检测生物标志物的产品在制备诊断神经管畸形产品的用途的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种检测生物标志物的产品在制备辅助诊断或诊断神经管畸形的产品中的用途。


背景技术：

2.胚胎早期的异常发育可导致多种先天性畸形的发生，神经管畸形（ntds）作为严重的先天性出生缺陷疾病之一，可增加新生儿出现严重的致残或致死风险。既往研究表明，叶酸缺乏所导致的表观遗传修饰异常是诱发神经管畸形的重要因素。然而，神经管畸形的发生、发展以及发病机制尚不十分清楚，采用现有的技术诊断出神经管畸形，神经管畸形疾病已经不可逆转。因此，提供一种能够早期诊断神经管畸形的标志物，以使得及早进行干预治疗，具有重大意义。


技术实现要素：

3.因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种检测生物标志物的产品在制备辅助诊断或诊断神经管畸形的产品中的用途。
4.一种检测生物标志物的产品在制备辅助诊断或诊断神经管畸形的产品中的用途，所述生物标志物包括去甲基化酶alkbh5。
5.可选的，所述神经管畸形为叶酸缺乏导致的。
6.可选的，检测生物标志物的产品为检测rna的m6a修饰去甲基化酶alkbh5水平的产品。
7.可选的，所述检测生物标志物的产品包括试剂盒、试纸、试剂、引物、生物芯片或探针。
8.可选的，所述制备辅助诊断或诊断神经管畸形的产品包括试剂盒、试纸、试剂、引物、生物芯片或探针。
9.可选的，待测样本为外周血或血清。
10.本发明技术方案，具有如下优点：1.本发明提供的一种检测生物标志物的产品在制备辅助诊断或诊断神经管畸形的产品中的用途，所述生物标志物包括去甲基化酶alkbh5。本发明发现并验证了叶酸缺乏的神经管畸形中可激活rna m6a修饰的去甲基化酶alkbh5，提高去甲基化酶alkbh5的表达水平，当进行叶酸回补实验后，alkbh5的表达水平又发生显著下调，在低叶酸联合甲氨蝶呤诱导神经管畸形胎鼠样本、人神经管畸形胎脑样本中均发生alkbh5的表达水平显著上调。以上均说明了去甲基化酶alkbh5与叶酸缺乏导致的神经管畸形显著相关，可以作为神经管畸形的诊断标志物。
附图说明
11.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体
实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
12.图1是本发明实施例1中merip-seq、rna-seq联合性分析检测到go富集分析情况；图2是本发明实施例1中merip-seq、rna-seq联合性分析检测到kegg通路富集分析情况；图3是本发明实施例1中酶蛋白检测结果；图4是图3的定量结果；p《0.05,p《0.05,p《0.01,p《0.01,p《0.01,p《0.001；图5是本发明实施例2中实验组与对照组的侧面观与背面观表型；图6是本发明实施例2中蛋白印迹法检测实验组与对照组胎鼠脑组织中alkbh5的变化及定量情况（n=3）p《0.05,p《0.05,p《0.01,p《0.01,p《0.01,p《0.001；图7是本发明实施例2中蛋白印迹法检测实验组与对照组胎鼠脊柱组织中alkbh5的变化及定量情况（n=3）；p《0.05,p《0.05,p《0.05,p《0.01,p《0.01,p《0.01,p《0.001；图8是本发明实施例3中蛋白印迹法检测人神经管畸形样本中alkbh5的变化情况；图9是图8的定量结果；p《0.05,p《0.05,p《0.01,p《0.01,p《0.01,p《0.001；图10是本发明实施例3中各组的母体血清中叶酸浓度；p《0.05,p《0.05,p《0.01,p《0.01,p《0.01,p《0.001；图11是本发明实施例3中各组的母体血清叶酸浓度与alkbh5蛋白水平相关性分析结果。
具体实施方式
13.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
14.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
15.实施例11、细胞模型构建选择小鼠胚胎干细胞（sv129细胞系）构建叶酸缺乏细胞模型，即叶酸缺乏组（fa0），同时设置正常叶酸组（fa4）。在叶酸缺乏组（fa0）培养基中的组分为：0.1 mmol/l非必需氨基酸、15% 胎牛血清、0.1 mmol/l谷氨酸、0.1mmol/l β-巯基乙醇、1000 u/ml 小鼠白血病抑制因子。正常叶酸组（fa4）培养基与叶酸缺乏组（fa0）培养基的区别在于额外添加终浓度为4mg/l的叶酸溶液。提前准备在培养面铺好浓度为0.2%明胶的t25细胞培养瓶，将小鼠胚胎干细胞复苏后放入，并放置在37
ꢀ°
c、5% co2的恒温恒湿培养箱中，每隔2-3天传代，到第6代时收集细胞样本（细胞密度为60% ~ 70%）。
16.同时设置叶酸回补组（fa0+fa）：将上述叶酸缺乏组（fa0）的小鼠胚胎干细胞模型培养至第6代时，进行叶酸回补，将终浓度为50μmol/l的叶酸溶液加入叶酸缺乏细胞组中，
24小时后收集细胞。
17.2、实验方法和结果2.1、go分析和kegg通路富集分析将叶酸缺乏组（fa0）及正常叶酸组（fa4）进行rna m6a甲基化测序（merip-seq）及rna测序（rna-seq）并分析测序结果，将merip-seq和rna-seq的结果进行联合性分析，go（gene ontology，分析软件为r语言）分析和kegg通路富集分析（分析软件为r语言）。
18.go分析结果如图1所示，两组样本间在go分析中的生物学进程中均显著富集到细胞发育过程；kegg通路富集分析如图2所示，两组样本差异基因在hedgehog 信号通路中显著富集，hedgehog 信号通路参与小鼠胚胎发育过程中神经板弯曲的调控，提示rna m6a甲基化可能通过介导hedgehog 信号通路参与诱导神经管畸形发生。
19.2.2、酶蛋白检测m6a修饰受写入者（writer）、阅读器（reader）、擦除器（eraser）三种不同功能的酶调控。为探究rna m6a修饰在叶酸缺乏下介导神经管畸形发生的具体机制，本发明中收集了叶酸缺乏组（fa0）、正常叶酸组（fa4）及叶酸回补组（fa0+fa）的细胞样本，按照常规方法提取总蛋白，通过蛋白印迹法（western blot）检测了调节rna m6a修饰的这三类酶的蛋白水平，并通过免疫组化技术对检测的酶蛋白进行相对蛋白水平定量（使用的试剂盒名称sds-page凝胶制备试剂盒，北京索莱宝科技有限公司）（数据统计方法为独立样本t检验，p《0.05,0.05,p《0.01,p《0.01,p《0.01,p《0.001）。
20.结果如图3和图4所示，rna m6a的去甲基化酶alkbh5的蛋白水平在fa0组中显著上调，经叶酸回补后，alkbh5的蛋白水平又显著回调。
21.实施例21、动物模型的构建选择6-8周的spf级c57/6j雌性小鼠，实验组（ntd组）喂养低叶酸饲料（低叶酸饮食配方包括酪蛋白 23重量份，胱氨酸 0.3重量份，玉米淀粉 38重量份，麦芽糖糊精 13重量份，蔗糖10重量份，纤维素5重量份，豆油8重量份，酒石酸氢胆碱0.3重量份，ain93多矿 3份，ain93多维 1份，该部分已公开在[1]裴培,崔小岱,张霆,王珊.低叶酸联合甲氨蝶呤诱导神经管畸形小鼠模型的建立[j].中华神经外科杂志,2019(02):193-196.)4周，对照组（con组）喂养正常饲料（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）4周；各组按2：1（雌：雄）比例选择性成熟雄性spf级c57/6j小鼠于头天晚上8：00合笼，交配过夜，第二天早上8：00检查雌性小鼠见栓定为孕0.5天，待7.5天时，对小鼠腹腔注射甲氨蝶呤一次，甲氨蝶呤应用剂量为1.5mg/kg，对照组腹腔注射等体积的生理盐水。待孕13.5天时，颈椎脱臼处死孕鼠，进行解剖，从子宫内剖出胎鼠，观察表型，得到神经管畸形表型明显的胎鼠。取con组及ntd组胎鼠脑组织及脊柱组织，按常规方法提取总蛋白，用蛋白印迹法（western blot）技术检测alkbh5的蛋白水平（使用的试剂盒名称sds-page凝胶制备试剂盒，北京索莱宝科技有限公司）（数据统计方法为独立样本t检验，p《0.05,p《0.05,p《0.01,p《0.01,p《0.01,p《0.001）。
[0022]
2、实验方法以及结果实验组和对照组的胎鼠的侧面观与背面观表型如图5所示，从图5中可以看出对照组胎鼠外观饱满圆滑，前、中、后脑室发育完好，神经管已闭合完全；实验组胎鼠较对照组胎鼠在体型上明显更小，脊柱部分发育异常，可见神经管未完全闭合。说明实验组的神经管畸
形胎鼠模型构建成功。
[0023]
蛋白印迹法（western blot）检测低叶酸联合甲氨蝶呤诱导的神经管畸形胎鼠模型中胎鼠脑组织（每组共3例的胎鼠脑组织混合样本）的alkbh5的变化及定量情况如图6所示，胎鼠脊柱组织（每组共3例的胎鼠脊柱组织混合样本）的alkbh5的变化及定量情况如图7所示，从图中可以看到，与对照组相比，实验组的alkbh5在脑组织及脊柱组织里显著上调。
[0024]
实施例31、实验方法收集人胚胎神经管畸形样本（14例，由首都儿科研究所样本库提供）和正常人胚胎（14例，由首都儿科研究所样本库提供）进一步验证alkbh5的情况，采集各组的胎脑组织样本，通过蛋白印迹法（western blot）技术（使用的试剂盒名称sds-page凝胶制备试剂盒，北京索莱宝科技有限公司）检测蛋白水平（数据统计方法为独立样本t检验，p《0.05,p《0.05,p《0.01,0.01,0.01,p《0.001）。
[0025]
结果如图8所示和图9所示，证实alkbh5在人神经管畸形样本（ntds）中显著上调。测量各组的母体血清中叶酸浓度，结果如图10所示，发现怀有神经管畸形胎儿的母体血清样本中叶酸浓度水平显著低于正常组的，将母体血清叶酸浓度与alkbh5的蛋白水平进行相关性分析，结果如图11所示，正常组的母体血清叶酸浓度与alkbh5的蛋白水平的相关性为r=-0.903，p=0.007，ntds的母体血清叶酸浓度与alkbh5的蛋白水平的相关性为r=-0.958，p＜0.001，发现两组与alkbh5均呈负相关，而ntds的母体血清叶酸浓度与alkbh5的蛋白水平的负相关性更显著。
[0026]
综上，本发明首次发现并验证了rna的m6a修饰水平与低叶酸诱导的神经管畸形显著相关，并进一步发现并验证了叶酸缺乏的神经管畸形中可激活rna m6a修饰的去甲基化酶alkbh5，提高去甲基化酶alkbh5的表达水平，当进行叶酸回补实验后，alkbh5的表达水平又发生显著下调，在低叶酸联合甲氨蝶呤诱导神经管畸形胎鼠样本、人神经管畸形胎脑样本中均发生alkbh5的表达水平显著上调。以上均说明了rna的m6a修饰以及其去甲基化酶alkbh5与叶酸缺乏导致的神经管畸形显著相关，可以作为神经管畸形的诊断标志物。
[0027]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种检测生物标志物的产品在制备辅助诊断或诊断神经管畸形的产品中的用途，其特征在于，所述生物标志物包括去甲基化酶alkbh5。2.根据权利要求1所述的一种检测生物标志物的产品在制备辅助诊断或诊断神经管畸形的产品中的用途，其特征在于，所述神经管畸形为叶酸缺乏导致的。3.根据权利要求1-2任一项所述的一种检测生物标志物的产品在制备辅助诊断或诊断神经管畸形的产品中的用途，其特征在于，检测生物标志物的产品为检测去甲基化酶alkbh5水平的产品。4.根据权利要求3所述的一种检测生物标志物的产品在制备辅助诊断或诊断神经管畸形的产品中的用途，其特征在于，所述检测生物标志物的产品包括试剂盒、试纸、试剂、引物、生物芯片或探针。5.根据权利要求1-2任一项所述的一种检测生物标志物的产品在制备辅助诊断或诊断神经管畸形的产品中的用途，其特征在于，所述制备辅助诊断或诊断神经管畸形的产品包括试剂盒、试纸、试剂、引物、生物芯片或探针。6.根据权利要求1-2任一项所述的一种检测生物标志物的产品在制备辅助诊断或诊断神经管畸形的产品中的用途，其特征在于，待测样本为外周血或血清。

技术总结
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种检测生物标志物的产品在制备诊断神经管畸形产品的用途，所述生物标志物为去甲基化酶ALKBH5。本发明发现并验证了叶酸缺乏可引起神经管畸形中RNA的N6-甲基腺嘌呤（m6a）修饰的去甲基化酶ALKBH5被激活，使去甲基化酶ALKBH5的表达水平上调。当进行叶酸回补实验后，ALKBH5的表达水平又发生显著下调，在低叶酸联合甲氨蝶呤诱导神经管畸形胎鼠样本、人神经管畸形胎脑样本中均发生ALKBH5的表达水平显著上调。以上均说明了去甲基化酶ALKBH5与叶酸缺乏导致的神经管畸形显著相关，可以作为神经管畸形的诊断标志物。诊断标志物。诊断标志物。


技术研发人员：王珊 裴培 曾雨冰
受保护的技术使用者：首都儿科研究所
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/7/12