一套用于乌蒙凤鸡资源鉴定的SNP位点引物组合及其应用的制作方法

一套用于乌蒙凤鸡资源鉴定的snp位点引物组合及其应用
技术领域
1.本发明涉及家禽品种的鉴定，具体地，涉及一套用于乌蒙凤鸡资源鉴定的snp位点引物组合及其应用。


背景技术：

2.乌蒙凤鸡，又名“凤头鸡”、“啄（zhu
ā
i）兜鸡”，有200多年历史，是第三次资源普查贵州省新发展的遗传资源。其原产地为贵州省六盘水市，分布在全市范围内的12个乡镇，其中保华镇、牂牁镇为中心产区，临近其他乡镇有零星分布。过去，乌蒙凤鸡因主要产区位于乌蒙山腹地，当地山势险峻，人迹罕至，比较封闭，具备天然的地理隔离条件，较少受到外来禽种干扰。但近年来，由于外来鸡种的大量涌入，乌蒙凤鸡因生产性能相对较低而被大部分农户弃养或乱杂乱配，纯种乌蒙凤鸡只在极端闭锁的少数民族村寨养殖，导致纯种乌蒙凤鸡濒临灭绝。随着我国畜禽遗传资源普查工作的开展，国家对地方鸡资源调查和保护力度更加重视与加强，越来越多的地方鸡新资源受到更多的社会关注，乌蒙凤鸡也逐渐受到社会关注，贵州省也对乌蒙凤鸡资源加大保护力度，并建立了乌蒙凤鸡核心保种场，使得乌蒙凤鸡资源群体逐渐扩大。2018年7月3日，中华人民共和国农业农村部正式批准对“六盘水乌蒙凤鸡”实施农产品地理标志登记保护。为了更好的对乌蒙凤鸡原种的保种与选育，需要收集和保护纯种乌蒙凤鸡，因此乌蒙凤鸡的鉴定必不可少。
3.目前鉴别乌蒙凤鸡的方法主要依靠外观观察，这种观察主观性较强，在鉴定乌蒙凤鸡与其他品种鸡杂种后代时，其外貌相似，鉴定错误率较高。另外，在进行乌蒙凤鸡新资源鉴定时也需要和贵州省已有的地方鸡品种以及外省外观比较相似的品种比如金湖乌凤鸡等品种进行区别，避免“同种异名”现象，实现新资源有效鉴定和保护工作更快的推进。因此，开发一种能有效准确鉴定乌蒙凤鸡资源的方法，应用于乌蒙凤鸡鉴定工作具有十分重要的意义。


技术实现要素：

4.针对乌蒙凤鸡资源鉴定难的问题，本发明提供了一套用于乌蒙凤鸡资源鉴定的snp位点引物组合及其应用，所述引物组合扩增选自如下wmf1位点到wmf5位点中的任意2到5种：各snp引物的核苷酸序列为：
所述snp位点的筛选方法为：利用芯片对12个鸡种的55000个snp位点进行筛选确定，根据每个品种跟其他品种对比，取差异最大的位点的集合，群体间遗传分化指数前1%，最小等位基因频率》0.4，缺失率《0.2 进行筛选，确定68个snp位点，优先选择乌蒙凤鸡参考基因组位点等位基因频率为0或1，然后确定其他11个品种的每个位点的不同等位基因频率均值，再通过该均值与乌蒙凤鸡每个位点的不同等位基因频率进行比较，筛选等位基因频率差异较大的snp位点，其他群体该等位基因频率为接近1或接近0的位点，最终确定用于乌蒙凤鸡资源鉴定的5个snp位点，其中，所述12个鸡种包括乌蒙凤鸡、乌蒙乌骨鸡、兴文乌骨鸡、竹乡鸡、威宁鸡、黔东南小香鸡、矮脚鸡、高脚鸡、金湖乌凤鸡、丝羽乌骨鸡、哈伯德肉鸡和来航鸡。
5.本发明另一方面所要解决的技术问题是提供一种上述snp引物组合在乌蒙凤鸡资源鉴定中的应用。
6.具体地，鉴定方法包括如下步骤：（1）提取待测鸡基因组总dna；（2）根据所选snp位点引物组合，利用对应的引物对分别进行pcr扩增；（3）将pcr扩增产物测序后、判断基因型；（4）根据基因型结果，判断个体是否属于乌蒙凤鸡资源。
7.步骤（4）中的具体判断方法为：如果所选snp组合对应的基因型有一个不符合乌蒙凤鸡对应的基因型，则判定该个体不属于乌蒙凤鸡；如果所选的至少2个snp位点组合对应的基因型全部符合乌蒙凤鸡的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于乌蒙凤鸡的概率。
8.优选地，步骤（1）中所述待测鸡的基因组dna由该鸡种的个体翅静脉采血得到。
9.步骤（2）中，wmf1~wmf5的pcr产物长度分别为232 bp、161 bp、151 bp、150 bp、165bp。
10.具体地，乌蒙凤鸡中5个snp位点wmf1~wmf5的基因型依次为gg、gg、gg、gg、aa。
11.通过上述技术方案，本发明实现了以下有益效果：采用本发明的snp位点引物进行乌蒙凤鸡资源鉴定，任意1个snp位点基因型判定为乌蒙凤鸡的概率最低为85.62％，最高为92.49％；任意2个snp位点联合基因型判定为乌
蒙凤鸡的概率达到97.84％以上；任意3个snp位点联合基因型判定为乌蒙凤鸡的概率达到99.82％以上；任意4个snp位点联合基因型判定为乌蒙凤鸡的概率达到99.98％以上；全部5个snp位点联合基因型判定为乌蒙凤鸡的概率达到100％。任意一个snp位点基因型排除乌蒙凤鸡的概率即达到100％。
12.因此，只要有一个snp位点基因型不符合乌蒙凤鸡相应的基因型，即可完全排除该个体属于乌蒙凤鸡；任选2个snp位点组合，符合乌蒙凤鸡基因型的判定概率即可达到97％以上。
具体实施方式
13.本发明针对乌蒙凤鸡资源鉴定难的问题，提供了一套用于乌蒙凤鸡资源鉴定的snp位点引物组合及其应用，所述引物组合扩增选自wmf1位点到wmf5位点中的任意2到5种。
14.5个snp位点的筛选方法为：利用京芯一号芯片（55k，北京康普森生物技术有限公司）对12个鸡种（乌蒙凤鸡；贵州省7个地方鸡种：乌蒙乌骨鸡、兴文乌骨鸡、竹乡鸡、威宁鸡、黔东南小香鸡、矮脚鸡、高脚鸡；其他地区相似的代表性乌骨鸡品种：金湖乌凤鸡、丝羽乌骨鸡，国外代表性引进用于杂交配套的品种：哈伯德肉鸡、来航鸡）的55000个snp位点进行筛选确定，根据每个品种跟其他品种对比，取差异最大的位点的集合，群体间遗传分化指数（fst）前1%，最小等位基因频率（maf）》0.4，缺失率（miss rate）《0.2 进行筛选，确定68个snp位点，为了进一步筛选出乌蒙凤鸡核心位点信息，优先选择乌蒙凤鸡参考基因组位点等位基因频率为0或1，然后确定其他11个品种的每个位点的不同等位基因频率均值，再通过该均值与乌蒙凤鸡每个位点的不同等位基因频率进行比较，筛选等位基因频率差异较大的snp位点，其他群体该等位基因频率为接近1或接近0的位点，最终确定用于乌蒙凤鸡资源鉴定的5个snp位点。5个snp位点信息见下表。
15.根据5个snp位点的物理位置，基于红色原鸡参考基因组序列(galgal5)，利用ucsc网站https://genome-asia.ucsc.edu/cgi-bin/hggateway?hgsid=791993043_mvnmfj6qpmrqsauoxqixq3gpteuu，获得5个snp位点dna序列，然后利用primer5.0设计引物。各snp引物序列、pcr产物长度和退火温度见下表：
用上述snp引物组合进行乌蒙凤鸡资源鉴定具体方法包括如下步骤：（1）提取待测鸡基因组总dna；（2）根据所选snp引物组合，利用对应的引物对分别进行pcr扩增；（3）将pcr扩增产物测序后、判断基因型；（4）根据基因型结果，判断个体是否属于乌蒙凤鸡资源，如果所选snp组合对应的基因型有一个不符合乌蒙凤鸡对应的基因型，则判定该个体不属于乌蒙凤鸡；如果所选snp组合对应的基因型至少2个符合乌蒙凤鸡对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于乌蒙凤鸡的概率。
16.在本发明的鉴定方法中，优选从待测鸡的翅静脉采血获得基因组dna，采用本领域常规提取方法即可，在本发明实施例中，优选酚-氯仿法提取基因组dna。
17.本发明应用时采用wmf1~wmf5中的两个位点以上进行乌蒙凤鸡资源的鉴定，并采用对应的上下游引物进行pcr扩增。pcr扩增采用本领域常规pcr扩增方法即可。
18.本发明中，乌蒙凤鸡中5个snp位点wmf1~wmf5的基因型依次为gg、gg、gg、gg、aa。
19.贝叶斯定理计算公式如下：其中，pi表示snp组合中第i个snp中其他品种对应基因型的频率。
20.所述snp位点在乌蒙凤鸡及其他品种中的基因型频率如下表：
其中，其他品种的基因型频率是指选择金湖乌凤鸡、丝羽乌骨鸡、乌蒙乌骨鸡、兴文乌骨鸡、竹乡鸡、黔东南小香鸡、威宁鸡、矮脚鸡、高脚鸡、哈伯德、来航鸡等11个品种，不同品种合并计算得到的每个位点的基因型频率均值。
21.例如，选择wmf1、wmf2、wmf3合计3个snp位点，如果联合基因型为gggggg，则该个体属于乌蒙凤鸡的概率为p＝1/(1+0.10
×
0.12
×
0.08)＝0.9990。
22.以下结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
23.实施例1随机选择江苏省家禽遗传育种重点实验室家禽种质资源遗传材料库保存的乌蒙凤鸡20只、金湖乌凤鸡20只、丝羽乌骨鸡20只、乌蒙乌骨鸡20只、兴文乌骨鸡20只、黔东南小香鸡20只、竹乡鸡20只、来航鸡20只，翅静脉采血，酚-氯仿法提取基因组dna，根据wmf1、wmf5合计2个snp位点的引物进行pcr扩增。
24.pcr总反应体系50μl：dna模板2μl，dntp（2 mmol/l）4μl，mg
2+
（3 mmol
·
l-1
）0.6μl，1
×
pcr反应缓冲液5μl，上、下游引物（10 μmol
·
l-1
）各1μl，taq聚合酶（1u
·
μl-1
）2.5μl，补超纯水至50μl。
25.pcr反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5 min。pcr扩增目的片段用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
26.pcr产物送生物公司进行测序，同时序列进行多态性检测和基因型判定。根据测序结果，2个位点联合基因型为ggaa的20个个体判定为乌蒙凤鸡的概率为p＝1/(1+0.12
×
0.12)＝0.9859，98.59%可以将20个个体全部鉴定为乌蒙凤鸡，鉴定准确率为100％。其余个体均不完全符合ggaa基因型，因此判定为非乌蒙凤鸡。
27.实施例2其他条件同实施例1，区别在于，采用wmf1、wmf2、wmf4、wmf5对应的4个snp位点的引物进行pcr扩增。根据测序结果，4个位点联合基因型为ggggggaa的20个个体判定为乌蒙
凤鸡的概率为p＝1/(1+0.12
×
0.14
×
0.18
×
0.12)＝0.9997，99.97%可以将20个个体全部鉴定为乌蒙凤鸡，鉴定准确率为100％。其余个体均不完全符合ggggggaa基因型，因此判定为非乌蒙凤鸡。
28.实施例3其他条件同实施例1，区别在于，采用wmf1~wmf5对应的5个snp位点的引物进行pcr扩增。根据测序结果，5个位点联合基因型为ggggggggaa的20个个体判定为乌蒙凤鸡的概率为p＝1/(1+0.12
×
0.14
×
0.08
×
0.18
×
0.12)＝1.0000，100%可以将20个个体全部鉴定为乌蒙凤鸡，鉴定准确率为100％。其余个体均不完全符合ggggggggaa基因型，因此判定为非乌蒙凤鸡。
29.以上结合实施例详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
30.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
31.此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

技术特征：
1.一套用于乌蒙凤鸡资源鉴定的snp位点引物组合，其特征在于，所述引物组合扩增选自如下wmf1位点到wmf5位点中的任意2到5种：wmf1位于nc_006095.4染色体8上第4800914位，其为a或g多态；wmf2位于nc_006088.4染色体1上第67822908位，其为t或g多态；wmf3位于nc_006089.4染色体2上第50349649位，其为c或g多态；wmf4位于nc_006089.4染色体2上第84268885位，其为a或g多态；wmf5位于nc_006096.4染色体9上第8251341位，其为g或a多态。2. 根据权利要求1所述的snp位点引物组合，其特征在于，各snp引物的核苷酸序列为：wmf1-f：5’aggcacgctggagagaagta3’wmf1-r：5’tgtcctcaagtgaccgtctg3’wmf2-f：5’ttcaagaacagctgccatca’wmf2-r：5’ccaaggaagggtaaggaagc 3’wmf3-f：5’tttacttggcaactccttcca 3’wmf3-r：5’gttcaactgccctggtgact 3’wmf4-f：5’cagtcgttcattccgtcaga 3’wmf4-r：5’gtccgttcattccctcacat 3’wmf5-f：5’gcttccagcatgagggataa3’wmf5-r：5’gagaaggaaacgaggcactg3’。3.根据权利1或2所述的snp位点引物组合，其特征在于，所述snp位点的筛选方法为：利用芯片对12个鸡种的55000个snp位点进行筛选确定，根据每个品种跟其他品种对比，取差异最大的位点的集合，群体间遗传分化指数前1%，最小等位基因频率>0.4，缺失率<0.2 进行筛选，确定68个snp位点，优先选择乌蒙凤鸡参考基因组位点等位基因频率为0或1，然后确定其他11个品种的每个位点的不同等位基因频率均值，再通过该均值与乌蒙凤鸡每个位点的不同等位基因频率进行比较，筛选等位基因频率差异较大的snp位点，其他群体该等位基因频率为接近1或接近0的位点，最终确定用于乌蒙凤鸡资源鉴定的5个snp位点，其中，所述12个鸡种包括乌蒙凤鸡、乌蒙乌骨鸡、兴文乌骨鸡、竹乡鸡、威宁鸡、黔东南小香鸡、矮脚鸡、高脚鸡、金湖乌凤鸡、丝羽乌骨鸡、哈伯德肉鸡和来航鸡。4.权利要求1至3中任一项所述的snp位点引物组合在乌蒙凤鸡资源鉴定中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，鉴定方法包括如下步骤：（1）提取待测鸡基因组总dna；（2）根据所选snp组合，利用权利要求2对应的引物对分别进行pcr扩增；（3）将pcr扩增产物测序后、判断基因型；（4）根据基因型结果，判断个体是否属于乌蒙凤鸡资源。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（1）中待测鸡的基因组dna由该鸡种的个体翅静脉采血得到。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，5个snp位点wmf1~wmf5的基因型依次为gg、gg、gg、gg、aa。8. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，wmf1~wmf5的pcr产物长度分别为232 bp、161 bp、151 bp、150 bp、165bp。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，判断方法为：如果所选snp组合对应的基因型有一个不符合乌蒙凤鸡对应的基因型，则判定该个体不属于乌蒙凤鸡；如果所选的至少2个snp位点组合对应的基因型全部符合乌蒙凤鸡的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于乌蒙凤鸡的概率。

技术总结
本发明公开了一套用于乌蒙凤鸡资源鉴定的SNP位点引物组合及其应用，所述引物组合扩增选自WMF1位点到WMF5位点中的任意2到5种。利用本发明中的引物组合进行乌蒙凤鸡资源鉴定时，只要有一个SNP位点基因型不符合乌蒙凤鸡相应的基因型，即可完全排除该个体属于乌蒙凤鸡；任选2个SNP位点组合，符合乌蒙凤鸡基因型的判定概率即可达到97％以上，全部5个SNP位点组合，符合乌蒙凤鸡基因型的判定概率即可达到100％。鉴定方法操作简便，准确性高，可以快速鉴定乌蒙凤鸡资源。鉴定乌蒙凤鸡资源。


技术研发人员：束婧婷 屠云洁 章明 骆科印 盛中伟 巨晓军 刘一帆 姬改革 单艳菊 肖芹 王现科 王关吉 邹剑敏
受保护的技术使用者：六盘水市畜牧水产业发展中心
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/7/13