一种抗GPC3抗体及其应用的制作方法

一种抗gpc3抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种抗gpc3抗体及其应用。


背景技术：

2.肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,hcc)是肝癌(liver cancer)中最常见的组织学亚型，是第六大常见癌症，也是导致癌症相关死亡的第四大原因。
3.目前，hcc的临床管理还存在相当大的挑战。只有15％-20％的hcc病例在早期被诊断出可能适合于治愈性治疗，例如手术切除、肝脏移植、经皮乙醇注射局部消融、微波消融和射频消融等。与此同时，大多数hcc患者存在潜在的慢性肝病，这类人群的手术切除治疗充满了各种潜在并发症的可能性。此外，还有很多患者被诊断为无法手术切除的晚期hcc。hcc患者5年生存率只有大约18％，如果癌细胞已经扩散到周围组织或身体的远端部位，则5年生存率会分别降低到大约11％和5％。
4.磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,gpc3)是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的一员，可在控制细胞分裂和生长调节方面发挥作用。gpc3在健康组织中很少表达，但在很多实体瘤如hcc中高度表达。在hcc中，gpc3常被用作诊断和预后的生物标志物。gpc3在肿瘤组织中的特异性表达，其可接近的表面位置以及其在肿瘤转化中涉及的各种信号传导途径中的作用使其成为包括hcc在内的几种实体瘤的免疫治疗的理想靶点。
5.目前，处于临床前与临床阶段的靶向gpc3的hcc疗法主要包括多肽疫苗、单克隆抗体以及嵌合抗原受体t细胞免疫疗法等。
6.嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t cells,car-t)疗法是近年来一种革命性的癌症免疫细胞疗法。通过基因转导的方法使t细胞表达嵌合抗原受体，得到具有肿瘤特异性的car-t细胞，特异性地追踪识别并杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。
7.因此，将抗gpc3的嵌合抗原受体基因通过基因转导方法导入t细胞所制备的gpc3car-t，可特异性识别表达gpc3的hcc细胞并将其杀死，从而实现其抗肿瘤作用，对靶向gpc3的免疫治疗方法具有较大的临床转化价值。


技术实现要素：

8.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗gpc3抗体及其应用，用于解决现有技术中的问题。
9.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种抗gpc3抗体，代号为b174或gpc3-vhh-b174，所述抗gpc3抗体包括重链可变区，所述抗gpc3抗体具有如下技术特征中的一个或多个；
10.《1》重链可变区包括氨基酸序列如seq id no.1所示的cdr-h1；
11.《2》重链可变区包括氨基酸序列如seq id no.2所示的cdr-h2；
12.《3》重链可变区包括氨基酸序列如seq id no.3所示的cdr-h3。
13.本发明还提供一种分离的多肽，所述多肽包括跨膜域、胞内域和胞外域，所述胞外
域包括所述的抗gpc3抗体。
14.本发明还提供一种嵌合抗原受体免疫细胞，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达膜结合的所述的分离的多肽。
15.如上所述，本发明的抗gpc3抗体及其应用，具有以下有益效果：
16.(1)本发明的抗gpc3抗体仅包括重链可变区具备高亲和力和特异性，能够高效靶向gpc3抗原，且结构简单，易于制备；
17.(2)本发明中，利用所述抗gpc3抗体构建嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体能够高效靶向gpc3；
18.(3)本发明的嵌合抗原受体细胞能够特异性识别gpc3阳性肿瘤细胞，并进行高效杀伤，同时还能释放细胞因子如ifn-γ因子等发挥细胞杀伤作用。
附图说明
19.图1显示为biacore检测抗gpc3抗体(gpc3-vhh-b174)的亲和力结果图；
20.图2显示为抗gpc3纳米抗体识别gpc3抗原的facs检测结果图；
21.图3显示为靶向gpc3的嵌合抗原受体慢病毒载体质粒图谱；
22.图4显示为实施例4中表达抗gpc3的嵌合抗原受体结构示意图；
23.图5显示为t淋巴细胞的嵌合抗原受体(gpc3-vhh-b174)表达率的流式检测结果图；
24.图6a显示为本发明car-t细胞对293t细胞杀伤效果图；
25.图6b显示为本发明car-t细胞对huh7-gpc3细胞杀伤效果图；
26.图6c显示为本发明car-t细胞对hepg2细胞杀伤效果图；
27.图7显示为car-t细胞(gpc3-vhh-b174)的ifn-γ细胞因子分泌水平图。
具体实施方式
28.本发明提供一种抗gpc3的抗体，代号为b174或gpc3-vhh-b174，所述抗gpc3抗体包括重链可变区，所述抗gpc3抗体具有如下技术特征中的一个或多个；
29.《1》重链可变区包括氨基酸序列如seq id no.1所示的cdr-h1；
30.《2》重链可变区包括氨基酸序列如seq id no.2所示的cdr-h2；
31.《3》重链可变区包括氨基酸序列如seq id no.3所示的cdr-h3；
32.gftldyya(seq id no.1)
33.isstghst(seq id no.2)
34.aadivryycspvvygddygv(seq id no.3)。
35.cdr(互补决定区，complementarity determining region)通常指抗体中在空间结构上可以与抗原决定簇形成互补的区域。抗体中的可变性通常并不均匀地分布在整个抗体的可变区中，单克隆抗体的重链可变区通常具有3个超变区(hypervariable region，hvr)，这些区域在空间结构上通常可以与抗原决定簇形成互补，所以超变区也被称为互补决定区(complementarity determining region，cdr)，即重链可变区通常包括三个互补决定区，即hcdr1、hcdr2和hcdr3。
36.在本发明某些实施方式中，所述抗gpc3抗体的重链可变区的互补决定区包括氨基
酸序列如seq id no.1所示的cdr-h1、氨基酸序列如seq id no.2所示的cdr-h2和氨基酸序列如seq id no.3所示的cdr-h3。
37.所述抗gpc3抗体为抗体片段，和/或单克隆抗体。进一步的，所述单克隆抗体为igg1抗体。
[0038]“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区或可变区。例如，抗体片段包括纳米抗体(vhh)、单链抗体(scfv)、fab、fab'、f(ab')或f(ab')2。
[0039]
在本发明某些实施方式中，所述抗gpc3抗体为纳米抗体(nanobody,nb)，即重链单域抗体vhh(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)。纳米抗体只包含一个重链可变区(vhh)和ch2、ch3区，相比于其他抗体，纳米抗体轻链天然缺失。纳米抗体晶体直径约为2.5nm，长约4nm，是自然存在的可以和抗原结合的最小片段。本发明的抗gpc3抗体仅包括重链可变区，具备高亲和力和特异性，能够高效靶向gpc3抗原，结构简单，易于制备，在制备以gpc3为靶点的药物领域具有重要应用价值。
[0040]
在本发明某些实施方式中，所述抗gpc3抗体为单链抗体(single chain fv,scfv)。单链抗体通常可以为包括抗体的vh(重链可变区)和v
l
(轻链可变区)的多肽链。通常来说，单链抗体还可以包括连接肽(linker)，连接肽通常位于vh和v
l
之间，以使scfv形成能与抗原结合的期望结构。例如，所述抗gpc3抗体可以包括vh和v
l
，vh和v
l
之间可以设有连接肽，所述单链抗gpc3抗体自n端至c端可以依次包括v
l
、连接肽和vh，所述抗gpc3单链抗体自n端至c端也可以依次包括vh、连接肽和v
l
。所述连接肽可以是本领域中各种适用于形成scfv的连接肽，例如，所述连接肽可以是g4s3 linker，所述g4s3 linker的选择或设计可以参考文献michel sadelain etc，science translational medicine，2013；carl h.june etc,science translational medicine,2015。所述v
l
可以根据本领域常规技术获得。
[0041]
在本发明某些实施方式中，重链可变区还可以包括框架区，所述框架区可以位于互补决定区之间，也可以位于互补决定区的两端。在本发明某些具体实施方式中，所述框架区的序列为人源单抗可变区，或为鼠源单抗可变区的框架区序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的框架区序列，该框架区序列与人源单抗可变区序列的框架区序列可以具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的同源性。
[0042]
在本发明某些实施方式中，所述重链可变区还包括框架区。所述框架区包括框架区fr1～fr4。
[0043]
优选地，所述fr1的氨基酸序列如seq id no.4所示：evqlvesggglvqpggslrlscaas(seq id no.4)。
[0044]
优选地，所述fr2的氨基酸序列如seq id no.5所示：igwfrqapgkeregvsc(seq id no.5)。
[0045]
优选地，所述fr3的氨基酸序列如seq id no.6所示：nyadsvkdrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyyc(seq id no.6)。
[0046]
优选地，所述fr4的氨基酸序列如seq id no.7所示：wgqgtqvtvss(seq id no.7)。
[0047]
优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.8所示evqlvesggglvqpggslrlscaasgftldyyaigwfrqapgkeregvscisstghstnya dsvkdrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycaadivryycsgyvvpddygvwgqg tqvtvss(seq id no.8)。
[0048]
在本发明某些实施方式中，所述抗gpc3抗体从噬菌体抗体库中通过筛选得到，其重链可变区核苷酸序列如seq id no.9所示gaagtgcagctggtcgagtctggcggcggcctggtgcagccaggtgggagcctgagactgagctgcgcagcctccggctttacactggattactacgccatcggctggttcagacaggccccagggaaggagagggagggcgtgtcctgcatctcctccactggccactctaccaattatgccgacagcgtgaaagatagattcaccatctccagagataacgccaagaataccgtgtacctgcagatgaactccctgaaaccagaggacacagccgtgtactactgtgccgccgacatcgtgcgctattactgcagcggatacgtggtgcccgatgattacggggtgtgggggcagggcacccaggtgaccgtgtctagc(seq id no.9)。
[0049]
本发明另一方面提供一种分离的多核苷酸，编码所述抗gpc3抗体。
[0050]
在本发明某些实施方式中，所述多核苷酸的序列如seq id no.9所示。
[0051]
本发明另一方面提供所述抗gpc3抗体在制备或筛选治疗药物中的用途、或制备诊断药物中的用途。
[0052]
所述治疗药物可以是以gpc3抗原为作用靶标，结合或作用于所述gpc3抗原，从而治疗和/或预防适应症的药物。
[0053]
在本发明某些实施方式中，所述治疗药物可以是肿瘤治疗药物。所述肿瘤为表达gpc3的肿瘤。所述肿瘤治疗药物可以是以肿瘤细胞表面功能性表面的gpc3抗原为靶标，结合或作用于gpc3抗原，从而治疗和/或预防肿瘤的药物。所述肿瘤可以是肝癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、胃癌、甲状腺癌等gpc3表达阳性的肿瘤。
[0054]
在本发明某些实施方式中，所述治疗药物为嵌合抗原受体细胞。
[0055]
所述嵌合抗原受体细胞治疗药物通常包括嵌合抗原受体细胞，所述嵌合抗原受体细胞可以是嵌合抗原受体t细胞、嵌合抗原受体nk细胞等。所述嵌合抗原受体t细胞通常包括t淋巴细胞，其还包括嵌合抗原受体。所述嵌合抗原受体nk细胞通常包括nk细胞，其还包括嵌合抗原受体。所述嵌合抗原受体包括跨膜域、胞内域和胞外域。在本发明某些实施方式中，所述胞外域包括所述抗gpc3抗体，即所述嵌合抗原受体细胞可以在细胞表面表达所述抗gpc3抗体，从而可以引导该细胞对表达gpc3抗原的细胞(例如肿瘤细胞)进行作用的药物。所述对表达gpc3抗原的细胞进行作用可以是杀伤表达gpc3抗原的细胞等。
[0056]
所述诊断药物具体指针对作用靶标gpc3抗原，以gpc3抗原作为生物标志物进行诊断的试剂。
[0057]
本发明另一方面提供一种分离的多肽，所述多肽包括跨膜域、胞内域和胞外域，所述胞外域包括所述抗gpc3抗体。
[0058]
在本发明某些实施方式中，所述多肽为嵌合抗原受体。本发明中，利用所述抗gpc3抗体构建嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体能够高效靶向gpc3。
[0059]
在本发明某些实施方式中，所述跨膜域可以选自cd8α跨膜区、cd28跨膜区、dap 10跨膜区等中的任意一种或多种跨膜结构域。
[0060]
再例如，cd8α的序列可参照nm_001145873，cd28的序列可参照nm_006139，dap10的序列可参照nm_014266。
[0061]
在本发明某些实施方式中，所述胞内域可以包括共刺激结构域和/或信号转导结构域。所述信号转导结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序。所述免疫受体酪氨酸活化基序可以选自cd3ζ。
[0062]
优选地，所述信号转导结构域还包括共刺激分子。例如，所述共刺激分子可以选自
4-1bb、cd28、ox40、icos、dap 10等任意一种或至少两种蛋白分子的组合。再例如，所述4-1bb的氨基酸序列可以包括如下所示：
[0063]
krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seq id no.12)
[0064]
再例如，4-1bb的序列可参照nm_001561，cd28的序列可参照nm_006139，ox40的序列可参照nm_003327，icos的序列可参照nm_012092，cd3 zeta的序列可参照nm_198053、dap 10的序列可参照nm_014266。
[0065]
在本发明一具体实施方式中，所述胞内域自n端至c端依次包括4-1bb和cd3 zeta。
[0066]
在本发明某些实施方式中，所述胞外域可以包括信号肽、抗gpc3抗体、铰链区。
[0067]
在本发明某些实施方式中，所述信号肽包括cd8α信号肽。
[0068]
在本发明某些实施方式中，所述铰链区选自cd8α铰链区。
[0069]
在本发明某些实施方式中，所述多肽自n端至c端依次包括cd8α信号肽、所述抗gpc3抗体、跨膜域、胞内域。
[0070]
在本发明一些具体实施方式中，所述多肽自n端至c端依次包括cd8α信号肽、抗gpc3纳米抗体、cd8α铰链区、cd8α跨膜区、共刺激分子结构域、cd3 zeta信号结构域。
[0071]
在本发明一些具体实施方式中，所述多肽自n端至c端依次包括cd8α信号肽、抗gpc3纳米抗体、cd8α铰链区、cd8α跨膜区、4-1bb共刺激结构域、cd3 zeta信号结构域。
[0072]
在本发明一具体实施方式中，所述多肽自n端至c端依次包括cd8α信号肽、所述抗gpc3纳米抗体、cd8α铰链区、cd28跨膜区、cd28共刺激结构域、cd3 zeta信号结构域。
[0073]
在本发明另一具体实施方式中，所述多肽自n端至c端依次包括cd8α信号肽、所述抗gpc3纳米抗体、cd8α铰链区、cd8α跨膜区、ox40共刺激结构域、cd3 zeta信号结构域。
[0074]
在本发明另一具体实施方式中，所述多肽自n端至c端依次包括cd8α信号肽、所述抗gpc3纳米抗体、cd8α铰链区、cd8α跨膜区、icos共刺激结构域、cd3 zeta信号结构域。
[0075]
在本发明另一具体实施方式中，所述多肽自n端至c端依次包括cd8α信号肽、所述抗gpc3纳米抗体、cd8α铰链区、cd8α跨膜区、4-1bb共刺激结构域、cd3 zeta。
[0076]
在本发明另一具体实施方式中，所述多肽自n端至c端依次包括cd8α信号肽、所述抗gpc3纳米抗体、cd8α铰链区、cd28跨膜区、cd28共刺激结构域、ox40共刺激结构域、cd3 zeta信号结构域。
[0077]
在本发明某些具体实施方式中，编码所述分离的多肽的多核苷酸序列如seq id no.22所示：
[0078]
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaagtgcagctggtcgagtctggcggcggc
[0079]
ctggtgcagccaggtgggagcctgagactgagctgcgcagcctccggctttacactggattactacgccatcggctggttcagacaggcccca
[0080]
gggaaggagagggagggcgtgtcctgcatctcctccactggccactctaccaattatgccgacagcgtgaaagatagattcaccatctccaga
[0081]
gataacgccaagaataccgtgtacctgcagatgaactccctgaaaccagaggacacagccgtgtactactgtgccgccgacatcgtgcgctatt
[0082]
actgcagcggatacgtggtgcccgatgattacggggtgtgggggcagggcacccaggtgaccgtgtctagcaccacgacgccagcgccgc
[0083]
gaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcac
[0084]
acgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttact
[0085]
gcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccg
[0086]
atttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaacca
[0087]
gctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccg
[0088]
cagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcg
[0089]
agcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctga(seq id no.22)。
[0090]
本发明还提供一种核酸构建体，含有编码所述的分离的多肽的多核苷酸。
[0091]
所述核酸构建体可以为慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体。以慢病毒载体为例，慢病毒载体包括载体骨架即空载体与表达框架。即所述核酸构建体为含有所述的嵌合抗原受体的编码基因的载体。
[0092]
术语“载体”是指用于将一个或多个核酸或一个或多个多核苷酸引入或转移到靶细胞或组织中的核酸片段或多核苷酸片段。典型地，载体用于将外源dna引入另一个细胞或组织中。载体可以包含用于在细菌中生长的细菌抗性基因和用于在生物体中表达目的蛋白质的启动子。dna可以通过pcr或任何其他本领域技术人员已知的一种或多种合适的技术在体外产生。
[0093]
术语“表达框架”是指具有编码蛋白质潜能的序列。
[0094]
本发明还提供一种慢病毒，所述慢病毒由所述核酸构建体经病毒包装而成。所述慢病毒中含有所述的核酸构建体。
[0095]
本发明还提供一种慢病毒载体系统，其特征在于，所述慢病毒载体系统包括所述的核酸构建体以及辅助质粒。
[0096]
更进一步的，所述辅助质粒编码gag和pol蛋白的一个或者多个核苷酸序列以及其它必需的病毒包装组件核苷酸序列，所述辅助质粒可以包括包装质粒和包膜质粒。在一种实施方式中，包装质粒为gag/pol，包膜质粒为vsvg，两种质粒均可通过市购获得，例如addgene货号为14887和8454。
[0097]
进一步的，所述慢病毒载体系统还包括宿主细胞，所述宿主细胞可以为生产慢病毒的细胞，例如可以为哺乳动物细胞，具体的如293t细胞。
[0098]
利用所述慢病毒载体系统中的核酸构建体和辅助质粒转染宿主细胞后可以得到所述慢病毒。
[0099]
本发明另一方面提供一种嵌合抗原受体免疫细胞，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达膜结合的所述分离的多肽。
[0100]
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括所述的核酸构建体和/或所述的慢病毒。
[0101]
所述免疫细胞选自t淋巴细胞、b淋巴细胞、nk细胞、肥大细胞或巨噬细胞中的任意一种。
[0102]
在本发明另一具体实施方式中，所述嵌合抗原受体免疫细胞为t淋巴细胞。
[0103]
所述t淋巴细胞通常可以表达所述多肽，其通常可以结合于gpc3抗原，更具体可以通过包含所述抗gpc3抗体的胞外域结合于gpc3抗原，当所述多肽结合于所述gpc3抗原时，所述t淋巴细胞通常可以活化和/或刺激从而得以增殖。在本发明某些实施方式中，所述t淋巴细胞即嵌合抗原受体t细胞可以在t淋巴细胞表面表达所述抗gpc3抗体，从而可以引导t淋巴细胞对表达gpc3抗原的细胞(例如肿瘤细胞)进行作用，所述作用可以是杀伤表达gpc3抗原的细胞等。
[0104]
在本发明另一具体实施方式中，所述嵌合抗原受体免疫细胞为nk细胞。
[0105]
所述nk细胞通常可以表达所述多肽，并通常可以结合于gpc3抗原，更具体可以通过包含所述抗gpc3抗体的胞外域结合于gpc3抗原，当所述多肽结合于所述抗原时，所述nk细胞通常可活化和/或刺激从而得以增殖。在本发明某些实施方式中，所述nk细胞即嵌合抗原受体nk细胞可以在nk细胞表面表达所述抗gpc3抗体，从而可以引导nk细胞对表达gpc3抗原的细胞(例如肿瘤细胞)进行作用的，所述作用可以是杀伤表达gpc3抗原的细胞等。
[0106]
本发明另一方面提供所述分离的多肽、分离的多核苷酸、核酸构建体、慢病毒、嵌合抗原受体免疫细胞在制备或筛选治疗药物中的用途、或制备诊断药物中的用途。
[0107]
所述治疗或诊断药物可以是以gpc3抗原为作用靶标，结合或作用于所述gpc3抗原，从而治疗和/或预防适应症的药物。
[0108]
在本发明某些实施方式中，所述治疗药物可以是肿瘤治疗药物。所述肿瘤治疗药物可以是以肿瘤细胞表面功能性表达的gpc3抗原为靶标，结合或作用于gpc3抗原，从而治疗和/或预防肿瘤的药物。所述肿瘤可以是胃癌、肺癌、胰腺癌、肠癌等gpc3表达阳性的肿瘤。
[0109]
本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括所述的嵌合抗原受体免疫细胞和/或所述抗gpc3抗体和/或所述分离的多肽。
[0110]
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或辅料。
[0111]“药学上可接受的”是指当药物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
[0112]“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
[0113]
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实
施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0114]
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0115]
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0116]
实施例1
[0117]
本实施例构建噬菌体纳米抗体库并进行淘选与elisa初步筛选。
[0118]
1、噬菌体纳米抗体库的构建
[0119]
(1)采用表达胞外区的gpc3-fc(购买自北京百普赛斯生物)免疫双峰驼，elisa验证效价后，抽取200ml外周血；
[0120]
(2)分选淋巴细胞，获得外周血单核淋巴细胞沉淀，提取rna；
[0121]
(3)用iii反转录酶以rna为模板合成第一链cdna，然后利用巢式pcr扩增vhh基因；
[0122]
(4)将vhh基因插入pmecs噬菌体展示载体(成都阿帕克生物)，电转化tg1感受态细胞后，取菌液进行文库鉴定，剩余所有培养物均匀涂布于lb/amp glu平板，待菌长出后收集菌苔，加入1/3体积的50％甘油，混匀分装，-80℃保存，成功构建了库容大于109的噬菌体展示骆驼vhh免疫文库。
[0123]
2、噬菌体纳米抗体库的淘选
[0124]
将纯化的gpc3-his重组蛋白用pbs缓冲液稀释至4μg/ml，取96孔酶标板，选择3复孔，每孔加入100μl(400ng/孔)，4℃包被过夜，pbs作为阴性对照；弃去包被液，每孔加入150μl 2％浓度脱脂内粉，25℃封闭1h；用pbst洗涤4次，取制备好的噬菌体溶液，用2％脂奶粉，稀释至5
×
10
11
pfu/ml，加入酶标板，100μl/孔，25℃孵育2h；弃去噬菌体样品，用pbst洗涤10次，再用pbs洗涤5次，每孔加入100μl新鲜配制的0.1m三乙胺，25℃静置10min，吸出洗脱液迅速用等体积1m tris-hcl(ph7.4)中和；取部分洗脱液测定噬菌体滴度；另取400μl洗脱液，侵染4ml新鲜培养对数期tg1菌液(od600约0.6)，37℃孵育30min，加入16ml 2
×
yt/amp-glu(氨苄青霉素amp和葡萄糖glu的浓度分别为1μg/ml和2％)培养，37℃、200r/min培养至od
600
达到0.7。取100μl细菌悬液进行梯度稀释后均匀涂抹于2
×
yt/氨苄青霉素/葡萄糖琼脂平板上以便进行文库库容和多样性测定；取100μl细菌悬液即噬菌体展示载体文库接种于2
×
yt/amp-glu培养基中，培养至对数期，加入辅助噬菌体，实施文库救援，获得噬菌体颗粒需测定噬菌体滴度，然后浓缩纯化得到噬菌体粒子用于下一轮筛选；剩余菌液经过离心后使用适当体积的2
×
yt培养液重悬，涂抹于带有筛选抗性的平板上进行过夜培养，使用适量的液体培养液从平板上刮取细菌，加入含1/3体积的50％甘油的2
×
yt培养液进行重悬后
分装，所有细菌保存在-80℃。
[0125]
上述筛选操作重复3次。
[0126]
在体外对免疫纳米抗体库进行3轮固相筛选，使具有结合活性的噬菌体克隆得到了有效富集。对单克隆噬菌体进行原核诱导表达后，通过elisa进一步筛选出了可结合抗原胞外区的噬菌体克隆。
[0127]
3、噬菌体包装
[0128]
取100μl冻存的上一轮淘选菌液加入到100ml 2
×
yt/amp-glu培养液中37℃振荡(200rpm)培养至对数期(od
600
值为0.6)，加入90μl辅助噬菌体m13k07(1.7
×
10
13
pfu/ml)，该混合物首先37℃静置30min，2800
×
g离心10min收集菌体，用200ml 2
×
yt/amp-glu培养基重悬，37℃振荡(200rpm)培养12h，4℃、3800
×
g离心30min去除菌体收集上清并加入1/5体积预冷的peg/nacl混匀，沉淀噬菌体2h，4℃、3800
×
g离心30min收集噬菌体后，用终体积2ml pbs溶液重悬并转移至15ml离心管中，4℃、12000
×
g离心15min收集上清，加入1/5体积预冷的peg/nacl溶液，上下颠倒混匀，冰上静置2h；4℃、10000
×
g离心10min，弃上清，用1ml pbs重悬噬菌体沉淀，4℃摇床孵育过夜，使噬菌体颗粒充分溶解，噬菌体溶液与等体积60％甘油混合后分装至1.5ml ep管中并保存于-80℃。
[0129]
使用gpc3抗原对噬菌体文库进行3轮淘选，为了避免丢失序列的多样性，初步的elisa筛选将从第2轮和第3轮的淘选产物中进行，阳性克隆从淘选产物中随机挑选出来并进行诱导表达，表达上清即为粗提vhh抗体，通过测序确定单克隆菌株的vhh抗体序列。
[0130]
实施例2
[0131]
本实施例进行荧光激活细胞分选(facs)候选克隆。
[0132]
按照标准细胞培养方案进行细胞培养，使用胰酶消化细胞制备gpc3阳性及阴性细胞悬液，离心(300
×
g，5min)去除培养液后用flow buffer(pbs+2％ fbs)重悬细胞至2
×
106cell/ml，v形底96孔板中每孔加入2
×
105个细胞的细胞悬液，300
×
g离心5min后去除上清，添加vhh抗体粗提物重悬细胞，并在4℃孵育1h，300
×
g离心5min后去除上清，flow buffer重悬细胞，使用flow buffer稀释apc anti-his抗体至2μg/ml，每孔100μl重悬细胞，4℃孵育1h，flow buffer清洗细胞3次后使用200μl flow buffer重悬细胞并上流式细胞仪检测，筛选到十种候选抗体，命名为gpc3-vhh-b6、gpc3-vhh-b51、gpc3-vhh-b89、gpc3-vhh-b108、gpc3-vhh-b168、gpc3-vhh-b174、gpc3-vhh-b174(v18)、gpc3-vhh-b174(v32)、gpc3-vhh-b174(v33)和gpc3-vhh-b174(v34)，由于存在单一性问题，因此本技术仅要求保护gpc3-vhh-b174，其他候选抗体在其他专利中申请保护。
[0133]
实施例3
[0134]
本实施例进行vhh-migg2a fc纳米抗体表达、纯化以及抗体亲和力测定。
[0135]
为了进一步对实施例2筛选得到的抗体进行鉴定，需要通过哺乳动物细胞中表达所述抗体，因此，首先构建了带有小鼠fc标签表达vhh的质粒载体c-4pcp.stuffer-mcg2a-fc(购自上海百英生物)，构建方法包括以下步骤：
[0136]
(1)使用pcr扩增vhh片段，其反应体系(试剂购自neb)及pcr反应条件如下表1所示；
[0137]
表1
[0138][0139]
(2)酶切体系及反应条件分别如表2所示，酶切后的载体用pcr纯化试剂盒进行纯化，风干的dna溶解到20μl水中，检测dna的浓度；
[0140]
表2
[0141][0142]
(3)同源重组反应体系为10μl(试剂购自诺唯赞)，如表3所示；
[0143]
表3
[0144][0145]
(4)取全部同源重组反应体系加入dh5α感受态细胞中，转化dh5α感受态细胞，转化条件如表4所示；
[0146]
表4
[0147]
[0148][0149]
(5)转化平板挑选单克隆pcr预鉴定，pcr鉴定体系条件如表5所示(试剂购自生工)；送测序公司测序鉴定，测序结果符合预期，成功构建了带有小鼠fc标签表达vhh的质粒载体。
[0150]
表5
[0151][0152]
在质粒转染前约24h，传代293e细胞，使细胞密度约为2.6
×
106cells/ml，取0.15mg vhh-migg2a(上述构建好的质粒)/100ml 293e用pei法转染293e细胞，dna:pei＝1:2。37℃、130rpm、8％ co2摇床培养6天，3000rpm，30min收集细胞培养物上清，把收集到的包含目的抗体的上清经millex-gp filter unit 0.45μm sterile过滤后，用mabselect
tm sure
tm
离心浓缩，1
×
pbs洗涤柱体，0.1m(mol/l)gly-hcl洗脱蛋白，并用1/10体积且ph 8.5的tris-hcl中和，蛋白4℃透析过夜后，用nanodrop 2000测定a280的方法定量，sec-hplc测定抗体纯度。
[0153]
另外，将纯化后的10种gpc3 vhh抗体(gpc3-vhh-b6、gpc3-vhh-b51、gpc3-vhh-b89、gpc3-vhh-b108、gpc3-vhh-b168、gpc3-vhh-b174、gpc3-vhh-b174(v18)、gpc3-vhh-b174(v32)、gpc3-vhh-b174(v33)和gpc3-vhh-b174(v34))通过biacore进行亲和力的测定。biacore是基于表面等离子共振(surface plasmon resonance,spr)开发的生物分析传感技术，可检测跟踪溶液中的分子与固定在芯片表面的分子结合、解离的整个变化过程，以传感图的形式进行记录，并提供动力学和亲和力数据，测定过程中，将抗体固化到芯片表面，流动相为含有抗原的溶液，测定结果如表6和图1所示，由测定结果可知，这10种gpc3 vhh抗体具有高亲和力。
[0154]
表6
[0155]
vhh抗体ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)gpc3-vhh-b1741.56e+050.0066284.26e-08
[0156]
实施例4
[0157]
本实施例对抗gpc3纳米抗体进行流式测定。
[0158]
将huh7-gpc3肿瘤细胞与纯化的10株重组抗gpc3 vhh抗体在冰浴下孵育30min，空白对照组不加抗gpc3 vhh抗体，然后用apc标记的羊抗鼠igg抗体或if488-anti-vhhcocktail抗体孵育30min，采用流式细胞仪检测，结果如图2所示，表明本发明筛选制备的抗gpc3抗体能够识别细胞表面的gpc3抗原。
[0159]
实施例5
[0160]
本实施例制备表达靶向gpc3的嵌合抗原受体(gpc3 car)的慢病毒载体。
[0161]
首先，构建携带gpc3 car嵌合抗原受体的慢病毒载体hd-sin03 gpc3 car，载体图谱如图3所示，嵌合抗原受体的结构如图4所示，car的核苷酸序列如seq id no.22所示，包括cd8α信号肽、抗gpc3的抗体(anti-gpc3 vhh)、cd8α铰链区、跨膜区和免疫受体酪氨酸活化基序(cd3ζ)。
[0162]
其中，信号肽的氨基酸序列为：malpvtalllplalllhaarp(seq id no.10)。
[0163]
anti-gpc3 vhh的氨基酸序列如seq id no.8所示。
[0164]
cd8α铰链区和跨膜区的氨基酸序列为：
[0165]
tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyc(seq id no.11)。
[0166]
4-1bb胞内区氨基酸序列为：
[0167]
krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seq id no.12)。
[0168]
cd3ζ氨基酸序列为：
[0169]
rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seq idno.13)。
[0170]
具体的制备方法如下：
[0171]
(1)按照表8配制pcr反应体系(试剂购自toyobo)，扩增信号肽-gpc3-vhh片段，使用引物如表7所示。
[0172]
表7
[0173][0174][0175]
表8
[0176]
试剂体积(μl)10x缓冲液52mm dntp525mm mgso4310μm primer f110μm primer r1模板dna(cdnaclone)1pcr级纯水33
kod-plus-neo1
[0177]
以上试剂来源于toyobo inc.。
[0178]
配制结束后按照表9所示的pcr程序进行反应。
[0179]
表9
[0180][0181]
反应结束后，pcr产物行1％琼脂糖凝胶电泳，回收500bp左右的片段，紫外吸收法定量。(2)按照表11配制pcr反应体系，扩增cd8a hinge-tm-41bb-cd3z片段，使用引物如表10所示。
[0182]
表10
[0183]
引物序列序列号cd8h2-fcgacgccagcgccgcgaccaccseq id no.16vector-rtcgataagcttgatatcgseq id no.17
[0184]
表11
[0185][0186][0187]
配制结束后按照表9所示的pcr程序进行pcr反应，反应结束后，pcr产物行1％琼脂糖凝胶电泳，回收700bp左右的片段，紫外吸收法定量。
[0188]
(3)将5μg hd sin03 cd19 41bbz(ka)质粒进行bamhi和ecori双酶切，37℃水浴反应2h后，回收载体骨架大片段。
[0189]
(4)将上述步骤1和2回收的2个片段和步骤3得到的载体用重组酶连接，重组反应体系如表12所示，配制结束后37℃水浴反应0.5h，按常规方法转化至大肠杆菌stbl3感受态
细胞，从固体培养基上挑选单克隆，过夜培养，进行pcr鉴定，pcr反应物配制如表13所示，pcr程序如表14所示，pcr结束后挑选阳性克隆进一步测序鉴定，测序结果符合预期。
[0190]
表12
[0191]
试剂用量hd sin03 cd19 41bbz(ka)150ngcd8a signal gpc3 vhh15ngcd8a hinge-tm-41bb-cd3z15ng5x ce multis buffer(购自诺唯赞)2μlexnase multis(购自诺唯赞)1μlpcr级纯水up to 10μl总体积10μl
[0192]
表13
[0193][0194][0195]
表14
[0196][0197]
实施例6
[0198]
本实施例进行慢病毒的包装，包括以下步骤：
[0199]
(1)以1.6
×
107细胞数接种293t细胞于15cm培养皿中，37℃，5％ co2培养过夜准备包装病毒，培养基为dmem，添加10％胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)；
[0200]
(2)将30μg实施例5中构建的慢病毒载体分别与12.5μg辅助质粒gag/pol与10μg包膜质粒vsvg溶入2000μl无血清dmem培养液，混匀；
[0201]
(3)将157.5μg pei(1μg/μl)溶解于2000μl的无血清dmem培养液中，1000rpm涡旋5秒钟，25℃孵育5min；
[0202]
(4)转染复合物的形成：将pei混合液加入dna混合液中，加入后立即涡旋混合或轻轻混匀，25℃下孵育20min；
[0203]
(5)将转染复合物4ml滴加入含25ml dmem培养基的15cm培养皿中，4h小时后，更换新鲜培养基；
[0204]
(6)48h后，收集病毒液上清，得到10种表达不同结构嵌合抗原受体的慢病毒。
[0205]
实施例7
[0206]
本实施例进行慢病毒浓缩。
[0207]
将实施例6制备的病毒上清用0.45μm滤膜过滤后收集到50ml离心管中，加入1/4的peg-nacl病毒浓缩液，上下颠倒混匀，4℃放置过夜；4℃，3500rpm，离心30min；去上清，加入rpmi 1640培养基(含10％ fbs)，溶解重悬病毒沉淀；浓缩后的慢病毒悬液分装成50μl每份，保存在成品管中，储存在-80℃。
[0208]
实施例8
[0209]
本实施例进行慢病毒滴度检测。
[0210]
将500μl jurkat细胞(1
×
105个细胞)接种细胞于48孔培养板；将实施例7浓缩后的慢病毒分别以1μl、0.2μl和0.04μl添加到细胞悬液中，并添加polybrene至终浓度5μg/ml；37℃，5％ co2培养过夜后，更换新鲜培养基；感染72h后，400
×
g离心5min，弃上清收集细胞，加100μl pbs+2％ fbs重悬细胞，加入1μg的if488-anti-vhh cocktail抗体(购自金斯瑞)，冰上孵育30min；pbs+2％ fbs清洗2次后，加入300μl pbs+2％fbs重悬细胞，采用流式细胞仪检测感染效率；取阳性率为15％的细胞样品为宜，计算滴度(tu/ml)＝细胞数量(105)
×
阳性率/病毒体积(ml)。
[0211]
实施例9
[0212]
本实施例利用慢病毒转导t淋巴细胞。
[0213]
用pbs将抗人cd3抗体和抗人cd28抗体稀释，终浓度分别为1μg/ml和0.5μg/ml，包被孔板，4℃冰箱静置过夜；弃去孔板中的抗体包被液，1ml pbs洗两次；用t细胞培养基(x-vivo+10％ fbs+il-2(300u/ml))将人pbmc调整至密度为1
×
106/ml，然后接种到cd3和cd28抗体包被的孔板中活化48h；收集活化的t细胞，调整细胞密度为1
×
106/ml，按照感染复数(multiplicity of infection，moi)＝10加入实施例7制备的慢病毒，添加polybrene至终浓度为5μg/ml；于37℃、5％ co2环境中培养过夜后更换新鲜培养基，每2天进行传代。
[0214]
实施例10
[0215]
本实施例进行gpc3过表达细胞株(huh7-gpc3和sk-hep1-gpc3)的构建，包括以下步骤：
[0216]
1、gpc3过表达质粒的构建：
[0217]
按照表16配制pcr反应体系，分别扩增gpc3 cds片段以及p2a-puror片段，使用引物如表15所示。
[0218]
表15
[0219][0220]
表16
[0221][0222][0223]
以上试剂来源于toyobo inc.。
[0224]
配制结束后按照表17所示的pcr程序进行反应。
[0225]
表17
[0226][0227]
反应结束后，pcr产物行1％琼脂糖凝胶电泳，回收1800bp左右的gpc3 cds片段以及665bp左右的p2a-puror片段，紫外吸收法定量。
[0228]
(2)将4μg psin cea 1a6-41bbz(kanar)质粒进行bamhi和ecori双酶切，37℃水浴反应2h后，回收载体骨架大片段。
[0229]
(3)将上述步骤1回收的2个片段和步骤2得到的载体用重组酶连接，重组反应体系如表18(试剂购自诺唯赞)所示，配制结束后37℃水浴反应0.5h，按常规方法转化至大肠杆菌stbl3感受态细胞，从固体培养基上挑选单克隆，过夜培养，进行pcr鉴定，pcr反应物配制
如表13所示，pcr程序如表14所示，pcr结束后挑选阳性克隆进一步测序鉴定，测序结果符合预期。
[0230]
表18
[0231][0232][0233]
2、gpc3过表达慢病毒的包装：
[0234]
gpc3过表达慢病毒病毒的包装过程同实施例6。
[0235]
3、gpc3过表达细胞株的构建：
[0236]
(1)huh7细胞和sk-hep1细胞(均购自中科院上海细胞库)消化计数，重悬于dmem+10％ fbs培养基中，取1
×
105细胞铺于6孔板中，分别添加1ml gpc3过表达的慢病毒，补充培养基至2ml，添加polybrene至终浓度为5μg/ml，37℃，5％ co2培养过夜；
[0237]
(2)将感染病毒的huh7细胞和sk-hep1细胞更换新鲜dmem+10％ fbs培养基2ml，继续37℃，5％ co2培养；
[0238]
(3)培养3天后，分别加入终浓度为0.5μg/ml和1μg/ml的puromycin筛选阳性细胞；
[0239]
(4)培养3天后，感染病毒的huh7细胞和sk-hep1细胞传代，继续加入终浓度为1μg/ml的puromycin筛选；
[0240]
(5)以3-4天为一个周期，继续进行感染病毒的huh7细胞和sk-hep1细胞的传代和puromycin筛选，总筛选时间大约2周后，检测gpc3的表达并进行细胞冻存。
[0241]
实施例11
[0242]
本实施例进行t淋巴细胞嵌合抗原受体表达，包括以下步骤：
[0243]
1、感染5天后，取3
×
105的t细胞，4℃、400
×
g离心5min，弃上清，pbs+2％ fbs清洗一次；
[0244]
2、加100μl pbs+2％ fbs重悬细胞，加入1μg的if488-anti-vhh cocktail抗体，冰上孵育30min；pbs+2％ fbs清洗2次后，加入300μl pbs+2％ fbs重悬细胞，以未经感染t细胞作为对照，采用流式细胞仪检测感染效率，结果如图5所示，感染后的car-t细胞有明显的阳性细胞群，表明本发明成功构建了10种表达不同结构嵌合抗原受体的car-t细胞，分别标记为gpc3-vhh-b6、gpc3-vhh-b51、gpc3-vhh-b89、gpc3-vhh-b108、gpc3-vhh-b168、gpc3-vhh-b174、gpc3-vhh-b174(v18)、gpc3-vhh-b174(v32)、gpc3-vhh-b174(v33)和gpc3-vhh-b174(v34)。
[0245]
实施例12
[0246]
本实施例中对car-t细胞进行体外毒性实验。
[0247]
1、靶细胞接种：
[0248]
将293t(gpc3-，购自atcc)、huh7-gpc3(gpc3+)、hepg2(gpc3+)，购自上海酶研生物)作为靶细胞，调整靶细胞浓度为1
×
105/ml，取100μl接种到96孔板；
[0249]
2、效应细胞接种：
[0250]
gpc3 car-t以及对照t细胞为效应细胞，按效靶比0.3:1、1:1和3:1向96孔板中加入car-t细胞及对照t细胞；
[0251]
3、各组均设3个复孔，取3个复孔的平均值。其中各实验组和各对照组如下：
[0252]
实验组：各靶细胞+car-t；
[0253]
对照组1：靶细胞最大释放ldh；
[0254]
对照组2：靶细胞自发释放ldh；
[0255]
对照组3：效应细胞自发释放ldh；
[0256]
4、检测方法：
[0257]
效应细胞与靶细胞共培养18h后，采用cytotox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(promega公司)进行。
[0258]
该方法是基于比色法的检测方法，通过检测乳酸脱氢酶(ldh)的含量反映细胞的裂解程度。ldh是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的ldh培养基上清中，可通过偶联酶反应来检测，在酶反应中ldh可使一种四唑盐(int)转化为红色的甲臜(formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。
[0259]
具体参照cytotox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。
[0260]
5、细胞毒性计算公式为：
[0261][0262]
结果如图6a-6c所示，构建的car-t细胞对gpc3阴性细胞无明显杀伤作用，对gpc3阳性的肿瘤细胞具有较强的杀伤活性。
[0263]
实施例13
[0264]
本实施例检测car-t细胞因子分泌。
[0265]
1.细胞培养上清
[0266]
将实施例12中效靶比1:1的细胞培养物400
×
g离心10min去除沉淀物，取上清置于-80℃贮存待检。
[0267]
2.试剂准备
[0268]
使用联科生物elisa试剂盒(货号为：人γ干扰素elisa试剂盒：ek180-96)进行检测，检测前将所有的试剂、样本恢复至25℃，按照使用说明配制1
×
洗液，1
×
检测缓冲液，检测抗体。
[0269]
3.标准品及样品配制
[0270]
标准品：使用5％1640培养基2倍稀释标准品原液，一共8个稀释梯度，包括零浓度。样品：使用5％1640培养基按比稀释样品。
[0271]
4.检测步骤
[0272]
(1)浸泡酶标板：加入300μl 1
×
洗液静置浸泡30s，弃掉洗液之后，在吸水纸上将微孔板拍干；
[0273]
(2)加标准品：标准品孔加入100μl 2倍倍比稀释的标准品，空白孔加入100μl 5％1640培养基；
[0274]
(3)加样本：样本孔加入100μl细胞培养上清；
[0275]
(4)加检测抗体：每孔加入50μl稀释的检测抗体(1:100稀释)；
[0276]
(5)孵育：使用封板膜封板，300rpm振荡，25℃孵育2h；
[0277]
(6)洗涤：弃掉液体，每孔加入300μl洗液洗板，洗涤6次；
[0278]
(7)加酶孵育：每孔加入100μl稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1:100稀释)；
[0279]
(8)孵育：使用新的封板膜封板，300rpm振荡，25℃孵育45min；
[0280]
(9)洗涤：重复步骤(6)；
[0281]
(10)加底物显色：每孔加入100μl显色底物tmb，避光，25℃孵育15min；
[0282]
(11)加终止液：每孔加入100μl终止液，充分混匀；
[0283]
(12)检测读数：使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收波长和630nm参考波长下的od值，校准后的od值为450nm的测定值减去630nm的测定值。
[0284]
ifn-γ因子分泌结果如图7所示，其中自发为car-t细胞单独培养物，在自发以及293t和car-t培养物中检测到微量ifn-γ因子，huh7-gpc3、sk-hep1-gpc3和hepg2分别与car-t培养物中均检测到较高含量的ifn-γ因子，表明本发明构建的car-t细胞还能够对gpc3阳性的肿瘤细胞释放细胞因子而发挥杀伤功能，且具备高特异性，对gpc3阴性细胞无明显细胞因子分泌。
[0285]
综上所述，本发明筛选制备抗gpc3抗体，所述抗gpc3抗体具备高亲和力和特异性，能够有效靶向肿瘤抗原gpc3，利用所述抗gpc3抗嵌合抗原受体，并进一步制备嵌合抗原受体细胞，所述嵌合抗原受体细胞能够高效杀伤肿瘤细胞，并能分泌多种细胞因子发挥杀伤功能，且具备高特异性。
[0286]
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

技术特征：
1.一种抗gpc3抗体，其特征在于，所述抗gpc3抗体包括重链可变区，所述抗gpc3抗体具有如下技术特征中的一个或多个；<1>重链可变区包括氨基酸序列如seq id no.1所示的cdr-h1；<2>重链可变区包括氨基酸序列如seq id no.2所示的cdr-h2；<3>重链可变区包括氨基酸序列如seq id no.3所示的cdr-h3。2.根据权利要求1所述的抗gpc3抗体，其特征在于，所述重链可变区还包括框架区，所述框架区包括框架区fr1～fr4，所述框架区fr1～fr4的氨基酸序列如seq id no.4～7所示。3.根据权利要求1所述的抗gpc3抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如seqid no.8所示。4.根据权利要求1所述的抗gpc3抗体，其特征在于，所述抗gpc3抗体为纳米抗体或单链抗体。5.权利要求1～4任一所述的抗gpc3抗体在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途。6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为表达gpc3的肿瘤；优选的，所述肿瘤选自肝癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、胃癌或甲状腺癌；优选的，所述肿瘤治疗药物为嵌合抗原受体细胞。7.一种分离的多肽，所述多肽包括跨膜域、胞内域和胞外域，所述胞外域包括权利要求1～4任一所述的抗gpc3抗体。8.根据权利要求7所述的多肽，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：1)所述多肽为嵌合抗原受体；2)所述跨膜域选自cd8α跨膜区、cd28跨膜区、dap 10跨膜区中的任意一种或多种；3)所述胞内域包括共刺激分子结构域和/或信号转导结构域；优选的，所述信号转导结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序；更优选的，所述免疫受体酪氨酸活化基序选自cd3ζ；优选的，所述共刺激分子选自4-1bb、cd28、ox40、icos、dap 10中的任意一种或至少两种的组合；4)所述胞外域包括信号肽、抗gpc3抗体、铰链区；优选的，所述信号肽包括cd8α信号肽；优选的，所述铰链区选自cd8α铰链区；5)所述多肽自n端至c端依次包括cd8α信号肽、抗gpc3纳米抗体、cd8α铰链区、cd8α跨膜区、共刺激分子结构域、cd3 zeta信号结构域。9.一种分离的多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1～4任一所述的抗gpc3抗体或权利要求7～8任一所述的多肽。10.一种核酸构建体，其特征在于，含有编码权利要求7～8任一所述的分离的多肽的多核苷酸。11.根据权利要求10所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体为慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种。12.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒由权利要求10或11所述的核酸构建体经病毒包装而成。13.一种慢病毒载体系统，其特征在于，所述慢病毒载体系统包括权利要求10或11所述的核酸构建体以及辅助质粒或宿主细胞。
14.一种嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达膜结合的权利要求7～8任一所述的分离的多肽。15.根据权利要求14所述的嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞选自t淋巴细胞、b淋巴细胞、nk细胞、肥大细胞或巨噬细胞中的任意一种。16.权利要求7～8任一所述的分离的多肽、权利要求14～15任一所述的嵌合抗原受体免疫细胞在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途。17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为表达gpc3的肿瘤；优选的，所述肿瘤选自肝癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、胃癌或甲状腺癌。18.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求14～15任一所述的嵌合抗原受体免疫细胞和药学上可接受的载体或辅料。

技术总结
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种抗GPC3抗体及其应用，抗GPC3抗体，代号为B174，所述抗GPC3抗体包括重链可变区，所述抗GPC3抗体重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1，如SEQ ID No.2所示的CDR-H2和如SEQ ID No.3所示的CDR-H3。所述抗GPC3抗体具备高亲和力和特异性，能够有效靶向肿瘤抗原GPC3，利用所述抗GPC3抗体制备嵌合抗原受体，并进一步制备嵌合抗原受体细胞，所述嵌合抗原受体细胞能够高效杀伤肿瘤细胞，且具备高特异性。特异性。


技术研发人员：狄升蒙 石磊 赵佐瞬 余学军 范艳秋 李照润
受保护的技术使用者：华道（上海）生物医药有限公司
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/7/13