一种微生物组合及其在抑制棉花黄萎病中的应用

1.本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种微生物组合及其在抑制棉花黄萎病中的应用。


背景技术：

2.棉花黄萎病是由棉花黄萎病病原菌(大丽轮枝菌)引起、发生在棉花的病害，是在棉花生产领域中危害最为严重的土传病害之一，给现有的棉花生产造成严重经济损失。由于病原菌所形成的休眠体微菌核可以在土壤中存活14年之久，所以通过轮作倒茬等传统防治手段收效甚微，而常年连作导致棉田病原菌积累，黄萎病发生日益严重。
3.目前利用生防微生物防治植物病害特别是土传植物病害是一种有效的防治措施，现有技术中也采用不同类型的抑制黄萎病的微生物进行黄萎病的防治，但是存在不同程度的缺陷，例如有的黄萎病生防菌株的防治效率较差，难以起到有效地防病效果。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种微生物组合及其在抑制棉花黄萎病中的应用。
5.第一方面，本发明提供一种微生物组合，包括：枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ncd-2。
6.枯草芽孢杆菌ncd-2(cgmcc1019)是一株对棉花黄萎病具有一定田间防效的生防菌株，田间防效在40～50％左右，其是一种已经公开的生防菌株。生防菌株的防治效果受到多种因素所影响，现有技术中对于棉花黄萎病的防治只关注靶标病原本身，忽视了复杂土壤环境中的生物及非生物因素对微生物菌剂的影响。本发明在对于棉花黄萎病防治的研究过程中发现，对于枯草芽孢杆菌ncd-2影响程度较大的因素在于土壤中镰刀菌酸的含量。枯草芽孢杆菌和尖刀镰孢菌是两种具有拮抗作用的微生物，现有技术中既公开了多种对尖刀镰孢菌有抑制作用的枯草芽孢杆菌，又公开了多种对于枯草芽孢杆菌有抑制作用的尖刀镰孢菌。而枯草芽孢杆菌ncd-2属于后者，其在防治棉花黄萎病中应用主要受到土壤中尖刀镰孢菌的影响。因此，本发明进一步采用对于尖刀镰孢菌具有抑制作用的贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌ncd-2进行复配，所得到的微生物组合对于棉花黄萎病的防治能力显著上升。
7.进一步地，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌b31。
8.本发明提供的枯草芽孢杆菌ncd-2和贝莱斯芽孢杆菌b31不仅仅基于贝莱斯芽孢杆菌b31对于尖刀镰孢菌的抑制作用，贝莱斯芽孢杆菌b31和枯草芽孢杆菌ncd-2之间不存在拮抗作用，而且共同使用时，贝莱斯芽孢杆菌b31可以促进枯草芽孢杆菌ncd-2在棉花根际的定殖，这进一步提升了两者的协同作用。
9.本发明提供枯草芽孢杆菌ncd-2(以下称ncd-2)和贝莱斯芽孢杆菌b31(以下称b31)复配得到的微生物组合，其中枯草芽孢杆菌ncd-2是一种已经公开的，通过微生物农药登记注册的微生物。贝莱斯芽孢杆菌b31经过生物保藏，具体的保藏信息如下：
10.保藏编号cgmcc no.24599；分类命名：贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编10010；保藏日期：2022年03月28日。
11.进一步地，所述枯草芽孢杆菌和所述贝莱斯芽孢杆菌的活菌数比例为1:(0.1～10)。
12.本发明进一步提供包含所述微生物组合或其发酵产物的菌剂。
13.进一步地，所述微生物组合的总活菌数为1
×
10
9～11
cfu/g。
14.进一步地，所述菌剂为液体菌剂、粉状菌剂、颗粒菌剂、浓缩冷冻菌剂或琼脂菌剂中的一种或多种。
15.第二方面，本发明提供一种生物肥料，所述生物肥料包括所述的微生物组合，或所述的菌剂。
16.本发明进一步提供所述的微生物组合，或所述的菌剂，或所述的生物肥料在抑制大丽轮枝菌中的应用。
17.本发明进一步提供所述的微生物组合，或所述的菌剂，或所述的生物肥料在抑制棉花黄萎病或棉花枯萎病中的应用。
18.本发明进一步提供所述的微生物组合，或所述的菌剂，或所述的生物肥料在提高棉花产量中的应用。
19.本发明具备如下有益效果：
20.本发明提供了一种由枯草芽孢杆菌ncd-2和贝莱斯芽孢杆菌复配而成的微生物组合，两者对于棉花黄萎病的防治具备一定协同效应，其对于棉花黄萎病的防治效果显著提升，单独的枯草芽孢杆菌ncd-2的田间防治效果在40％左右，而在复配贝莱斯芽孢杆菌之后，田间防治效果提升至70％以上，且持续时间长，这在棉花黄萎病防治领域有重要意义。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1是本发明实施例1提供的枯草芽孢杆菌b31和贝莱斯芽孢杆菌ncd-2的兼容性实验结果示意图。
23.图2是本发明实施例1提供的棉花黄萎病温室防治效果柱状图。
24.图3是本发明实施例1提供的棉花黄萎病温室防治效果示意图。
25.图4是本发明实施例1提供的棉花黄萎病田间防治效果示意图。
具体实施方式
26.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.实施例1
28.本发明提供枯草芽孢杆菌ncd-2(以下称ncd-2)和贝莱斯芽孢杆菌b31(以下称b31)复配得到的微生物组合，其中枯草芽孢杆菌ncd-2是一种已经公开的，通过微生物农药登记注册的微生物。贝莱斯芽孢杆菌b31经过生物保藏，具体的保藏信息如下：
29.保藏编号cgmcc no.24599；分类命名：贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编10010；保藏日期：2022年03月28日。
30.1、本实施例针对上述微生物组合进行兼容性试验，具体流程如下：
31.分别挑取新鲜的ncd-2、b31单菌落于加有5ml的lb液体培养基中，37℃，180rpm培养12h，将菌液浓度调至od
600
＝1.0。lb培养基冷却至55℃左右时，将ncd-2菌液以1:100的比例加入到培养基中，充分混匀制备固体培养基，待培养基凝固后，在培养基上接种5μl b31菌液，每个处理重复三次。37℃培养12h，观察b31菌株的生长情况以及菌落周围是否产生抑菌圈。
32.结果如图1所示，b31菌落生长正常，菌落周围未产生抑菌圈，说明b31菌株与ncd-2菌株不存在拮抗活性，2个菌株的兼容性较好。
33.2、本实施例进一步将上述微生物组合制备成可湿性粉剂，具体流程如下：
34.复配芽孢杆菌母药制备：将菌株b31和ncd-2分别在lb固体培养基上划线，37℃过夜培养获得单菌落，作为一级种子。
35.挑取单菌落于盛有5ml lb液体培养基的试管中，37℃、180rpm过夜培养活化，取1ml接种于盛有100ml lb液体培养基的500ml三角瓶中，37℃、180rpm培养24h，作为二级种子液。
36.将二级种子液按接种量2％(体积比)接入发酵罐，34℃培养。当发酵液中90％以上菌体转化为芽孢时，停止发酵，得到芽孢杆菌发酵液；发酵培养基组成为：玉米粉30g/l，豆饼粉20g/l，磷酸氢二钾5g/l，硫酸镁1.5g/l，碳酸钙1g/l，ph 7.5。发酵液离心得到5倍浓缩液，按照10％(质量比)加入轻质碳酸钙混匀通过喷雾干燥塔制成芽孢杆菌母药粉。利用轻质碳酸钙调整母药粉菌含量至350亿cfu/g。
37.100亿cfu/g复配芽孢杆菌可湿性粉剂制备：将两种芽孢杆菌母药粉等质量混匀，与润湿分散剂lt-569、分散剂agrilan 700、稳定剂kh2po4及紫外保护剂抗环血酸和轻质碳酸钙混匀得到复配芽孢杆菌可湿性粉剂。其中，各组分的质量百分含量为：复配芽孢杆菌母药粉30％，润湿分散剂lt-569 4％、分散剂agrilan 700 4％、稳定剂kh2po41％、紫外保护剂抗环血酸1％、轻质碳酸钙60％。
38.3、本实施例进一步通过盆栽实验验证上述微生物组合对棉花黄萎病防治效果
39.病原菌制备：将大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌菌株于200ml pdb培养基中，25℃、180rpm振荡培养7d，四层纱布过滤，8000rpm、4℃离心20min，弃掉上清液，用无菌水重悬孢子，作为病原菌接种液备用。
40.土壤处理：将棉田土、草炭、蛭石按体积比为1:1:1充分混合，121℃高温高压灭菌1h。自然风干后与病原菌充分混匀，使土壤中尖孢镰刀菌的浓度为104孢子/g土，大丽轮枝菌的浓度为106孢子/g土，装入书式育苗盒中。
41.棉花播种：挑选没有机械损伤且颗粒饱满的鄂荆1号(黄萎病感病品种)种子置于
温水中浸泡3-4h，捞出至玻璃培养皿中，并用浸湿的纱布覆盖，于25℃培养箱中催芽12h，选择露白的棉籽进行播种。书式育苗盒一盒八排，每排8孔，每孔播种3粒催芽露白的棉种，置于25-28℃温室中培养，自然光光照，出苗后每孔保留一株长势健康一致的幼苗。
42.菌剂处理：播种棉籽同时接种菌剂，接种量为终浓度106cfu/g土壤。
43.实验设置四个处理，分别为：(1)空白对照；(2)ncd-2可湿性粉剂；(3)b31可湿性粉剂；(4)复配芽孢杆菌可湿性粉剂。其中ncd-2可湿性粉剂和b31可湿性粉剂的制备方法和前述复配芽孢杆菌可湿性粉剂相同。每个处理32株苗，实验重复三次。棉花出苗第35、42、49d调查棉花发病情况，观察不同处理间黄萎病发病情况及防治效果。按照表1所述标准调查黄萎病的病情指数。根据病情指数计算棉花黄萎病的防治效果，病情指数和防治效果按照以下公式计算：
44.病情指数(％)＝∑(相应病级
×
相应病级病株数)/(总株数
×
最高级值)
×
100
45.防治效果(％)＝(空白对照病情指数-各处理病情指数)/空白对照病情指数
×
100
46.表1棉花黄萎病病情等级调查标准
[0047][0048]
结果如图2和图3所示，棉花出苗35天调查，单独ncd-2菌剂对棉花黄萎病的防效为49.67％，b31菌剂处理防效为22.92％，复配菌剂施用后防效为87.50％，与单独ncd-2菌剂处理相比，复配菌剂处理防效增加了76.16％；42天调查，单独ncd-2菌剂对棉花黄萎病的防效为39.97％，b31菌剂处理防效为17.04％，复配菌剂施用后防效为75.70％，与单独ncd-2菌剂处理相比，复配菌剂处理防效增加了89.39％；49天调查，单独ncd-2菌剂对棉花黄萎病的防效为35.4％，b31菌剂处理防效为8.60％，复配菌剂施用后防效为69.47％，与单独ncd-2菌剂处理相比，复配菌剂处理防效增加了96.24％。通过三次棉花黄萎病防效调查，复配菌剂防效均高于单独菌剂处理，且增效逐渐提高，说明复配菌剂对棉花黄萎病防效更稳定。
[0049]
4、本实施例进一步通过田间实验验证上述微生物组合对棉花黄萎病的防治效果，具体流程如下：
[0050]
田间实验在人工接种棉花黄萎病和枯萎病菌的病圃中进行。棉花品种为鄂荆一号，芽孢杆菌可湿性粉剂以滴灌方式施用，棉花出苗后每月滴灌一次，每次用量1kg/亩，共滴灌2次。实验处理与上述盆栽实验相同，棉花出苗3个月后调查黄萎病发生情况及防治效果。
[0051]
结果如图4所示，复配芽孢杆菌可湿性粉剂田间防效为70.4％，与ncd-2可湿性粉剂相比，防治效果提高了82.9％。
[0052]
5、本实施例进一步通过田间实验验证了其他微生物组合对棉花黄萎病的防治效果
[0053]
具体的试验方法和上述流程4相同，采用枯草芽孢杆菌ncd-2和解淀粉芽孢杆菌
t25，按照流程2相同的方式制备可湿性粉剂(流程中的b31菌株替换为解淀粉芽孢杆菌t25)。
[0054]
通过和流程1相同的兼容性试验验证枯草芽孢杆菌ncd-2和解淀粉芽孢杆菌t25之间不存在拮抗作用。防治效果的结果显示，枯草芽孢杆菌ncd-2和解淀粉芽孢杆菌t25复配制成的可湿性粉剂的可湿性粉剂田间防效为50.6％。
[0055]
综合而言，本技术提供的枯草芽孢杆菌ncd-2和解淀粉芽孢杆菌t25组合存在多层次，多方面的协同作用，可以有效地防治棉花黄萎病。
[0056]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种微生物组合，其特征在于，包括：枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ncd-2。2.根据权利要求1所述的微生物组合，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌b31。3.根据权利要求1或2所述的微生物组合，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌和所述贝莱斯芽孢杆菌的质量比为1:(0.1～10)。4.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1-3任一项所述的微生物组合或其发酵产物。5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述微生物组合的总活菌数为1
×
10
9～11
cfu/g。6.一种生物肥料，其特征在于，所述生物肥料包括权利要求1-3任一项所述的微生物组合，或权利要求4或5所述的菌剂。7.权利要求1-3任一项所述的微生物组合，或权利要求4或5所述的菌剂，或权利要求6所述的生物肥料在抑制大丽轮枝菌中的应用。8.权利要求1-3任一项所述的微生物组合，或权利要求4或5所述的菌剂，或权利要求6所述的生物肥料在抑制棉花黄萎病或棉花枯萎病中的应用。9.权利要求1-3任一项所述的微生物组合，或权利要求4或5所述的菌剂，或权利要求6所述的生物肥料在提高棉花产量中的应用。

技术总结
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种微生物组合及其在抑制棉花黄萎病中的应用。所述微生物组合包括：包括：枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌NCD-2。本发明研究得到一种包含特定枯草芽孢杆菌NCD-2和贝莱斯芽孢杆菌的微生物组合，两者具备一定的协同效果，在应用于棉花黄萎病的防治过程时，防治效果可以从单独使用枯草芽孢杆菌NCD-2的40％提升至70％以上，且长效持久，在棉花黄萎病的防治领域具有重要意义。在棉花黄萎病的防治领域具有重要意义。在棉花黄萎病的防治领域具有重要意义。


技术研发人员：曲远航 郭庆港 马平 李社增 苏振贺 鹿秀云 董丽红
受保护的技术使用者：河北省农林科学院植物保护研究所
技术研发日：2023.03.21
技术公布日：2023/7/12