基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法与流程

1.本发明涉及外泌体检测技术领域，尤其是涉及基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法。


背景技术：

2.外泌体是由不同类型细胞分泌到各种生物流体中的膜封闭纳米囊泡(30-150nm)，参与生理和病理过程，例如免疫调节和肿瘤促进。外泌体作为细胞间通讯的有效媒介，在肿瘤发生过程中发挥着关键作用。特别是，非小细胞肺癌(nsclc)相关的肿瘤细胞(例如，a549、h460、h1299等)的衍生外泌体携带多种表面标志蛋白(例如，上皮细胞粘附分子(epcam)和癌胚抗原(cea))，其表达水平的差异，导致与癌症发生和进展相关的不同表型。进一步考虑到循环血液中外泌体的高浓度(高达10
11
ml-1
)和稳定性，外泌体的表面蛋白标志物被研究认为是nsclc患者液体活检的有前途的生物标志物。如今，大多数关于外泌体表面蛋白的研究主要集中于通过质谱或蛋白质印迹发现生物标志物。由于缺乏可行和准确的分析工具，外泌体检测的灵敏度、特异性、稳定性等方面进展甚微。


技术实现要素：

3.为了解决上述问题，本发明的目的是基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法。
4.电化学传感分析已被开发用于简单检测疾病生物标志物，但在外泌体分析中存在不令人满意的特异性和敏感性。对于特异性，人类外泌体比细胞系衍生的外泌体具有更多的异质组成，因此很难获得外泌体上多种表面蛋白的综合信息。本发明中dna逻辑门能够对复杂的网络进行建模，并利用观测数据中的信息对实际样本进行准确估计和预测。在分析复杂样品中的电化学信号方面，dna逻辑门表现出优异的性能，因此成为该问题值得信赖的解决方案。对于敏感性，外泌体生物标记物的浓度在nsclc早期是超低的(例如，7ng/ml)。与之前使用单个信号的电化学检测不同，本发明中比率型电化学检测通过测量两个具有相反变化的氧化还原信号(即参考信号和响应信号)得到相对比率，从而提供更高的灵敏度和更宽的动态检测范围。此外，测量比率信号可以通过基于dna的扩增策略(例如，杂交链式反应(hcr))进一步调节，以实现对痕量靶标的更好分析性能。因此，本发明在dna“或”逻辑门的帮助下提出了一种比率电化学生物传感器，选择两种nsclc相关蛋白标记物cea和epcam作为外泌体的靶点，以实现对多种nsclc衍生外泌体的检测分析。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
6.本发明提供一种基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法，包括以下步骤：
7.(1)gnps-dna混合物溶液的制备：将适体链与阻断链孵育形成dna双链体；然后将dna双链体与gnps孵育形成gnps-dna混合物，然后将其分散在pbs中得到gnps-dna混合物溶液；
8.(2)外泌体的适体捕获：将外泌体添加到步骤(1)得到的gnps-dna混合物溶液中，适体链捕获外泌体，从而阻断链释放，收集释放的阻断链用于后续电化学检测；
9.(3)dna四面体的制备：将四个单链dna于tris-hcl缓冲液中混匀，加热后冷却至室温以杂交形成dna四面体；
10.(4)修饰电极的制备：将步骤(3)得到的dna四面体通过au-s键结合到金电极上，将其置于巯基乙醇中孵育以阻断其他物质的非特异性结合，然后用底物链与dna四面体接合，获得修饰电极；
11.(5)标准曲线的绘制：将步骤(2)得到的阻断链与步骤(4)得到的修饰电极孵育后洗涤，获得检测电极；将发夹dna滴到检测电极上孵育，然后进行电化学测量以检测亚甲基蓝信号强度和二茂铁信号强度，并以二茂铁信号强度/亚甲基蓝信号强度作为比率强度，绘制标准曲线；
12.(6)外泌体含量的检测：将待测外泌体样品添加到步骤(1)得到的gnps-dna混合物溶液中，收集阻断链，将阻断链与步骤(4)到的修饰电极孵育后洗涤获得检测电极；将发夹dna滴到检测电极上孵育，然后进行电化学测量以检测亚甲基蓝信号强度和二茂铁信号强度，并获得比率强度，将该比率强度代入步骤(5)的标准曲线，得到外泌体含量；
13.其中，适体链为apt1和apt2，apt1的核苷酸序列为seq id no.1，其5’端修饰有巯基，apt2的核苷酸序列为seq id no.2，其5’端修饰有巯基；阻断链为b1和b2，b1的核苷酸序列为seq id no.3，b2的核苷酸序列为seq id no.4；dna双链体为apt1-b1和apt2-b2；gnps-dna混合物为gnps-apt1-b1和gnps-apt2-b2；外泌体捕获完成后获得gnps-apt1-外泌体和gnps-apt2-外泌体；单链dna分别为d1、d3、d4和d5，或，d2、d3、d4和d5，d1的核苷酸序列为seq id no.5，d2的核苷酸序列为seq id no.6，d3的核苷酸序列为seq id no.7，其5’端修饰有巯基，d4的核苷酸序列为seq id no.8，其5’端修饰有巯基，d5的核苷酸序列为seq id no.9，其5’端修饰有巯基；dna四面体包括t1和t2；底物链为s1-mb和s2-mb，s1的核苷酸序列为5
’‑
aactcgcc-3’，s2的核苷酸序列为5
’‑
gacgcatt-3’；修饰电极为金电极-t1-s1-mb和金电极-t2-s2-mb；发夹nda为h1-fc和h2-fc，h1的核苷酸序列为seq id no.10，h2的核苷酸序列为seq id no.11。
14.在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，适体链与阻断链的摩尔比为1：2，适体链和阻断链孵育时间为1h，温度为37℃。
15.在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，dna双链体与金纳米颗粒的体积比为1：10，dna双链体与gnps孵育时间为12h，温度为37℃。
16.在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，gnps-dna混合物分散前用nacl进行老化处理来增加其核苷酸的负载，然后离心去除未耦联的dna双链体。
17.在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，添加到gnps-dna混合物溶液中的外泌体浓度不同。
18.在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，四个单链dna的摩尔量比值为1：1：1：1，加热温度为95℃，反应时间为5min。
19.在本发明的一个实施方式中，步骤(4)中，dna四面体与底物链的摩尔比为1：1。
20.在本发明的一个实施方式中，步骤(5)中，阻断链与修饰电极孵育时间为1h，温度为37℃。
21.在本发明的一个实施方式中，步骤(5)中，发夹dna与检测电极孵育时间为1.5h，温度为37℃。
22.在本发明的一个实施方式中，步骤(5)中，标准曲线的绘制过程中，以比率强度为纵坐标，以外泌体的数量为横坐标。
23.本发明的原理如下：
24.对于信号输入，dna“或”逻辑门被设计用于外泌体表面蛋白(cea和epcam)的捕获，以获得精准全面的生物标志物信息。具体来说，金纳米颗粒(gnps)被特定适体(apt1/apt2)功能化并与阻断链(b1/b2)部分序列结合，其中特定适体分别靶向捕获外泌体表面蛋白cea和epcam，以形成dna“或”逻辑门。其中，阻断链的序列由两部分组成：一部分序列与适体序列互补，另一部分序列与dna四面体的引物链互补。与阻断链相比，设计的适体链与外泌体具有更高的亲和力，将外泌体含量转化为释放的b1/b2水平。
25.对于信号输出，将形状可控的dna四面体通过au-s键结合在金电极表面，以检测信号链的特异性结合，避免空间位阻和分子纠缠。以上电极进一步与底物链(s1-mb/s2-mb)孵育，其中mb被引入作为参考信号。一旦阻断链与引物链杂交并取代底物链，mb信号将降低。参考信号(i
mb
)的衰减程度可以用作外泌体标志物的指示读数。在检测过程中，来自外泌体表面的单一生物标志物或两个生物标志物的存在导致电化学信号(i
fc
/i
mb
)输出。只有当不存在任何生物标志物时，dna“或”逻辑门才不提供电化学信号输出。
26.对于信号放大，外泌体表面识别生物标志物的痕量丰度为直接检测带来了障碍。因此，本发明设计了通过hcr的级联放大来增强fc信号(i
fc
)，fc被引入作为响应信号。其中，响应信号fc的增加伴随着参考信号mb的下降，进一步放大了比率电流(i
fc
/i
mb
)，以准确检测痕量外泌体。在针对不同外泌体生物标志物(例如，乳腺癌的her2)的检测方案中，可以通过简单地改变适体序列和相应的阻断链来完成操作。因此，通过在检测中改变多个适配体，可以实现普遍的标志物检测。
27.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
28.(1)本发明将dna“或”逻辑门用于外泌体表面蛋白(cea和epcam)的多重检测，以获得精确医学的全面肿瘤信息，解决了现有技术对单个生物标志物检测难以达到的特异性以及检测信息的全面性的问题。
29.(2)比率传感检测提高了检测的灵敏度和稳定性。由于能够放大信号变化并消除外部因素的波动，比率生物传感器来检测多种生物标志物具有很大优势。单信号生物传感器显示的最大dpv响应仅在30％以内(i
mb
和i
fc
的电流变化分别为29.4％和20.5％)。相比之下，本发明构建的比率式生物传感器显示出i
mb
的减少和i
fc
的增加，促进了检测的灵敏性，信号比(i
fc
/i
mb
)的变化增加了58.9％。此外，与单信号生物传感器(i
mb
的cv＝8.9％，i
fc
的cv＝5.5％)相比，从比率生物传感器获得的数据具有更高的再现性和准确性，变异系数(cv)较低，为3.5％。因此，本发明通过引入参考信号来构建比率测量生物传感器，以提高生物标志物检测的灵敏度和检测的稳定性(较低的cv＝3.5％)来解决当前的挑战。
附图说明
30.图1为基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法原理示意图。(a)外泌体被特定适配体捕获；(b)将比率型电化学检测与dna“或”逻辑门耦合用于外泌体检测；
31.图中缩写说明：金纳米颗粒(gnp)；适配体(apt1/apt2)；阻断链(b1/b2)；dna四面体(t1/t2)；参比电极(re)；对电极(ce)；工作电极(we)。
32.图2为外泌体、gnp和dna四面体的表征图。(a)外泌体的透射电子显微镜(tem)图像和(b)纳米颗粒流式细胞术(nanofcm)表征；(c)室温下分散在水中的金纳米颗粒(gnps)的tem图像和(d)动态光散射分析；(e)gnps和适体功能化gnps(gnps-dna)的紫外-可见光吸收光谱和(f)zata电位结果；(g)dna四面体的组装过程(t1/t2)；(h)t1/t2的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(由d1/d2、d3、d4和d5形成)。
33.图3为检测方法的构建和可行性验证。(a)电化学阻抗谱和(b)循环伏安曲线包括裸电极(曲线a)、裸电极+t1/t2(曲线b)、裸电极+t1/t2+s1-mb/s2-mb(曲线c)、裸电极+t1/t2+s1-mb/s2-mb+b1/b2(曲线d)和裸电极+t1-t2+s1-mb/s2-mb+b1/b2+h1-fc/h2-fc(曲线e)；(c)不同实验条件下的微分脉冲伏安(dpv)曲线；(d)i
mb
和i
fc
在不同信号输入下的dpv峰值电流；(e)在存在或不存在上皮细胞粘附分子(epcam)和癌胚抗原(cea)的情况下验证“或”逻辑门；(f)适体捕获外泌体的孵育时间的优化，外泌体的浓度分别设置为105、2
×
106和2
×
108个/μl；(g)用于外泌体检测的单个mb信号(i
mb
)、单个fc信号(i
fc
)和(h)i
fc
/i
mb
比值信号，外泌体的浓度分别设置为103、105和107个/μl。
34.图4为外泌体的超灵敏检测。(a)用于外泌体检测的生物传感器与传统nanofcm的比较；(b)测定外泌体检测对典型干扰物质的选择性，包括1ku/ml的ca125、1mg/ml的nse、pro grp、scca和cyf21-1；(c)不同浓度的外泌体的dpv分析范围为10
8-102个/μl(从a到g)；(d)比率测量强度和外泌体浓度的对数之间的线性校准曲线；(e)在相同浓度的外泌体(2
×
103个/μl)下，从5个工作电极获得dpv响应；(f)在相同浓度的外泌体(107个/μl)下，两周内获得的dpv反应；(g)在不同类型的nsclc细胞系(a549、h460、h1299、h1975、h2030和calu-1细胞)中分析了外泌体的表达；(h)i
fc
/i
mb
和a549细胞数量之间的比率强度之间的线性相关性，范围为10
3-107个。(i)以103/105个/μl的外泌体最终浓度掺入三个临床血清样本中测得的比率强度。
35.其中，误差条指的是从三个独立实验中获得的标准推导。
具体实施方式
36.本发明提供一种基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法，包括以下步骤：
37.(1)gnps-dna混合物溶液的制备：将适体链与阻断链孵育形成dna双链体；然后将dna双链体与gnps孵育形成gnps-dna混合物，然后将其分散在pbs中得到gnps-dna混合物溶液；
38.(2)外泌体的适体捕获：将外泌体添加到步骤(1)得到的gnps-dna混合物溶液中，适体链捕获外泌体，从而阻断链释放，收集释放的阻断链用于后续电化学检测；
39.(3)dna四面体的制备：将四个单链dna于tris-hcl缓冲液中混匀，加热后冷却至室温以杂交形成dna四面体；
40.(4)修饰电极的制备：将步骤(3)得到的dna四面体通过au-s键结合到金电极上，将其置于巯基乙醇中孵育以阻断其他物质的非特异性结合，然后用底物链与dna四面体接合，获得修饰电极；
41.(5)标准曲线的绘制：将步骤(2)得到的阻断链与步骤(4)得到的修饰电极孵育后洗涤，获得检测电极；将发夹dna滴到检测电极上孵育，然后进行电化学测量以检测亚甲基蓝信号强度和二茂铁信号强度，并以二茂铁信号强度/亚甲基蓝信号强度作为比率强度，绘制标准曲线；
42.(6)外泌体含量的检测：将待测外泌体样品添加到步骤(1)得到的gnps-dna混合物溶液中，收集阻断链，将阻断链与步骤(4)到的修饰电极孵育后洗涤获得检测电极；将发夹dna滴到检测电极上孵育，然后进行电化学测量以检测亚甲基蓝信号强度和二茂铁信号强度，并获得比率强度，将该比率强度代入步骤(5)的标准曲线，得到外泌体含量；
43.其中，适体链为apt1和apt2，apt1的核苷酸序列为seq id no.1，其5’端修饰有巯基，apt2的核苷酸序列为seq id no.2，其5’端修饰有巯基；阻断链为b1和b2，b1的核苷酸序列为seq id no.3，b2的核苷酸序列为seq id no.4；dna双链体为apt1-b1和apt2-b2；gnps-dna混合物为gnps-apt1-b1和gnps-apt2-b2；外泌体捕获完成后获得gnps-apt1-外泌体和gnps-apt2-外泌体；单链dna分别为d1、d3、d4和d5，或，d2、d3、d4和d5，d1的核苷酸序列为seq id no.5，d2的核苷酸序列为seq id no.6，d3的核苷酸序列为seq id no.7，其5’端修饰有巯基，d4的核苷酸序列为seq id no.8，其5’端修饰有巯基，d5的核苷酸序列为seq id no.9，其5’端修饰有巯基；dna四面体包括t1和t2；底物链为s1-mb和s2-mb，s1的核苷酸序列为5
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aactcgcc-3’，s2的核苷酸序列为5
’‑
gacgcatt-3’；修饰电极为金电极-t1-s1-mb和金电极-t2-s2-mb；发夹nda为h1-fc和h2-fc，h1的核苷酸序列为seq id no.10，h2的核苷酸序列为seq id no.11。
44.在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，适体链与阻断链的摩尔比为1：2，适体链和阻断链孵育时间为1h，温度为37℃。
45.在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，dna双链体与金纳米颗粒的体积比为1：10，dna双链体与gnps孵育时间为12h，温度为37℃。
46.在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，gnps-dna混合物分散前用nacl进行老化处理来增加其核苷酸的负载，然后离心去除未耦联的dna双链体。
47.在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，添加到gnps-dna混合物溶液中的外泌体浓度不同。
48.在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，四个单链dna的摩尔量比值为1：1：1：1，加热温度为95℃，反应时间为5min。
49.在本发明的一个实施方式中，步骤(4)中，dna四面体与底物链的摩尔比为1：1。
50.在本发明的一个实施方式中，步骤(5)中，阻断链与修饰电极孵育时间为1h，温度为37℃。
51.在本发明的一个实施方式中，步骤(5)中，发夹dna与检测电极孵育时间为1.5h，温度为37℃。
52.在本发明的一个实施方式中，步骤(5)中，标准曲线的绘制过程中，以比率强度为纵坐标，以外泌体的数量为横坐标。
53.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
54.下述实施例中，若无特殊说明，所用试剂均为市售试剂，所用检测手段及方法均为本领域常规检测手段及方法。
no.4)在37℃下孵育1小时，以形成100μl的apt1-b1和apt2-b2双链；然后以1：10体积比将1μm的dna双链体的混合物(apt1-b1和apt2-b2双链)与上述gnps在37℃下孵育12小时，以形成gnps-dna结构，然后用2m nacl进行老化处理来增加核苷酸的负载，该nacl(10μl)每20分钟添加一次，添加6次后达到0.1m的最终浓度，得到混合物；随后，将混合物离心(10000rpm，10min)以去除未耦联的双链dna，并将剩余的gnps-dna混合物(gnps-apt1-b1和gnps-apt2-b2)分散在pbs(1100μl，ph 7.4)中。
68.(4)外泌体的适体捕获
69.将不同浓度(102个/μl-1
、103个/μl-1
、104个/μl-1
、105个/μl-1
、106个/μl-1
、107个/μl-1
、108个/μl-1
)的外泌体(20μl)分别添加到步骤(3)得到的gnps-dna混合物(100μl)中1小时，适体链(apt1/apt2)捕获外泌体后，阻断链(b1/b2)被释放到溶液中。离心后，分别收集释放的阻断链(b1/b2)进一步用于电化学实验。
70.对于对照实验，gnps用一条适体链和对照链(c，其中，c的核苷酸序列为seq id no.12，其5’端修饰有巯基)修饰成具有apt1/c或apt2/c的gnps-dna结构(gnps-apt1-b1和gnps-c，或，gnps-apt2-b2和gnps-c)。在外泌体捕获之后，收集相应的释放的b1或b2用于进一步的电化学检测。
71.(5)dna四面体的制备
72.dna四面体(t1/t2)通过退火工艺与四个单链dna(d1/d2、d3、d4和d5，其中，d1的核苷酸序列为seq id no.5，d2的核苷酸序列为seq id no.6，d3的核苷酸序列为seq id no.7，其5’端修饰有巯基，d4的核苷酸序列为seq id no.8，其5’端修饰有巯基，d5的核苷酸序列为seq id no.9，其5’端修饰有巯基)组装。
73.分别将摩尔量为1：1：1：1的d1、d3、d4和d5，和，摩尔量为1：1：1：1的d2、d3、d4和d5，混合在20mm tris-hcl缓冲液(ph 8.0)中。将混合物(5μm,100μl)加热至95℃，反应5分钟，然后缓慢冷却至室温使其完全杂交，直到形成稳定的结构，得到dna四面体(t1/t2)。
74.dna四面体(t1/t2)的表征：进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)分析以表征dna四面体制造。具体方法如下：将10μl样品1(5μm，d1)、样品2(5μm，d2)、样品3(5μm，d1+d3)、样品4(5μm，d1+d3+d4)、样品5(5μm，d1+d3+d4+d5)和样品6(5μm，d2+d3+d4+d5)。在0.5
×
三硼酸edta(ph 8.0)中，在100v恒定电压下进行1.5小时的电泳。之后，使用凝胶成像分析仪扫描凝胶。
75.(6)修饰电极的制备
76.在室温下用5μm步骤(5)制备得到的四面体dna(t1/t2，30μl)通过au-s键修饰电极过夜。随后将其在1mm巯基乙醇(mch，150μl)中孵育0.5小时以阻断非特异性结合位点，随后用5μm底物链(s1-mb/s2-mb，30μl；其中，s1的核苷酸序列为5
’‑
aactcgcc-3’，s2的核苷酸序列为5
’‑
gacgcatt-3’)与四面体dna反应1小时，获得修饰电极；
77.(7)标准曲线的绘制
78.分别将150μl步骤(4)收集到的阻断链(b1/b2)与步骤(6)得到的修饰电极在37℃孵育1小时，然后用pbs(10mm，ph 7.4)洗涤，得到检测电极；将30μl含有2μm发夹dna(h1-fc/h2-fc，其中，h1的核苷酸序列为seq id no.10，h2的核苷酸序列为seq id no.11)的混合物滴到获得的电极上。将反应溶液在37℃下孵育1.5小时，进行电化学测量以检测亚甲基蓝信号强度和二茂铁信号强度，并以二茂铁信号强度/亚甲基蓝信号强度作为比率强度，绘制标
准曲线。分别制备对照实验并在相同条件下进行。所有实验重复三次。
79.(8)统计分析
80.本实施例中的所有统计分析(包括显著性分析等)均在ibm spss统计软件(26.0.0版)上进行。使用双尾student-t检验计算显著性差异，所有显著性水平设置为5％。进行了三次独立实验，数据显示为平均值
±
sd(n＝3)。使用origin 2021软件进行绘图和图表。
81.结果讨论：
82.(1)检测原理
83.cea和epcam是在肺癌外泌体表面富集的双重生物标志物，被选为实现这一目标的特异靶点。1)构建用于信号输入的dna“或”逻辑门(图1a)：将cea和epcam适体链(apt1/apt2)与阻断链(b1/b2)孵育形成dna双链体，dna双链体与gnps孵育形成gnps-dna混合物；外泌体竞争性结合适体链，并释放阻断链；2)触发dna四面体(t1/t2)进行信号输出，并引入杂交链式反应(hcr)进行信号放大(图1b)：dna四面体通过au-s键结合到金电极上，再利用底物链与dna四面体接合，获得修饰电极，进一步将上述释放的阻断链与修饰电极孵育，阻断链与dna四面体的引物链(d1/d2)杂交，并取代底物链(s1-mb/s2-mb)，导致亚甲基蓝信号(mb)强度(i
mb
)降低；进一步的，释放的阻断链(b1/b2)通过发夹dna(h1-fc/h2-fc)激活hcr反应以产生长的双链dna，导致二茂铁信号(fc)强度(i
fc
)的显著增强。最后，fc和mb信号(i
fc
/i
mb
)的比率强度被用作信号输出，对应于外泌体的含量。
84.(2)外泌体、纳米金(gnp)和dna四面体的表征
85.通过使用商业提取试剂盒，从临床血清生物样本中分离出大小在30至150nm之间的外泌体。在外泌体的透射电子显微镜(tem)图像中观察到扁平的圆形(图2a)。本方法还通过纳米流式细胞术检测了从a549细胞中提取的外泌体的尺寸参数。获得的形态学显示平均大小为～100nm的外泌体(图2b)，与tem结果一致，证实成功提取外泌体。
86.gnps在适配体识别和捕获过程中至关重要，如tem图像所示，观察到均匀分布的球体，其平均直径为13
±
3nm(图2c)。在动态光散射实验中，gnp显示出18
±
3nm的平均流体动力学尺寸(图2d)，符合tem颗粒尺寸特征。在典型的紫外-可见吸收光谱中，gnp的光吸收带出现在520nm。260nm处的新吸收峰是核酸复合物的一个特征带，验证了gnps与巯基适配体dna的满意功能化(图2e)，关于巯基基团与金之间的结合亲和力。此外，gnps带负电荷，zeta电位为31
±
3mv(图2f)，有利于适配体的分布并防止非特异性结合。gnps的电位显著降低至50
±
2mv(p《0.05)，也证实了其被带正电的适体进行了表面修饰。
87.dna四面体是电化学反应的基本结构，通过退火过程与四个单链寡核苷酸(t1/t2分别为d1/d2、d3、d4和d5)组装(图2g)。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳研究了dna四面体的自组装过程(page，图2h)。page结果中从左至右的泳道(对应于泳道1至5/6)表明自组装过程中分子量逐步增加。如泳道5和6所示，通过dna寡核苷酸之间的连续杂交制备dna四面体。特别是，由于迁移率降低，与dna结构的水动力学尺寸显著增加一致，出现了连续的条带。因此，分子量和迁移率的增加一起验证了dna四面体在we上的简单自组装。
88.(3)电化学检测的构建及其可行性验证
89.通过电化学阻抗谱和循环伏安法验证了此方法的逐步构建过程。如图3a所示，裸电极的电子转移电阻(ret)约为72ω(曲线a)。在电极上连续组装t1/t2和mch后，由于dna四面体偶联后的电子转移受阻，ret显著增加(曲线b)。当s1-mb/s2-mb附着到电极表面时，ret
值进一步增加(曲线c)，这可能归因于[fe(cn)6]
3-/4-与dna骨架之间的排斥反应。在b1/b2与t1/t2杂交后，s1-mb/s2-mb被释放的b1/b2替代后，ret值继续增加(曲线d)。在h1-fc和h2-fc的存在下，ret值显著增加(曲线e)，这意味着在电极上启动了hcr扩增响应。还使用电流变化的cv测量研究了比率型检测方法的构建步骤。如图3b所示，[fe(cn)6]
3-/4-的伏安图在电极的修饰期间逐渐改变。所有电化学性能表明该基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法的成功制造，有望同时分析多种外泌体表面蛋白。
[0090]
本实施例还评估了基于比率型电化学“或”逻辑门的方法用于外泌体检测的可行性。如图3c所示，在用dna四面体(t1/t2)修饰后，在没有释放的b1/b2、s1-mb/s2-mb和h1-fc/h2-fc的情况下几乎没有观察到任何信号，表明大多数信号没有固定在电极上。一旦s1-mb/s2-mb的参考信号出现在反应体系中，在-0.267v处观察到明显的信号，表明mb通过杂交嵌入电极表面。当cea或epcam的外泌体表面蛋白被apt1或apt2捕获时，相应的阻断链(b1或b2)被释放到电解质中，并因此用作下游传感的信号输入(分别为input1或input2)。在释放的阻断链(b1、b2和b1/b2)和h1-fc/h2-fc的存在下，电化学信号在+0.278v处的fc信号进一步增强，在-0.267v时的mb信号降低。在不同的输入条件下，fc信号(i
fc
)和mb信号(i
mb
)的相应信号强度在图中进行了说明(图3d和e)。值得注意的是，i
fc
/i
mb
的电流比(用作“output”)显著增加，这是因为目标外泌体诱导的两种信号以相反的方式变化。因此，本发明构建的比率型检测不仅能够内置校正分析提高检测的稳定性，还可以通过dna的hcr扩增反应提高检测的灵敏度。
[0091]
现有技术通常设计用于单个生物标志物，难以描绘病理刺激下的全面画面。为了解决分析物的局限性，通常需要引入多种电化学活性物质或纳米结构。然而，缺乏敏感性和对环境条件的敏感性阻碍了上述电化学技术在临床上的普遍应用。由于能够放大信号变化并消除外部因素的波动，定量检测成为分析多种生物标志物的有效方法。在这项工作中，单信号检测显示的最大dpv响应仅在30％以内(i
mb
和i
fc
的电流变化分别为29.4％和20.5％，图3g)。相比之下，本方法构建的比率型检测方法显示出i
mb
的减少和i
fc
的增加(图3h)，促进了敏感检测，信号比(i
fc
/i
mb
)的变化增加了58.9％。此外，与单信号检测(i
mb
的cv＝8.9％，i
fc
的cv＝5.5％；图3g)相比，从比率型检测方法获得的数据具有更高的再现性和准确性，变异系数(cv)较低，为3.5％(图3h)。因此，此方法通过引入参考信号来构建比率型检测方法，以提高生物标志物检测的灵敏度和稳定性。
[0092]
(4)外泌体的超灵敏检测
[0093]
本发明所提出的比率型检测方法能够以准确、特异、灵敏、可重复和稳定的方式检测外泌体。为了检测准确度，本发明所提出的比率型检测方法对外泌体浓度的定量与通过常用的纳米流式细胞术方法测量的结果一致，pearson相关系数为0.917(图4a)。对于检测特异性，该结果显示出对外泌体较高的i
fc
/i
mb
信号响应(图4b)，并且不受人类血液中其他物质干扰(例如，神经元特异性烯醇化酶(nse)、鳞状细胞癌抗原(scca)、促胃泌素释放肽(pro-grp)、癌胚抗原125(ca125)、cyfra 21-1(cyf21-1)第19节，和三个碱基不匹配的适体(mis-3，包括mismatched1和mismatched 2，其中，mismatched 1的核苷酸序列为seq id no.13，其5’端修饰有巯基，mismatched 2的核苷酸序列为seq id no.14，其5’端修饰有巯基)。对于检测灵敏度，所提出的比率型检测方法在最佳实验条件下确定了不同外泌体的浓度变化(图4c)。在10
2-108个/μl-1
的宽线性范围内，电流强度比率i
fc
/i
mb
与外泌体浓度的对
数成线性关系((i
fc
/i
mb
＝0.504lgc
exosome
–
0.487，r2＝0.986)，检测限为15.1个/μl-1
。为了验证此方法的可重复性，本方法记录了同一外泌体浓度下(2
×
103μl-1
)，5次平行测量的电流强度，变异系数为4.8％(图4e)。对于检测稳定性的验证，电化学信号在储存一周后保持在88.1％，两周后保持77.8％(图4f)，表明检测方法的长期稳定性。
[0094]
在优化了比率型检测方法之后，验证了此方法在细胞培养基和真实生物样本中外泌体传感的可行性。首先分析了不同类型nsclc细胞系(a549、h460、h1299、h1975、h2030和calu-1细胞)中外泌体的表达量。与磷酸盐缓冲液对照实验相比，在nsclc细胞系中检测到比率强度显著增加(图4g)。接下来，选择a549细胞作为示例，以验证所提出的检测方法用于外泌体定量的能力。峰值电流比率与细胞对数呈线性相关，在10
3-107个细胞的范围内呈线性相关(图4h)。将外泌体掺入人血清中，浓度为103个/μl-1
和105个/μl-1
。比率型检测方法提供了90.1％-105.6％的平均回收率，cv在5.4％以内(图4i)，这与传统的纳米流式细胞术方法相当。
[0095]
与其他技术(例如荧光、表面等离子体共振和电化学发光)相比，所提出的检测方法在更宽的线性范围内显示出较低的检测限。本检测方法的优越灵敏度归因于比率检测和hcr信号放大。除了灵敏度性能外，所提出的方法还通过引入dna“或”逻辑门来同时检测两个表面蛋白靶标而显示出显著提高的特异性，提供了更全面的标志物信息。值得注意的是，不同信号强度表明外泌体在不同系统中的表达具有差异性(图4g)。因此，得出结论，比率型检测方法可以在实际生物样本中，实现精确、特异、灵敏、可重复和稳定的外泌体分析和定量。
[0096]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的解释，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)gnps-dna混合物溶液的制备：将适体链与阻断链孵育形成dna双链体；然后将dna双链体与gnps孵育形成gnps-dna混合物，然后将其分散在pbs中得到gnps-dna混合物溶液；(2)外泌体的适体捕获：将外泌体添加到步骤(1)得到的gnps-dna混合物溶液中，适体链捕获外泌体，从而阻断链释放，收集释放的阻断链用于后续电化学检测；(3)dna四面体的制备：将四个单链dna于tris-hcl缓冲液中混匀，加热后冷却至室温以杂交形成dna四面体；(4)修饰电极的制备：将步骤(3)得到的dna四面体通过au-s键结合到金电极上，将其置于巯基乙醇中孵育以阻断其他物质的非特异性结合，然后用底物链与dna四面体接合，获得修饰电极；(5)标准曲线的绘制：将步骤(2)得到的阻断链与步骤(4)得到的修饰电极孵育后洗涤，获得检测电极；将发夹dna滴到检测电极上孵育，然后进行电化学测量以检测亚甲基蓝信号强度和二茂铁信号强度，并以二茂铁信号强度/亚甲基蓝信号强度作为比率强度，绘制标准曲线；(6)外泌体含量的检测：将待测外泌体样品添加到步骤(1)得到的gnps-dna混合物溶液中，收集阻断链，将阻断链与步骤(4)到的修饰电极孵育后洗涤获得检测电极；将发夹dna滴到检测电极上孵育，然后进行电化学测量以检测亚甲基蓝信号强度和二茂铁信号强度，并获得比率强度，将该比率强度代入步骤(5)的标准曲线，得到外泌体含量；其中，适体链为apt1和apt2，apt1的核苷酸序列为seq id no.1，其5’端修饰有巯基，apt2的核苷酸序列为seq id no.2，其5’端修饰有巯基；阻断链为b1和b2，b1的核苷酸序列为seq id no.3，b2的核苷酸序列为seq id no.4；dna双链体为apt1-b1和apt2-b2；gnps-dna混合物为gnps-apt1-b1和gnps-apt2-b2；外泌体捕获完成后获得gnps-apt1-外泌体和gnps-apt2-外泌体；单链dna分别为d1、d3、d4和d5，或，d2、d3、d4和d5，d1的核苷酸序列为seq id no.5，d2的核苷酸序列为seq id no.6，d3的核苷酸序列为seq id no.7，其5’端修饰有巯基，d4的核苷酸序列为seq id no.8，其5’端修饰有巯基，d5的核苷酸序列为seq id no.9，其5’端修饰有巯基；dna四面体包括t1和t2；底物链为s1-mb和s2-mb，s1的核苷酸序列为5
’‑
aactcgcc-3’，s2的核苷酸序列为5
’‑
gacgcatt-3’；修饰电极为金电极-t1-s1-mb和金电极-t2-s2-mb；发夹nda为h1-fc和h2-fc，h1的核苷酸序列为seq id no.10，h2的核苷酸序列为seq id no.11。2.根据权利要求1所述的基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法，其特征在于，步骤(1)中，适体链与阻断链的摩尔比为1：2，适体链和阻断链孵育时间为1h，温度为37℃。3.根据权利要求1所述的基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法，其特征在于，步骤(1)中，dna双链体与金纳米颗粒的体积比为1：10，dna双链体与gnps孵育时间为12h，温度为37℃。4.根据权利要求1所述的基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法，其特征在于，步骤(1)中，gnps-dna混合物分散前用nacl进行老化处理来增加其核苷酸的负载，然后离心去除未耦联的dna双链体。5.根据权利要求1所述的基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法，其特征在
于，步骤(2)中，添加到gnps-dna混合物溶液中的外泌体浓度不同。6.根据权利要求1所述的基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法，其特征在于，步骤(3)中，四个单链dna的摩尔量比值为1：1：1：1，加热温度为95℃，反应时间为5min。7.根据权利要求1所述的基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法，其特征在于，步骤(4)中，dna四面体与底物链的摩尔比为1：1。8.根据权利要求1所述的基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法，其特征在于，步骤(5)中，阻断链与修饰电极孵育时间为1h，温度为37℃。9.根据权利要求1所述的基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法，其特征在于，步骤(5)中，发夹dna与检测电极孵育时间为1.5h，温度为37℃。10.根据权利要求1所述的基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法，其特征在于，步骤(5)中，标准曲线的绘制过程中，以比率强度为纵坐标，以外泌体的数量为横坐标。

技术总结
本发明涉及外泌体检测技术领域，尤其是涉及基于比率型电化学“或”逻辑门的外泌体检测方法。本发明首先构建了用于信号输入的DNA“或”逻辑门来捕获外泌体；然后触发DNA四面体进行信号输出，并引入杂交链式反应进行信号放大；最后以Fc和MB信号(I


技术研发人员：王佳谊 于永春 孟凡渝 黄琳 钮敏嘉
受保护的技术使用者：上海市胸科医院
技术研发日：2023.02.20
技术公布日：2023/7/12