一株水稻内生链霉菌Ahn65及其应用的制作方法

一株水稻内生链霉菌ahn65及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物领域，具体涉及到一株水稻内生链霉菌及其在抗稻瘟病和促进水稻生长、降镉等方面的应用。


背景技术：

2.当前，植物生长促进和防治病虫害主要依赖于化学肥料的使用。然而，由于化学农药和肥料的滥用或者过度使用，对环境造成了严重的污染，并且化肥价格高涨、能源紧缺，所以迫切需要利用对环境更为友好的方式来替代或部分替代化学肥料。微生物肥料是化学肥料的重要替代资源，对于我国实施化学肥料减量前提下保障农作物产量、质量提升至关重要。植物内生与根围促生菌，是微生物肥料的主要活性成分。近些年来，国外许多大型生物科技公司均在积极开发微生物肥料产品，部分产品实现了规模化生产和大面积推广应用。目前，我国的微生物肥料使用量在肥料总用量中占比很低，特别是对于我国的主要粮食作物——水稻，微生物肥料的使用比例更低。在化肥利用率逐年下降、稻田土壤微生态结构失衡的情况下，开发高效、稳定、多功能的微生物肥料，是改善水田土壤生态结构、保障水稻高质高效绿色生产的有效途径。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种抗病促生降镉水稻内生链霉菌及其在水稻增产、降镉和防治稻瘟病中的应用，该菌株能高效抑制稻瘟病菌，降低米镉含量，并能促进水稻生长。该菌属于植物内生菌，从海南水稻稻瘟病发病区的未发病水稻茎组织中筛选获得。
4.第一方面，本发明所得菌株结合菌落菌体形态特征和基于16s rrna基因序列的系统发育树，鉴定为链霉菌(streptomyces sp.)ahn65。该菌株已于2022年12月19日由中国典型培养物保藏中心(保藏地址：武汉大学)所保藏，保藏编号为cctcc no.20221981。
5.所述的水稻内生链霉菌ahn65，最适培养温度为28℃，最适产孢温度为32℃；
6.该菌株对链霉素的平均最小抑菌浓度达到100ug/ml，对氨苄西林霉素的平均最小抑菌浓度超过200ug/ml；
7.该菌株在当氯化钠质量浓度1％时，od
600
达到最大值，菌体在7％的氯化钠质量浓度下仍有生长，当氯化钠质量浓度达到9％时，菌体生长被抑制；
8.该菌株在60min的紫外照射时间下仍能存活。
9.第二方面，本发明提供所述的水稻内生链霉菌ahn65或其发酵液在防治水稻稻瘟病中的应用。
10.所述的发酵液抑制稻瘟病菌的菌丝生长。
11.所述的水稻内生链霉菌ahn65在初始ph7-9的isp2培养基中生物量和发酵液抑菌活性高于初始ph4-6。
12.第三方面，本发明提供所述的水稻内生链霉菌ahn65或其发酵液在防治水稻穗颈瘟稻瘟病中的应用。
13.第四方面，本发明提供所述的水稻内生链霉菌ahn65或其发酵液在促进水稻生长中的应用。
14.所述的水稻内生链霉菌ahn65具有产铁载体、解钾、固氮和产iaa中的至少一种的作用。
15.第五方面，本发明提供所述的水稻内生链霉菌ahn65或其发酵液在水稻降镉中的应用。
16.本发明所得菌株不仅能有效抑制稻瘟病菌的生长，对链霉素和安卡西林霉素等有较强的耐受能力；对盐度的耐受性及紫外照射稳定性均较强、还可固氮、解钾、产铁载体，产iaa，促进水稻生长并降低米镉含量，有较大潜力开发成商业化生物肥。
附图说明
17.图1：菌株ahn65的菌落形态；
18.图2：菌株ahn65基于16s rdna基因序列的最大简约系统发育树；
19.图3：菌株ahn65在不同温度下的生长情况；
20.图4：菌株ahn65在不同盐浓度下的生长情况；
21.图5：菌株ahn65经紫外照射后的生长情况；
22.图6：菌株ahn65在不同ph值的isp2培养基中的生长情况。
具体实施方式
23.以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不会形成对本发明的限制。
24.实施例1 ahn65菌株的分离和纯化
25.取采自海南三亚市水稻田中轻度发病和健康的水稻组织，采用乙醇-次氯酸钠联合表面消毒，然后将茎剪成1cm左右长的小段，置于twye培养基中，于30℃培养，待内生放线菌从组织中析出，将其挑出转移到pda培养基中划线进行分离纯化，得到纯培养物，纯化后的菌株用25％的甘油悬浮储存至-80℃冰箱。将其中一株分离纯化所得的内生放线菌命名为ahn65。
26.所用twye培养基组成：酵母提取物0.25g，磷酸氢二钾0.5g，琼脂粉18g，纯水1000ml，ph值7.2
±
0.2，121℃高温高压灭菌25min。待培养基冷却至55℃左右时，在无菌条件下加入终浓度为50μg/ml的苯菌灵和25μg/ml的萘啶酮酸充分混匀后倒板。
27.pda培养基组成：土豆100g，葡萄糖10g，琼脂18g，ph自然，水1000ml，121℃高温高压灭菌25min。
28.实施例2 ahn65菌株的鉴定
29.1.菌株形态观察：分离并纯化得到的内生放线菌ahn65，初期菌落圆形，气丝黄白，早期孢子成灰绿色，后期孢子为土黄色，基丝浅黄褐，日久产生红褐色素。ahn65菌株的菌落早期和晚期形态见图1。
30.2.菌株鉴定：
31.采用上海生物工程有限公司细菌总dna提取试剂盒提取放线菌ahn65的基因组dna，扩增其16s rrna序列，引物序列见表1。pcr产物经电泳纯化后送上海擎科生物有限公
司长沙分公司进行测序，测序结果在genbank数据库中进行blast序列比对，并运用软件clustalw2和mega 7.0，采用邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树(图2)。
32.基于16s rrna的进化树显示，ahn65菌株与链霉菌(s.griseobrunneus)标准菌株atcc 4.1838的同源性最高，为99.48％。该菌株于2022年12月19号保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：武汉，武汉大学)，保藏编号为cctcc no.20221981。
33.表1 pcr扩增所需引物序列
[0034][0035]
实施例3菌株在不同温度条件下的生长情况
[0036]
将ahn65菌株接入isp2固体培养基中培养3-5天产孢，刮取孢子粉悬浮至0.5％吐温水溶液中，配制成1
×
108cfu/ml的孢子悬浮液，菌悬液倍比稀释后取100μl涂平板，设104个/ml，105个/ml，106个/ml三个梯度，每个稀释度3个重复，分别置于26、28、30、32、34℃培养，7d后计数。结果显示(图3)，菌株在26～34℃条件下都生长良好，菌株在28℃条件下生长最好，生物量最高，而在32℃条件下产孢数量最高。说明菌株最适培养温度为28℃，最适产孢温度为32℃。
[0037]
所述isp2培养基组成：麦芽提取物10g，酵母提取物4g，葡萄糖4g，ph 7.2，水1000ml，115℃高温高压灭菌30min。
[0038]
实施例4菌株对不同抗生素的敏感度和对盐度的耐受性及紫外照射稳定性
[0039]
1.菌株对不同抗生素的敏感度
[0040]
取不同抗生素加灭菌水配制抗生素母液，经无菌过滤后进行梯度稀释，设置6.25、12.5、25、50、100、200ug/ml 6个梯度浓度，待将灭菌后的isp2培养基冷却至50℃左右时，加入抗生素，充分混匀倾倒平板，制成含不同递减浓度抗生素的平板。按照实施例3制备ahn65的菌悬液，将100ul菌悬液涂布于平板上，每个处理3个重复，28℃恒温培养箱中培养17h后，观察菌株生长情况，以抑制菌株生长的平板所含最低抗生素浓度为最小抑菌浓度(mic)。结果显示(表2)，卡那霉素、氯霉素和庆大霉素对ahn65的mic均为6.25ug/ml，萘啶酮酸的mic达到25ug/ml，相比较之下，链霉素的平均最小抑菌浓度达到100ug/ml，氨苄西林霉素甚至超过200ug/ml。说明该菌株对链霉素和安卡西林霉素有较强的耐受能力。
[0041]
表2 6种抗生素对ahn65的最小抑菌浓度(ug/ml)
[0042][0043]
2.对盐度的耐受性
[0044]
按照实施例3制备ahn65的菌悬液，按2％的接种量(v/v)分别接种于添加nacl质量
分数为1％、3％、5％、7％和9％的isp2液体培养基(装液量50ml/500ml)中，每个浓度3个平行，置于28℃，180rpm摇床振荡培养，调整初始od600吸光度值在0.1左右，间隔2h取样测定菌液在不同时间的od600吸光度值，以未接菌的液体培养基作为空白对照。根据菌株在相应盐浓度下培养前后菌数的od值变化判定其耐盐性能。结果显示(图4)，在氯化钠质量浓度0-5％条件下，菌株ahn65的生长状况良好，生长趋势基本一致，添加不同质量浓度的氯化钠对菌株的生长具有先促进后抑制的作用，当氯化钠质量浓度1％时，放线菌的od600最高达到最大值，菌体在7％氯化钠质量浓度下仍有一定的生长量，而当氯化钠质量浓度达到9％时，菌体生长才完全被抑制。以上结果表明，菌株ahn65具有良好的盐耐受性，在1％-5％氯化钠质量浓度条件下生长良好。
[0045]
3.紫外照射稳定性
[0046]
按照实施例3制备ahn65的菌悬液，取2ml加入无菌离心管中，以不接菌的空白培养基为对照。样品置于30w紫外灯管正下方10cm处辐照，时间梯度设置0、10、20、30、40、50、60min，辐照时离心管不加盖。将辐射后的菌悬液倍比稀释后取100μl涂平板，设102个/ml，103个/ml，104个/ml三个梯度，每个稀释度3个重复，28℃培养48h后计数。所有辐照操作均在暗室中进行。结果显示(图5)，经照射后，菌株浓度呈现先下降后上升的趋势，菌株在60min的照射时间下仍可以存活下来，说明菌株具有较强的抗紫外辐射能力，对于紫外线表现出比较强的抗性。
[0047]
实施例5 ahn65菌株的无菌发酵滤液对ph的耐受性及对稻瘟病病菌菌丝生长的影响
[0048]
1.ahn65菌株的无菌发酵滤液对ph的耐受性
[0049]
按照实施例3配制ahn65菌悬液，设置初始ph值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的isp2液体培养基，按2％的接种量将菌株接种于不同ph值的isp2培养液中，每个ph重复3次，28℃，180rpm培养7天，以未接菌的液体培养基作为空白对照。收集发酵液，10000rpm离心10min，称量沉淀测生物量，上清液经过0.22μm无菌微孔滤膜过滤，取100μl无菌滤液加入isp2固体培养基上离稻梨孢菌饼中心2.5cm处的牛津杯中，进行抑菌试验。每处理重复3次，28℃恒温培养7d，测量病原菌菌落半径，并计算抑菌率。拮抗菌株抑菌率(％)＝(对照组菌落半径－处理组菌落半径)/(对照组菌落半径－菌饼半径)
×
100。结果见图6。ahn65在初始ph4的酸性条件下不能生长，在ph5-6的培养基中能缓慢生长，抑菌活性也较低，而在ph7-9的条件下能快速生长，ph9条件下获得的生物量最大，可达1253.67mg，且发酵液抑菌活性也最高。但该菌株在ph7-9的条件下的生物量和抑菌活性经spss19.0单因素duncan(d)分析，无显著性差异。
[0050]
2.ahn65菌株的无菌发酵滤液对稻瘟病病菌菌丝生长的影响
[0051]
在ph7的isp2培养液中培养ahn65，7天后收集发酵滤液。采用平板对峙试验检测ahn65发酵滤液对稻瘟病菌的抑菌活性，在直径为90mm的isp2培养基中心位置接种稻瘟病菌dn的新鲜菌饼，然后在距离菌饼中心3cm处呈120
°
用无菌牙签接种放线菌菌株，设无菌株处理为对照，每处理重复3次，28℃恒温培养7d，测量病原菌菌落半径，并计算抑菌率。结果见表3。ahn65对稻瘟病病原菌dn表现出较高的抑菌活性，抑菌率超过50％。
[0052]
表3 ahn65对稻瘟病病原菌dn的抑菌率
[0053][0054]
实施例6 ahn65分泌促生长因子的定性检测和定量分析
[0055]
1.菌株固氮能力检测
[0056]
将菌株的单个孢子点接种于阿须贝无氮固体培养基上生长，并再次划线接种至新的阿须贝培养基上进行传代培养，每1代培养7d，连续传代5次，观察菌株的生长情况。
[0057]
2.菌株解不溶性钾水平检测
[0058]
菌株进行活化后，挑取单个孢子接种至50ml亚历山鲍罗夫液体培养基中，以未接种的培养基作空白对照，28℃、180rpm振荡培养7d。发酵液4℃、10 000rpm离心10min，收集上清液，利用火焰分光光度计测定发酵上清液中的有效钾含量。
[0059]
3.菌株产铁载体水平检测
[0060]
将菌株接种于mkb液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养7d。发酵液10 000rpm离心10min，收集上清液。分别取3ml上清液与3ml cas检测液充分混匀，静置1h后，以超纯水作对照调零，采用分光光度计测定溶液在630nm处的吸光值(as)，以未接种mkb液体培养基代替样品获得的吸光值作为参比值(ar)，以铁载体相对表达量和as/ar比值来评估菌株产铁载体水平。菌株铁载体的相对表达量计算公式为：[(ar-as)/ar]
×
100。
[0061]
4.菌株分泌iaa水平检测
[0062]
菌株，接种至0.6ml lb培养液/1.5ml ep管中，28℃、900rpm振荡培养24h。取上述培养液4℃、10 000rpm离心10min，收集上清液。采用植物iaa试剂盒(上海酶联生物有限公司)，按试剂盒说明处理上清液，并在酶标仪(multiskanskyhigh，thermo fisher scientific)下检测其在450nm处的吸光值。根据标准iaa的浓度和吸光度值绘制标准曲线，获得线性方程，根据线性方程计算不同菌株上清液中的iaa含量(表4)。
[0063]
表4菌株ahn65的促生长因子水平
[0064][0065][0066]
可见，菌株具有良好的固氮、解钾、产铁和产iaa能力。
[0067]
所用阿须贝(ashby)无氮固体培养基：葡萄糖10g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，caso4·
2h2o 0.1g，caco
3 5g，nacl 0.2，琼脂15-20g，去离子水1000.0ml，ph 7.0。
[0068]
亚历山鲍罗夫培养基：蔗糖5.0g，na2hpo
4 2.0g，mgso4·
7h2o 0.5g，fecl
3 5.0mg，caco
3 0.1g，钾长石粉1.0g，琼脂18.0g，去离子水1000.0ml，ph 7.0～7.5。
[0069]
cas检测平板(100ml)：20％葡萄糖溶液1ml，10％酪蛋白氨基酸3ml，1m mol/l cacl20.1ml，1m mol/l mgso
4 2ml，染液10ml，盐溶液10ml，水+琼脂(1.8％)74ml。
[0070]
cas染色液的配制(200ml)：a液：铬天青(cas)0.12g溶于100ml双蒸水中，并与
1mmol/l fecl3溶液20ml混匀，得溶液a共120ml，b液：十六烷基三甲基溴化铵(hdtma/ctab/ctmab/htab)0.15g溶于80ml双蒸水中得溶液b。将a液缓慢加入b液中，充分混匀。
[0071]
磷酸盐缓冲液(100ml)：na2hpo4·
12h2o 2.427g，nah2po4·
2h2o 0.590g，kh2po
4 0.075g，nh4cl 0.250g，nacl 0.125g，双蒸水100ml，ph 6.8，使用时稀释10倍。
[0072]
吲哚乙酸(50mg/ml)：5g iaa，少量无水乙醇溶解，100ml水配制。
[0073]
salkowski比色液：35％ hclo
4 50ml，0.5mol/l fecl
3 1ml，于使用前混合摇匀，避光保存。
[0074]
实施例7菌株对水稻的促生效果研究
[0075]
1.菌悬液制备
[0076]
刮取ahn65的孢子粉，用0.5％的吐温水溶解，调节成适宜浓度(108cfu/ml)。
[0077]
2.水稻种子的消毒与催芽
[0078]
挑选完整饱满的水稻种子(品种为晶两优华占)，在小烧杯中加入纯水将种子浸没并保持30min。剔除空秕粒后，用75％的乙醇表面消毒5min，1％ naclo浸泡5min，再用无菌水清洗3-5次。装入烧杯中加入无菌水浸没水稻种子，于30℃催芽1d。
[0079]
3.水稻种子的促萌发试验
[0080]
以无菌水为对照(对照组)，将催芽1d的水稻种子在菌悬液中浸泡1h后置于装有湿润滤纸的无菌培养皿中，于人工气候培养箱中30℃、相对湿度70％、光暗比16:8条件下培养，注意补充水分，保持滤纸湿润。每个培养皿30粒种子，重复3次，培养5d后观察并统计种子萌发率。发芽率＝发芽的种子数/供试的种子数
×
100％。结果如表5所示，ahn65浸种处理后，种子萌发率比对照组增加27.87％，这表明菌株能在一定程度上促进水稻种子晶两优华占的萌发。
[0081]
表5微生物处理对水稻种子萌发的影响
[0082][0083]
4.水稻植株的促生试验
[0084]
分别采用水培、盆栽、大田试验三种方式检测菌株对水稻植株的促生效果。水稻种子的浸种和催芽按上述方法进行，待芽长至0.5cm-1cm后，移栽至水培盒或盆栽盆中。
[0085]
水培试验采用hoagland营养液进行培养，取发芽的种子移栽至平铺了塑料网格并装满hoagland营养液的水培盒中，重复3次，于人工气候培养箱中25℃、相对湿度70％、光暗比16:8条件下培养，3d更换一次营养液，13d和21d后分别测定各处理水稻幼苗的根长和株高，用以说明促生作用。结果显示(表6)，菌株的浸种处理后，水稻的根长和茎长均高于对照，而且在21天对根长和茎长影响比7天影响更显著，对根长和茎长的提高率达到39.60％和15.80％。
[0086]
表6ahn65浸种处理对水稻根长和茎长的影响
[0087][0088]
hoagland营养液：ca(no4)
2 0.8207g，硝酸钾0.5056g，mgso4·
7h2o 0.6162g，kh2po40.2722g，铁盐溶液2ml，微量元素溶液1ml，琼脂0.3％，去离子水1000.0ml。
[0089]
盆栽试验在装有4.5kg灭菌土(蛭石:土＝1:2)的盆栽盆(外径30cm
×
底径18cm
×
高20cm)中进行，每盆播种6棵水稻幼苗，重复3次，以无菌水浸种的水稻幼苗作空白对照。自然状态培养，分别在30d和60d，统计水稻植株根长、株高、分蘖数，以及地上、地下部分的干湿重。试验结果(表7)：ahn65浸根处理后，水稻植株在培养的第30-60d，根长、茎长、分蘖数均显著高于对照，30d时，ahn65处理后的水稻根长、茎长和分蘖数分别比对照增加18.45％、20.36％和27.59％，根湿重和茎湿重分别比对照增加36.04％和12.23％；60d时，ahn65处理后的根长、茎长和分蘖数分别比对照增加12.01％、18.00％和16.00％，说明菌株的处理能显著促进水稻根的生长。
[0090]
表7微生物处理对盆栽水稻生长的影响
[0091][0092]
田间试验地点选在湖南省益阳市泥江口镇，种子采用常规品种，制备ahn65菌悬液，将种子浸根后，分别在水稻分蘖期和抽穗期施用一次菌悬液。监控秧苗生长情况，统计单产量、千粒重、干湿重，并测定米镉含量。试验结果见表8和表9：菌株处理后，早稻水稻小区产量相对未接种的阴性对照组增加8.57％，米镉含量降低22.68％，晚稻水稻小区产量相对未接种的阴性对照组增加12.92％，米镉含量降低34.55％，成熟期穗颈瘟发病率15.37％，对稻瘟病的防效达到58.72％，这表明ahn65具有促进水稻生长和降镉的潜力。
[0093]
表8微生物处理对盆栽水稻生长的影响(早稻)
[0094][0095]
表9微生物处理对盆栽水稻生长的影响(晚稻)
[0096][0097]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一株水稻内生链霉菌(streptomyces sp.)ahn65，保藏编号为cctcc no.20221981。2.根据权利要求1所述的水稻内生链霉菌ahn65，其特征在于，该菌株最适培养温度为28℃，最适产孢温度为32℃；该菌株对链霉素的平均最小抑菌浓度达到100ug/ml，对氨苄西林霉素的平均最小抑菌浓度超过200ug/ml；该菌株在当氯化钠质量浓度1％时，od600达到最大值，菌体在7％的氯化钠质量浓度下仍有生长，当氯化钠质量浓度达到9％时，菌体生长被抑制；该菌株在60min的紫外照射时间下仍能存活。3.权利要求1或2所述的水稻内生链霉菌ahn65或其发酵液在防治水稻稻瘟病中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵液抑制稻瘟病菌的菌丝生长。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的水稻内生链霉菌ahn65在初始ph7-9的isp2培养基中生物量和发酵液抑菌活性高于初始ph4-6。6.权利要求1或2所述的水稻内生链霉菌ahn65或其发酵液在防治水稻穗颈瘟稻瘟病中的应用。7.权利要求1或2所述的水稻内生链霉菌ahn65或其发酵液在促进水稻生长中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的水稻内生链霉菌ahn65具有产铁载体、解钾、固氮和产iaa中的至少一种的作用。9.权利要求1或2所述的水稻内生链霉菌ahn65或其发酵液在水稻降镉中的应用。

技术总结
本发明公开了一株水稻内生链霉菌Ahn65及其应用。该菌株分类命名为：链霉菌(Streptomyces sp.)，保藏编号为：CCTCC NO.20221981。本发明的链霉菌Ahn65的发酵滤液能抑制稻瘟病菌的菌丝生长，且具有产铁载体、解钾、固氮等促生长性能，能显著促进水稻种子的萌发、根系发育和茎的生长。菌株处理后，早稻水稻小区产量增加8.57％，米镉含量降低22.68％，晚稻水稻小区产量增加12.92％，米镉含量降低34.55％，成熟期穗颈瘟发病率15.37％，该菌株对稻瘟病的防效达到58.72％。有很好的应用前景。有很好的应用前景。有很好的应用前景。


技术研发人员：杨华 胡展 付祖姣 郭照辉 肖蓉 伍善东 程伟 罗容珺 单士平 李一路
受保护的技术使用者：湖南省微生物研究院
技术研发日：2023.03.30
技术公布日：2023/7/12