灯塔水母硫氧还蛋白、及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种灯塔水母硫氧还蛋白、及其制备方法和应用。


背景技术：

2.皮肤氧化是皮肤长期暴露在阳光、污浊空气和计算机辐射下的氧化反应，它能使原本年轻嫩滑的皮肤粗糙松弛。人体由于与外界的连续接触，包括呼吸、外部污染、辐射、压力等因素，都会产生大量的自由基，造成一定的皮肤氧化。因此，抗氧化产品在护肤领域具有重要应用。
3.硫氧还蛋白是一种含有半胱氨酸残基的蛋白质，可以通过将其内部的二硫键还原为单硫键来调节细胞内的氧化还原状态。该蛋白质在多种生物体中都有发现，包括哺乳动物、植物和微生物等。目前，有从水母刺丝囊提取液中分离硫氧还蛋白的相关技术。但是不同种类的水母，生活环境不同，其体内的硫氧还蛋白的功能可能与其对环境的适应性有关，但是目前也未见这方面的报道。


技术实现要素：

4.针对以上技术问题，本发明公开了一种灯塔水母硫氧还蛋白、及其制备方法和应用，具有更强的抗氧化能力和抗炎作用。
5.灯塔水母是一种小型的水母，可以从水螅体无性繁殖，是唯一已知的能够从性成熟阶段恢复到幼虫阶段的生物，被称为永生不死的生物。另外，灯塔水母对高盐度、低氧和低营养等极端环境均有良好的适应性。无论是衰老还是极端环境，都会造成细胞氧化伤害，进而影响生物体的健康状况和老化凋亡。鉴于此，灯塔水母可能具有强抗氧化活性的生物大分子，进而帮助灯塔水母保持永生和抵抗恶劣环境。
6.本发明从灯塔水母基因组中克隆出硫氧还蛋白的基因序列，使用大肠杆菌进行表达纯化，并测试了其活性、热稳定性以及对表皮细胞等氧化伤害模型的修复作用。结果显示，该蛋白展现出良好的抗氧化能力和热稳定性，可以用作护肤品原料，保护皮肤免受氧化伤害。
7.本发明公开了一种灯塔水母硫氧还蛋白，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
8.本发明还公开了一种灯塔水母硫氧还蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.本发明还公开了一种如上所述的灯塔水母硫氧还蛋白的制备方法，包括如下步骤：
10.步骤s1，收集灯塔水母活体，提取rna，进行转录组测序，得到灯塔水母转录组序列；
11.步骤s2，将灯塔水母转录组序列与已知的硫氧还蛋白序列进行比对，获得灯塔水母硫氧还蛋白的核苷酸序列；
12.步骤s3，构建灯塔水母硫氧还蛋白的表达质粒，重组工程菌；
13.步骤s4，灯塔水母硫氧还蛋白的表达；
14.步骤s5，重组灯塔水母硫氧还蛋白的纯化。
15.进一步的，步骤s3包括：
16.步骤s31，设计并合成pcr引物，所述pcr引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no:4所示；具体为：
17.上游引物:cgcggatccagttatgtgctgaagact
18.下游引物:ccgctcgagctagatatcgttataaatc。
19.步骤s32，以灯塔水母rna反转录后的cdna为模板，采用合成的pcr引物进行pcr扩增，扩增条件为：94℃5min预变性；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min，最后4℃恒温保存，获得pcr扩增的产物；
20.步骤s32，酶切回收后的pcr产物，及pet-28原核表达质粒；
21.步骤s33，利用两个酶切位点将编码序列连接到pet-28载体上，构建重组表达质粒，然后转化到大肠杆菌bl21(de3)plys获得重组工程菌。
22.进一步的，步骤s4中灯塔水母硫氧还蛋白的表达的条件为：16℃、1mm iptg、160rpm下诱导8小时以上。
23.进一步的，步骤s5包括，离心收集菌体，裂解后，采用ni-nta法、分子筛层析法进行蛋白纯化。
24.进一步的，离心收集菌体、裂解包括：将表达的菌液于5000g、4℃条件下离心10min收集菌体，使用裂解缓冲液(0.02m pbs，0.5m nacl，10mm咪唑，ph 7.4)重悬浮菌体沉淀，使用超声破碎的方式裂解菌体，直至混合液澄清透明。
25.进一步的，在15000
×
g、4℃条件下离心20min，取上清使用ni-nta法纯化目的蛋白，其中洗涤液成分为0.02m pbs，0.5m nacl，20mm咪唑，ph 7.4。洗脱液成分为0.02m pbs，0.5m nacl，500mm咪唑，ph 7.4。
26.进一步的，使用分子筛层析法对目的蛋白进行纯化，其中色谱柱型号为superdex 30increase 10/300，流动相为1
×
pbs，流速0.3ml/min，根据出峰谱图收集组分，并进行sds-page电泳，获得纯度大于98％的灯塔水母硫氧还蛋白。
27.本发明还公开了一种如上所述的灯塔水母硫氧还蛋白在制备抗氧化药物、抗辐射药物、护肤品、食品防腐剂或抗衰老药物中的应用。
28.本发明还公开了一种如上所述的灯塔水母硫氧还蛋白的编码基因在制备抗氧化药物、抗辐射药物、护肤品、食品防腐剂或抗衰老药物中的应用。
29.本发明的有益效果为：
30.因为灯塔水母生活在极端的环境中，需要适应高盐度、低氧和低营养等条件，所以灯塔水母中的硫氧还蛋白可能具有更强的抗氧化能力，这是一种修复被氧化的生物分子的主要蛋白质，这些蛋白很容易被活化，它们能够强力地进而强力清除细胞内产生的自由基，避免它们与蛋白质、dna等分子结合，造成细胞损伤，可以修复受损的蛋白质、dna、rna等分子，并保护细胞免受细胞氧化应激的危害。本发明的技术方案从灯塔水母基因组中克隆出硫氧还蛋白的基因序列，使用大肠杆菌进行表达纯化，通过测试其活性、热稳定性以及对表
皮细胞等氧化伤害模型的修复，结果显示，该蛋白展现出很好的抗氧化能力和热稳定性，可以用作护肤品原料，保护皮肤免受氧化伤害，还可以用于抗氧化和抗炎作用的场合。
附图说明
31.图1是本发明实施例的rna提取电泳图。
32.图2是本发明实施例的pcr扩增产物电泳图。
33.图3是本发明实施例的灯塔水母硫氧还蛋白与其它硫氧还蛋白序列比较图。
34.图4是本发明实施例的灯塔水母硫氧还蛋白纯化后的电泳图。
35.图5是本发明实施例的灯塔水母硫氧还蛋白与其他来源的硫氧还蛋白酶活测试结果。
36.图6是本发明实施例的灯塔水母硫氧还蛋白的热稳定性测试结果。
37.图7是本发明实施例灯塔水母硫氧还蛋白在hsf中的抗氧化性测试结果。其中，a)～d)分别为mda含量、cat酶活、sod酶活、gsh含量的结果。control:空白组，不做任何处理的细胞；细胞氧化组：只加h2o2，使细胞被氧化；共作用组：加h2o2与灯塔水母硫氧还蛋白，验证其作用。
38.图8是本发明实施例灯塔水母硫氧还蛋白在293t中的抗氧化性测试结果。其中，a)～d)分别为mda含量、cat酶活、sod酶活、gsh含量的结果。control:空白组，不做任何处理的细胞；细胞氧化组：只加h2o2，使细胞被氧化；共作用组：加h2o2与灯塔水母硫氧还蛋白，验证其作用。
具体实施方式
39.下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
40.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
41.实施例1
42.获取灯塔水母硫氧还蛋白，包括：
43.1)取灯塔水母活体10只，使用trizol法提取rna，提取电泳图如图1所示，上样量5μl，rna条带明显，无明显降解，质量合格。
44.2)将提取的rna进行转录组测序，并对数据进行组装获得转录组序列。
45.3)使用人来源的硫氧还蛋白序列与灯塔水母转录组进行比对，确定灯塔水母硫氧还蛋白的序列为：
46.atgagttatgtgctgaagactttaaagactaaaagagaggttgatgaagccatca
47.aatctgtagaagataaggttttagtattacgatttggaagacaaagcgattcaagt
48.tgcttacaatgtgacgatgttttactgaaaaccgcagataagttgcgaaatatggc
49.tgatatctatttagttgaggtggatgaggtacctatttatacacaatattttgatgtt
50.tctctcattcctgcaacaatttttttcttcaatggccaacacatgaaagtagattat
51.ggaacacaagaccacacaaagttcattggagcatttgccaataagcaagatttca
52.ttgatttggtggaggttgtttatcgtggtgccatgcatggaaaactgatagtgaca
53.tctcctatagattcgaagaatataccaaaatataatttgatttataacgatatctag(如seq id no.2所示)
54.翻译后的蛋白序列为：
55.msyvlktlktkrevdeaiksvedkvlvlrfgrqsdssclqcddvllktadklr nmadiylvevdevpiytqyfdvslipatifffngqhmkvdygtqdhtkfigafankq dfidlvevvyrgamhgklivtspidsknipkynliyndi(如seq id no:1所示)
56.4)将该序列与酵母、植物来源的硫氧还蛋白序列进行比对，结果如图3所示。
57.目前，市场上有一些公开信息显示某些护肤品采用酵母硫氧还蛋白，其中有些公开为植物来源的硫氧还蛋白。本实施例以植物来源的硫氧还蛋白与灯塔水母硫氧还蛋白进行对比：
58.酵母和紫荆花硫氧还蛋白分子量分别为15.75kda和16.30kda，灯塔水母硫氧还蛋白分子量为16.41kda。
59.其次，灯塔水母硫氧还蛋白与植物紫荆花和酵母相比，灯塔水母硫氧还蛋白序列差异30％，如图3所示。序列上的巨大差异，意味着灯塔水母硫氧还蛋白可能具有不同的功能。考虑灯塔水母特殊的抗衰老表现，猜测灯塔水母硫氧还蛋白有更好的抗氧化作用，进而帮助灯塔水母抗衰老。
60.5)以反转录后的cdna为模板，用设计的引物做pcr扩增，扩增条件为：94℃5min预变性；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min，最后4℃恒温保存，pcr扩增产物电泳图如图2所示，上样量3μl，条带单一且位置大小正确。
61.设计的引物序列为：
62.f:cgcggatccagttatgtgctgaagact(如seq id no:3所示)
63.r:ccgctcgagctagatatcgttataaatc(如seq id no:4所示)
64.6)将pcr扩增的产物做切胶回收。
65.7)切胶回收的产物与pet-28质粒，用限制性内切酶：bamhi、xhoi做双酶切，并用t4连接酶16℃过夜连接。
66.8)将连接后产物转化进bl21(de3)plys感受态中，在37℃下，用含50μg/ml氯霉素与50μg/ml卡那霉素的lb培养基平板培养并筛选阳性克隆。
67.9)将获得的阳性克隆转接至含有50μg/ml氯霉素与卡那霉素的lb液体培养基，37℃，200rpm进行培养。
68.10)待菌液的od
600
达到0.6-0.8时，将培养基降温至16℃，加入1mm iptg，160rpm过夜诱导表达。
69.11)将表达的菌液于5000g、4℃条件下离心10min收集菌体，使用裂解缓冲液(0.02m pbs，0.5m nacl，10mm咪唑，ph 7.4)重悬浮菌体沉淀，使用超声破碎的方式裂解菌体，直至混合液澄清透明。
70.12)15000
×
g、4℃条件下离心20min，取上清使用ni-nta法纯化目的蛋白，其中洗涤液成分为0.02m pbs，0.5m nacl，20mm咪唑，ph 7.4。洗脱液成分为0.02mpbs，0.5m nacl，500mm咪唑，ph 7.4。
71.13)进一步使用分子筛层析法对目的蛋白进行纯化，其中色谱柱型号为superdex 30increase 10/300，流动相为1
×
pbs，流速0.3ml/min，根据出峰谱图收集组分，并进行sds-page电泳，获得纯度大于98％的灯塔水母硫氧还蛋白，纯化后的电泳图如图4所示，纯化后为单一条带，纯度》98％。
72.实施例2
73.对实施例1获得的灯塔水母硫氧还蛋白进行酶活性测试。
74.使用胰岛素沉淀法对硫氧还蛋白进行酶活性测试。反应体系为0.1m pbs，2mm edta，2mm dtt，1.25mg/ml insulin，总体积为1ml，反应温度为25℃，分别加入10μm灯塔水母、酵母和紫荆花来源的硫氧还蛋白后，每隔1min测定一次反应体系的od
650
，获得催化曲线，并与其他来源的硫氧还蛋白进行对比。结果如图5所示，可见灯塔水母中的硫氧还蛋白在常温下的活性明显高于酵母和植物紫荆花中的硫氧还蛋白，这可能与其特殊的蛋白序列有关。
75.实施例3
76.对实施例1获得的灯塔水母硫氧还蛋白进行热稳定性测试。
77.将灯塔水母硫氧还蛋白分别在5℃，37℃，60℃下放置2h后，按照上述方法测定酶活曲线，以评估灯塔水母硫氧还蛋白的热稳定性。其中37℃模拟在人类正常体温下的工作温度，60℃模拟在夏季运输时的车内温度，5℃模拟在冬季的存放温度。结果如图6所示，可知，灯塔水母硫氧还蛋白经过60℃与5℃处理2h后，仍然保存了大部分活性，方便运输储存和在护肤品中的应用。
78.实施例4
79.采用实施例1获得的灯塔水母硫氧还蛋白进行对人成纤维细胞(hsf)氧化伤害的保护作用测试：
80.实验分为对照组(control)、模型组(细胞氧化组)和样品组(共作用组)，每组设置3个孔作为重复。将处于对数生长期的hsf细胞接种在六孔板中，每孔注入2ml细胞悬液，接种密度为1.5
×
105个/ml，然后将其置于5％co2培养箱中培养24h，培养温度为37℃。
81.24h后从培养箱中取出六孔板细胞，弃去培养液，用1
×
pbs洗涤细胞，向样品组中每孔加入900μl完全培养基和100μl浓度为6.25μg/ml的硫氧还蛋白(使用无fbs的培养基配置蛋白溶液)，对照组和模型组加入等体积的无fbs培养基。之后，向模型组和实验组中加入10μl浓度为500μm的h2o2溶液，对照组加入等体积的无菌水。培育3h后，用1
×
pbs缓冲液洗涤细胞3次。向细胞内加入裂解液于4℃条件下裂解10min，收集裂解后的细胞，根据试剂盒说明书分别测定其中mda、gsh含量及sod和cat酶活性。结果如图7所示。
82.实施例5
83.采用实施例1获得的灯塔水母硫氧还蛋白进行对人胚肾细胞(293t)氧化伤害的保护作用测试：
84.实验分为对照组、模型组和样品组，每组设置3个孔。将处于对数生长期的293t细胞接种在六孔板中，每孔注入2ml细胞悬液，接种密度为1.0
×
105个/ml，然后将其置于5％co2培养箱中贴壁养24h，培养温度为37℃。
85.24h后从培养箱中取出六孔板细胞，弃去培养液，用1
×
pbs洗涤细胞，向样品组中加入900μl完全培养基和100μl浓度为6.25μg/ml的硫氧还蛋白(使用fbs的培养基稀释)，对照组和模型组加入等体积无fbs的培养基。之后，向样品组和模型组中加入10μl 500μm h2o2溶液诱导氧化伤害。对照组中加入等体积无菌水。继续培养6h后，用1
×
pbs洗涤细胞3次。向培养板内加入裂解液，在4℃裂解10min，根据试剂盒说明书测定mda、gsh含量以及sod和cat酶活性。结果如图8所示。
86.通过图7和图8的结果可知：在人成纤维细胞(hsf)与人胚肾细胞(293t)中添加h2o2，细胞被氧化，导致胞膜氧化产物(mda)含量增多，同时细胞发生大量死亡，细胞抗氧化指标(sod、cat、gsh)下降，证明h2o2对细胞产生了强烈的氧化伤害。加入灯塔水母硫氧还蛋白后，细胞的氧化产物mda含量下降，抗氧化指标上升，恢复至对照组的水平，证明灯塔水母硫氧还蛋白可以有效的保护细胞免受氧化伤害。
87.以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种灯塔水母硫氧还蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如seq id no:1所示。2.一种如权利要求1所述的灯塔水母硫氧还蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。3.一种如权利要求1所述的灯塔水母硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤s1，收集灯塔水母活体，提取rna，进行转录组测序，得到灯塔水母转录组序列；步骤s2，将灯塔水母转录组序列与已知的硫氧还蛋白序列进行比对，获得灯塔水母硫氧还蛋白的核苷酸序列；步骤s3，构建灯塔水母硫氧还蛋白的表达质粒，重组工程菌；步骤s4，灯塔水母硫氧还蛋白的表达；步骤s5，重组灯塔水母硫氧还蛋白的纯化。4.根据权利要求3所述的灯塔水母硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，步骤s3包括：步骤s31，设计并合成pcr引物，所述pcr引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no:4所示；步骤s32，以灯塔水母rna反转录后的cdna为模板，采用合成的pcr引物进行pcr扩增，扩增条件为：94℃5min预变性；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min，最后4℃恒温保存，获得pcr扩增的产物；步骤s32，酶切回收后的pcr产物，及pet-28原核表达质粒；步骤s33，利用两个酶切位点将编码序列连接到pet-28载体上，构建重组表达质粒，然后转化到大肠杆菌bl21(de3)plys获得重组工程菌。5.根据权利要求4所述的灯塔水母硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于：步骤s4中灯塔水母硫氧还蛋白的表达的条件为：16℃、1mm iptg、160rpm下诱导8小时以上。6.根据权利要求4所述的灯塔水母硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于：步骤s5包括：离心收集菌体，裂解后，采用ni-nta法和分子筛层析法进行蛋白纯化。7.一种如权利要求1所述的灯塔水母硫氧还蛋白在制备抗氧化药物、抗辐射药物、护肤品、食品防腐剂或抗衰老药物中的应用。8.一种如权利要求2所述的灯塔水母硫氧还蛋白的编码基因在制备抗氧化药物、抗辐射药物、护肤品、食品防腐剂或抗衰老药物中的应用。

技术总结
本发明提供了一种灯塔水母硫氧还蛋白、及其制备方法和应用，该灯塔水母硫氧还蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，该灯塔水母硫氧还蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明的技术方案从灯塔水母基因组中克隆出硫氧还蛋白的基因序列，使用大肠杆菌进行表达纯化，测试其活性、热稳定性以及对表皮细胞等氧化伤害模型的修复，结果显示，该蛋白展现出很好的抗氧化能力和热稳定性，可以用作护肤品原料，保护皮肤免受氧化伤害，还可以用于抗氧化和抗炎作用的场合。抗氧化和抗炎作用的场合。抗氧化和抗炎作用的场合。


技术研发人员：张根 曾明锦 卢梅 潘璐璐 王慧 陈宝锐 汤晓清
受保护的技术使用者：维塔探索（广东）科技有限公司
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/7/13