鼻咽癌干性分子标志物在鼻咽癌辅助诊断和治疗中的应用

1.本发明涉及一种鼻咽癌干性分子标志物及其在鼻咽癌辅助诊断和治疗中的应用。本发明属于医药技术领域。


背景技术：

2.鼻咽癌是一类具有独特地理位置分布的头颈部肿瘤。尽管以化疗和化疗为核心的治疗手段能够有效控制大部分鼻咽癌的发生发展，但仍有10％的鼻咽癌患者经历治疗后会出现局部或区域淋巴结复发，复发患者的生存预后较差，并且对于化疗药物出现抵抗。肿瘤干细胞是一类具有自我更新、无限制增殖、多向分化和肿瘤启动特点的癌细胞类型，由于该类细胞具有广泛的增殖能力，能够促进弥漫性转移肿瘤的产生，是肿瘤进展、转移和治疗耐药的主要原因。因此，从肿瘤干性出发，识别能够反映鼻咽癌药物治疗敏感性的新型分子标志物，是目前研究的焦点问题。


技术实现要素：

3.本发明目的之一是提供一种鼻咽癌分子标志物；
4.本发明的目的之二是提供该鼻咽癌干性分子标志物在鼻咽癌辅助诊断和治疗中的应用。
5.为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
6.本发明发明人基于多项干细胞基因数据集活性打分对鼻咽癌患者进行一致性聚类，确定鼻咽癌肿瘤干性亚型，并识别干性亚型中关键的分子标志物。经研究发现，干性得分较高的亚型患者预后较差，并且晚期患者居多。psmc3ip(psmc3 interacting protein),nabp2(nucleicacid binding protein 2),cdc45(cell division cycle 45)和hjurp(holliday junction recognition protein)在干性亚型中表达升高，其高表达是鼻咽癌预后的风险因素，因此，判断psmc3ip,nabp2,cdc45和hjurp是一种新型的鼻咽癌干性分子标志物。
7.在上述研究的基础上，本发明提出了psmc3ip,nabp2,cdc45或hjurp作为鼻咽癌干性分子标志物在鼻咽癌辅助诊断和治疗中的应用。
8.其中，当psmc3ip,nabp2,cdc45或hjurp表达较高时，认为该鼻咽癌患者具有肿瘤干细胞特征、预后较差并且对于化疗抵抗；若psmc3ip,nabp2,cdc45或hjurp表达较低时，认为该鼻咽癌患者预后较好并且对化疗敏感。
9.其中，优选的，所述的治疗为鼻咽癌靶向治疗或者干性治疗。
10.进一步的，本发明还提出了用于检测psmc3ip,nabp2,cdc45或hjurp达水平的试剂在制备鼻咽癌辅助诊断和治疗试剂中的应用。
11.其中，优选的，所述的试剂为qrt-pcr引物。
12.其中，优选的，用于检测psmc3ip表达水平的试剂为针对psmc3ip设计的qrt-pcr引物，序列如下所示：
13.forward:gtgttcgggaacctacagcg
14.reverse:tggtcctgatccgcaaaataga
15.用于检测nabp2表达水平的试剂为针对nabp2设计的qrt-pcr引物，序列如下所示：
16.forward:tctgcctgctctctttcctc
17.reverse:gtagacacggggtttctcca
18.用于检测cdc45表达水平的试剂为针对cdc45设计的qrt-pcr引物，序列如下所示：
19.forward:ttcgtgtccgatttccgcaaa
20.reverse:tggaaccagcgtatattgcac
21.用于检测hjurp表达水平的试剂为针对hjurp设计的qrt-pcr引物，序列如下所示：
22.forward:ccacgctgacctacgagac
23.reverse:ctcaccgctttttgaatcggc。
24.其中，优选的，所述的治疗为鼻咽癌靶向治疗或者干性治疗。
25.相较于现有技术，本发明的有益效果是：
26.本发明首次发现psmc3ip,nabp2,cdc45或hjurp能够作为鼻咽癌干性状态的分子标志物。具体来说，psmc3ip,nabp2,cdc45或hjurp表达能够反映鼻咽癌的干性状态，psmc3ip,nabp2,cdc45或hjurp表达越高，鼻咽癌患者干性程度越高，预后越差，接受传统化疗和放疗的效果越差，对化疗药物容易产生抵抗。以上研究结果表明psmc3ip,nabp2,cdc45或hjurp是鼻咽癌的新型干性分子标志物，为鼻咽癌的治疗提供了潜在作用靶点。
附图说明
27.图1为鼻咽癌干性亚型识别。
28.其中，a.鼻咽癌一致性聚类分析。b.鼻咽癌亚型中stemchecker干性得分水平分布。c.鼻咽癌亚型中mrnasi干性得分水平分布。d.胶质瘤亚型预后分析。
29.图2为鼻咽癌干性模块识别。
30.其中，a.通过加权相关系数建立聚类树状图，将表达模式相似的基因聚成共表达模块，每一种颜色代表一个模块。b.鼻咽癌基因模块与临床表型的关联。c.网络模块基因与c2亚型的关联。
31.图3为psmc3ip对于鼻咽癌发生发展的影响。
32.其中，a.psmc3ip的表达水平对于鼻咽癌无进展生存期的影响。b.psmc3ip的表达对于头颈鳞癌无病生存期的影响。c.psmc3ip在鼻咽癌c2干性亚型中显著高表达。d.psmc3ip在头颈鳞癌肿瘤样本中显著高表达。
33.图4为nabp2对于鼻咽癌发生发展的影响。
34.其中，a.nabp2的表达水平对于鼻咽癌无进展生存期的影响。b.nabp2的表达对于头颈鳞癌无病生存期的影响。c.nabp2在鼻咽癌c2干性亚型中显著高表达。d.nabp2在头颈鳞癌肿瘤样本中显著高表达。
35.图5为cdc45对于鼻咽癌发生发展的影响。
36.其中，a.cdc45的表达水平对于鼻咽癌无进展生存期的影响。b.cdc45的表达对于头颈鳞癌无病生存期的影响。c.cdc45在鼻咽癌c2干性亚型中显著高表达。d.cdc45在头颈鳞癌肿瘤样本中显著高表达。
37.图6为hjurp对于鼻咽癌发生发展的影响。
38.其中，a.hjurp的表达水平对于鼻咽癌无进展生存期的影响。b.hjurp的表达对于头颈鳞癌无病生存期的影响。c.hjurp在鼻咽癌c2干性亚型中显著高表达。d.hjurp在头颈鳞癌肿瘤样本中显著高表达。
39.图7为鼻咽癌细胞系中psmc3ip、nabp2、cdc45和hjurp的肿瘤干性能力证实。
40.其中，a.rt-qpcr实验证明psmc3ip、nabp2、cdc45和hjurp的rna表达水平在鼻咽癌细胞系中升高。b.westernblotting实验证明psmc3ip、nabp2、cdc45和hjurp的蛋白质表达水平在鼻咽癌细胞系中升高。c.sirna干扰后psmc3ip、nabp2、cdc45和hjurp在鼻咽癌细胞系中的表达水平。d.转染nc和sirna后hne1和cne2细胞肿瘤干细胞成球实验图像，条形图显示鼻咽癌细胞的成球率。e.westernblotting检测转染sirna后肿瘤干性指标lgr5、cd44、sox2、nanog和oct4在鼻咽癌细胞系中蛋白质表达下降。f.cck-8实验证实转染sirna后肿瘤细胞增殖能力下降。
具体实施方式
41.下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
42.实施例1鼻咽癌新型干性分子标志物的确定
43.1.基于干细胞基因集识别鼻咽癌亚型
44.实验所用的鼻咽癌转录组测序数据收集于基因表达综合数据库(geo，gene expression omnibus)数据库gse102349，验证集使用的头颈鳞癌数据集收集于癌症基因组图谱(tcga,https://portal.gdc.cancer.gov/)数据库。首先从分子特征数据库(msigdb，molecular signatures database)中收集干细胞相关基因集合，使用单样本基因富集分析方法(ssgsea)对鼻咽癌患者进行打分。以干细胞基因集合在样本中的得分水平作为特征运用consensusclusterplus r包进行一致性聚类，以此获得鼻咽癌干性亚型c1和c2(图1a)。使用stemchecker中提供的外部干性相关基因集合和基于逻辑回归机器学习方法的干性指标(mrnasi)对c1和c2亚型进行干性评估，秩和检验表明c2亚型的多套干性指标皆显著高于c1亚型，表明c2亚型倾向于具有肿瘤干细胞特征(图1b和图1c)。此外，通过kaplan-meier检验进行生存分析发现c2亚型的无进展生存期较差，表明干性指数越高的鼻咽癌患者倾向于复发(图1d)。
45.2.wgcna分析识别鼻咽癌干性模块
46.基于鼻咽癌转录组测序数据中绝对中位数前10000的基因作为特征，使用加权基因共表达网络分析(wgcna,weighted correlation network analysis)识别关键网络模块，联合c1、c2以及mrnasi等干性得分评估网络模块与临床表型之间的关联(图2a)。结果表明，蓝色模块与c1亚型负相关，与c2亚型和mrnasi得分显著正相关，表明其是一个鼻咽癌干性模块(图2b)。最终选择与c2表型相关性大于0.4、与模块相关性大于0.6的基因为鼻咽癌干性关键基因，共筛选出141个关键基因(图2c)。
47.3.确认psmc3ip、nabp2、cdc45和hjurp对于鼻咽癌干性的影响
48.通过单因素cox分析联合kaplan-meier检验评估关键基因对于鼻咽癌无进展生存期的影响，其中37个基因的预后风险比hr和log-rank p值同时显著(p值小于0.05)。使用tcga头颈鳞癌的无病生存期作为外部数据验证，发现psmc3ip,nabp2,cdc45和hjurp的高表达是鼻咽癌无进展生存期和头颈鳞癌无病生存期的风险因素(图3a、4a、5a、6a和图3b、4b、5b、6b)。差异表达分析表明，psmc3ip,nabp2,cdc45和hjurp同时在鼻咽癌c2亚型及头颈鳞癌中表达显著升高(图3c、4c、5c、6c和图3d、4d、5d、6d，秩和检验p值小于0.05)。
49.4.采用分子生物学实验验证psmc3ip、nabp2、cdc45和hjurp对于鼻咽癌干性的影响
50.在计算学分析结果的基础上，我们同时联合分子生物学实验对psmc3ip,nabp2,cdc45和hjurp进行验证。psmc3ip、nabp2、cdc45和hjurp的rna和蛋白质表达水平分别在鼻咽癌细胞系(hne1、cne2、5-8f和sune-1)和正常鼻咽上皮细胞系(n69)进行检验。rt-qpcr结果表明psmc3ip、nabp2、cdc45和hjurp在鼻咽癌细胞系中表达显著升高，并且psmc3ip、hjurp和cdc45在hne1细胞系中高表达，nabp2在cne2细胞系中高表达，因此后续实验在此俩种细胞系中进行(图7a、图7b)。
51.首先，分别针对psmc3ip,nabp2,cdc45和hjurp设计了三组sirna序列(sirna-1、sirna-2以及sirna-3)使用sirna技术成功在鼻咽癌细胞系干扰了psmc3ip,nabp2,cdc45和hjurp的表达(图7c)。将nc和sirna分别转染至鼻咽癌细胞，并且通过肿瘤干细胞成球实验观察这些基因对于鼻咽癌干性的影响，细胞球形成效率结果表明psmc3ip,nabp2,cdc45和hjurp干扰后肿瘤细胞干性减弱(图7d)。此外，通过检测已知肿瘤干性指标(lgr5、cd44、sox2、nanog和oct4)的蛋白质表达水平，发现鼻咽癌细胞系中敲除psmc3ip,nabp2,cdc45和hjurp后大多数肿瘤干性指标表达皆发生下调，只有干扰cdc45后cd44表达无变化以及干扰nabp2后sox2表达无变化(图7e)。cck8实验结果表明敲除psmc3ip、nabp2、cdc45和hjurp后肿瘤细胞增殖能力下降(图7f)。以上结果表明psmc3ip、nabp2、cdc45和hjurp能够促进鼻咽癌肿瘤干性，是新型鼻咽癌干性分子标志物。
52.实施例2鼻咽癌临床辅助诊断及预后判断
53.在临床上通过检测psmc3ip,nabp2,cdc45和hjurp的表达水平，可以对鼻咽癌患者干性特征及预后情况进行判断。
54.检测psmc3ip,nabp2,cdc45和hjurp表达水平的方法如下：
55.1、rna提取
56.细胞样品：鼻咽癌细胞。鼻咽癌细胞沉淀中加入裂解液和稀释液各300ul充分混匀后静置5min，将trizol吸至1.5ml离心管中，以10000-12000r/min条件离心5min，留上清，加入300ul体积的无水乙醇上下摇晃混匀，吸出絮状物后转入吸附柱中，并以10000-12000r/min离心1min。倒掉滤液加入600ulrna洗液，10000-12000r/min离心45s，再次倒掉滤液加入50ul孵育液于膜中央孵育15min，加入600ulrna洗液，10000-12000r/min离心45s，重复一次，空管10000-12000r/min离心2min。加入50-70ul无核酶水静置2min后以10000-12000r/min条件离心1min，收集总rna，-80℃保存。
57.2、逆转录及qrt-pcr
58.采用supermix forqpcr(gdnadigesterplus)的逆转录试剂盒进行逆转录，加样体系包括rnase free ddh2o 10μl，5
×
rt-buffer2μl，gdnadigester 1μl，rna 1-5ng，用去
rna酶水补齐至10μl。逆转录的反应程序为25℃，5min；42℃，30min；85℃，5min。将逆转录好的cdna放于4℃冰箱保存。qrt-pcr采用qpcr green master mix试剂盒进行，反应体系包括qpcrgreen master mix 10μl，引物0.4μl，ddh2o 3.6μl，样品模板1μl。根据扩增基因的不同配置好不同的共有反应体系，先将共有反应体系加入到pcr 96孔板中，再将cdna加入，最后用封口膜封好后离心，1000r/min，1min。将96孔板放置到pcr仪上进行扩增反应，反应步骤为：95℃，5min(预变性，循环数1)；95℃，10s(变性)；60℃，30s(循环数40)。qrt-pcr所用引物如下表1，使用该引物可实现对psmc3ip,nabp2,cdc45和hjurp转录本的检测：
59.表1.引物序列
[0060][0061]
结果：当psmc3ip,nabp2,cdc45或hjurp表达较高时，认为该鼻咽癌患者具有肿瘤干细胞特征、预后较差并且对于化疗抵抗。若psmc3ip,nabp2,cdc45或hjurp表达较低时，认为该鼻咽癌患者预后较好并且对化疗敏感。

技术特征：
1.psmc3ip,nabp2,cdc45或hjurp作为鼻咽癌干性分子标志物在鼻咽癌辅助诊断和治疗中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗为鼻咽癌靶向治疗或者干性治疗。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，当psmc3ip,nabp2,cdc45或hjurp表达较高时，认为该鼻咽癌患者具有肿瘤干细胞特征、预后较差并且对于化疗抵抗；若psmc3ip,nabp2,cdc45或hjurp表达较低时，认为该鼻咽癌患者预后较好并且对化疗敏感。4.用于检测psmc3ip,nabp2,cdc45或hjurp表达水平的试剂在制备鼻咽癌辅助诊断和治疗试剂中的应用。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的试剂为qrt-pcr引物。6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，用于检测psmc3ip表达水平的试剂为针对psmc3ip设计的qrt-pcr引物，序列如下所示：forward:gtgttcgggaacctacagcgreverse:tggtcctgatccgcaaaataga用于检测nabp2表达水平的试剂为针对nabp2设计的qrt-pcr引物，序列如下所示：forward:tctgcctgctctctttcctcreverse:gtagacacggggtttctcca用于检测cdc45表达水平的试剂为针对cdc45设计的qrt-pcr引物，序列如下所示：forward:ttcgtgtccgatttccgcaaareverse:tggaaccagcgtatattgcac用于检测hjurp表达水平的试剂为针对hjurp设计的qrt-pcr引物，序列如下所示：forward:ccacgctgacctacgagacreverse:ctcaccgctttttgaatcggc。7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的治疗为鼻咽癌靶向治疗或者干性治疗。

技术总结
本发明公开了鼻咽癌干性分子标志物在鼻咽癌辅助诊断和治疗中的应用。所述的治疗优选为鼻咽癌靶向治疗或者干性治疗。本发明首次发现PSMC3IP、NABP2、CDC45或HJURP能够作为鼻咽癌干性状态的分子标志物。具体来说，PSMC3IP、NABP2、CDC45或HJURP的表达能够反映鼻咽癌的干性状态，PSMC3IP、NABP2、CDC45或HJURP的表达越高，鼻咽癌患者干性程度越高，预后越差，接受传统化疗和放疗的效果越差，对化疗药物容易产生抵抗。以上研究结果表明PSMC3IP、NABP2、CDC45或HJURP是鼻咽癌的新型干性分子标志物，本发明的提出为鼻咽癌的治疗提供了潜在作用靶点。靶点。


技术研发人员：许达华 李孔宁 姜鸿彦 王波 毕小慢 吴邓 王红 申雨桐
受保护的技术使用者：海南医学院
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/7/13