸20cm
×
20cm
×
3cm，倾斜角度45
°
)培养28天，培养过程中将根盒倾斜放置，使植物根系自然暴露于土壤表面，根盒及根系照片如图1所示；
32.2)将荧光底物muf-g、muf-p分别溶于mes(c6h
13
no4sna
0.5
)缓冲液中，amc-l溶于trizma缓冲液中，得到三种荧光底物溶液，浓度均为10mm，将三张微孔滤膜(桃园滤膜n66，孔径0.45μm，尺寸10cm
×
10cm)分别浸泡于三种不同的荧光底物溶液中，测试玉米根系酶谱时，打开根盒可拆卸面暴露出玉米根系土壤表面，用无菌镊子夹取一张微孔滤膜紧贴于土壤表面，并用铝箔覆盖在微孔滤膜上避免水分蒸发，用毛刷将铝箔与微孔滤膜间留存气泡排出，将一张玻璃片置于铝箔上，利用其自重使微孔滤膜与土壤表面紧密贴合，每种测试贴合反应时间为1h，两次酶谱测试之间间隔1h，酶谱成像测试对象依次为β-葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶、亮氨酸氨基肽酶，覆膜期间控制室温和湿度恒定(24℃，相对湿度60％)，以避免温度和土壤含水量变化对酶扩散的影响，覆膜1h后，小心地将聚酰胺滤膜从土壤表面剥离，用洁净的毛刷去除附着的土壤颗粒，将微孔滤膜置于暗室中，使用数码相机在环状紫外光源下成像，相机参数设置如下：光圈值f/20，曝光时间1/200秒，iso速度12800，焦距50mm，随后将酶谱照片导入计算机，采用最大期望算法对酶谱照片灰度值分布进行阈值划分从而确定酶活热点区域，具体方法为：使用imagej软件将酶谱照片转换为灰度(8bit)格式，然后使用r语言(r studio4.2.1软件)mixtools包中的normalmixem函数计算灰度值正态分布，数值密度低(即酶活区域)的正态分布的平均值为灰度划分的阈值，高于阈值的区间被划分为酶活热点区域，并以伪彩表示，深红色代表酶活高的热点区域；
33.3)在环形紫外线光源照射下，用记号笔标记出每张酶谱上酶活热点(伪彩显示为
最红)的位置，识别出对应所有酶谱的共有的酶活热点区域，使用注射器针头(1.5mm)收集共有的酶活热点区域的土壤颗粒(约1g)，收集后立即使用真空冷冻干燥机将土壤样品冷冻干燥。
34.图2以β-葡萄糖苷酶为例展示酶谱灰度分布的正态拟合结果，从图中可以看出，成功拟合出了两个正态分布，其中数值密度低(即酶活区域)的正态分布的平均值为灰度划分的阈值，高于阈值的区间被划分为酶活热点区域，对应图3中红色部分，图3为β-葡萄糖苷酶对应酶谱阈值划分后使用imagej伪彩表示出的酶活热点(红色区域)。
35.图4为三种酶的酶谱所共有的酶活热点区域，红圈区域为采用注射器针头对根际酶活热点土壤精准取样的位置。
36.图5为本实施例取样的根际酶活热点土壤用于后续dna提取后的结果，从图中可以看出，针对根际酶活热点土壤的取样，可以很好的提取出较高的dna浓度(4-12号泳道)，对应根际微生物活动较为旺盛的区域。
37.实施例2
38.一种植物根际酶活热点微生物原位取样方法，具体步骤如下：
39.将美洲商陆种植于黑土中进行根盒(内尺寸20cm
×
20cm
×
3cm)培养28天后，采用实施例1方法对三种常见的参与土壤c、n和p循环的水解酶：β-葡萄糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶和酸性磷酸酶进行成像，酶谱成像顺序依次为β-葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶、亮氨酸氨基肽酶。覆膜期间控制室温和湿度(26℃，相对湿度50％)。每种酶底物贴合反应时间为1h，反应之间间隔1h；成像时相机参数设置如下：光圈值f/25，曝光时间1/250秒，iso速度12000，焦距45mm。
40.采用实施例1相同的方法识别出对应所有酶谱的共有的热点区域。使用注射器针头收集共有荧光区域的土壤颗粒，收集后将自然风干的酶活热点根际土壤用于微生物dna提取。
41.最终对应三种酶的酶活热点区域分布如图6所示。同时，对美洲商陆根际酶活土壤的微生物进行dna提取，实验结果如图7所示，从图中可以看出，针对根际酶活热点土壤的取样，可以很好的提取出较高的dna浓度，对应根际微生物活动较为旺盛的区域。
42.种植于不同土壤类型中的美洲商陆，通过同样方法均能定位出共同的酶活热区。该方法不特定于土壤类型、植物类型及成像参数，适用范围广泛。且能很好的指导根际酶活热点土壤的取样。

技术特征：
1.一种植物根际酶活热点微生物原位取样方法，其特征在于，具体步骤如下：1)采用根盒培养待研究植物，培养过程中将根盒倾斜放置，使植物根系自然暴露于土壤表面；2)采用土壤原位酶谱技术测试待研究植物暴露于土壤表面的根际对多种酶的酶谱，随后将酶谱照片导入计算机，采用最大期望算法对酶谱照片灰度值分布进行阈值划分从而确定酶活热点区域；3)在环形紫外线光源照射下，用记号笔在酶谱上标记步骤2)测试的所有酶谱共有酶活热点区域，对应至步骤2)测试酶谱的土壤表面，用注射器收集酶活热点区域的土壤颗粒，收集后将土壤颗粒后处理用于微生物分析。2.根据权利要求1所述的植物根际酶活热点微生物原位取样方法，其特征在于，步骤2)中酶为β-葡萄糖苷酶，酸性磷酸酶，亮氨酸氨基肽酶。3.根据权利要求1所述的植物根际酶活热点微生物原位取样方法，其特征在于，步骤2)采用土壤原位酶谱技术测试待研究植物暴露于土壤表面的根际对多种酶的酶谱的具体方法为：在待研究植物暴露于土壤表面的根系上覆盖带有荧光底物的微孔滤膜，测试不同的酶时采用带有不同荧光底物的微孔滤膜，三种水解酶β-葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶和亮氨酸氨基肽酶对应的荧光底物分别为：4-甲基伞形酮酰-β-d-吡喃葡萄糖苷，4-甲基伞形酮磷酸酯，l-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素盐酸盐，测试每种酶的酶谱时覆膜1小时，随后在环形紫外线光源照射下使用单反相机拍摄酶谱，且测试酶谱过程中保持温度和空气湿度恒定，测试两种不同的酶的酶谱之间间隔1小时以上。4.根据权利要求1所述的植物根际酶活热点微生物原位取样方法，其特征在于，步骤2)采用最大期望算法对酶谱照片灰度值分布进行阈值划分从而确定酶活热点区域的具体方法为：使用imagej软件将酶谱照片转换为灰度格式，然后使用r语言mixtools包中的normalmixem函数计算灰度值正态分布，数值密度低的正态分布的平均值为灰度划分的阈值，高于阈值的区间被划分为酶活热点区域。5.根据权利要求1所述的植物根际酶活热点微生物原位取样方法，其特征在于，步骤2)用注射器收集所述荧光区域的土壤颗粒质量为0.1～2g。6.根据权利要求1所述的植物根际酶活热点微生物原位取样方法，其特征在于，步骤2)将土壤颗粒后处理方法包括冷冻干燥，自然风干，无菌pbs溶液保存中的一种。

技术总结
本发明涉及一种植物根际酶活热点微生物原位取样方法，具体步骤如下：1)采用根盒培养待研究植物；2)采用土壤原位酶谱技术测试待研究植物暴露于土壤表面的根际对多种酶的酶谱，随后将酶谱照片导入计算机，采用最大期望算法对酶谱照片灰度值分布进行阈值划分从而确定酶活热点区域；3)在环形紫外线光源照射下，用记号笔在酶谱上标记所有酶谱共有酶活热点区域，对应至测试酶谱的土壤表面，用注射器收集酶活热点区域的土壤颗粒。本发明通过土壤原位酶谱技术定位酶活热点后，通过阈值划分确定根系酶活热区，避免了肉眼划分的人为偏差，采用注射器针头对根际酶活热区土壤进行原位取样，避免了现有取样办法对根际微生物真实分布的破坏。破坏。破坏。


技术研发人员：徐晟文 郑宁国 姚槐应
受保护的技术使用者：武汉工程大学
技术研发日：2023.03.30
技术公布日：2023/7/12