亚铁离子在制备治疗细菌感染产品中的应用

亚铁离子在制备治疗细菌感染产品中的应用
1.本发明专利申请为申请日2022年04月25日，申请号cn202210438990.1，发明名称为“亚铁离子在制备治疗细菌感染产品中的应用”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及医药技术领域，具体涉及亚铁离子在制备治疗细菌感染产品中的应用。


背景技术：

3.角膜炎是眼科常见的疾病之一，也是我国主要致盲眼病之一。细菌、真菌、病毒等感染是造成角膜炎最直接的因素之一，当角膜上皮遭受损伤后极易发生感染性炎症，特别是不正确使用角膜接触镜、眼部接触污染的药物或水源等将极大可能地诱导感染性角膜炎的发生。值得注意的是，根据目前临床权威的相关调查显示，临床上发病率较高的仍属由金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌引发的细菌感染性角膜炎，发病趋势逐年上升。因此，对于该类角膜炎的防治需受到关注。
4.金黄色葡萄球菌是常见的角膜、表皮感染的主要元凶。目前，抗生素治愈仍是治疗金黄色葡萄球菌感染的常用策略，然而，抗生素的不规范使用以及滥用，使得人体对抗生素耐药性增强，而多重耐药菌(如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，mrsa)出现严重威胁人类健康。因此，迫切需要找到新的抗菌疗法来应对这一危机。
5.市面上现常用的金黄色葡萄球菌感染角膜炎及表皮组织感染的治疗策略以外用抗生素滴眼液，医用抗生素水凝胶及一些必需的外用类固醇类的软膏为主，如氧氟沙星滴眼液、万古霉素水凝胶、红霉素水凝胶、金霉素软膏等。现有的研究表明，抗生素虽具备高效，低剂量的杀菌效力，但无法达到对细菌的完全清除。然而，大量使用这些含抗生素的眼药水及软膏会加剧细菌耐药性的风险，且使人体对其产生药物依赖性，迫使加大药物用量，造成恶性循环，当人体反复感染细菌后，人体对该种抗生素类软膏的耐药性将使抗生素对人体失效，而且，此类治疗并无法有效地阻止细菌在体内的迁移、定殖，易引发其他组织器官的病变。因此，迫切需要寻找新型抗菌材料来治疗金黄色葡萄球菌感染，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)感染。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明提供了亚铁离子在制备治疗细菌感染产品中的应用。
7.亚铁离子在制备治疗细菌感染产品中的应用。
8.优选的，所述细菌感染为眼球感染或表皮感染。
9.优选的，所述细菌感染是由金黄色葡萄球菌引起的。
10.优选的，所述亚铁离子来自硫酸亚铁、氯化亚铁、葡萄糖酸亚铁、乳酸亚铁中的任意一种。
11.优选的，将以亚铁化合物、抗坏血酸、化合物a为原料制备得到的水凝胶用于治疗所述细菌感染；其中，所述化合物a选自透明质酸或海藻酸钠。
12.优选的，所述亚铁离子的浓度为≥1μm。
13.优选的，所述亚铁离子的浓度为≥16μm。
14.进一步优选的，所述亚铁离子的浓度为16-100μm。
15.优选的，所述水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
16.s1、将所述亚铁化合物和抗坏血酸溶于水，制得混合溶液，加热至45-55℃，抗坏血酸与亚铁化合物的浓度比为1:1；
17.s2、在加热的过程中加入化合物a，搅拌至形成稳定的胶体，得到所述水凝胶，化合物a的添加量为混合溶液质量的2％；
18.优选的，所述亚铁化合物的浓度为1mm。
19.一种由上述方法制得的水凝胶。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
21.1、本发明提供的水凝胶对金黄色葡萄球菌及mrsa的高效杀菌效果，表明亚铁化合物可以作为一个潜在的药物来对抗当前的抗生素危机。
22.2、本发明选用常用的补铁剂-硫酸亚铁作为亚铁化合物的典型代表，研究以亚铁离子为核心的药物替代抗生素药物。并以水凝胶作为载药载体，成功制备亚铁离子水凝胶。本发明利用硫酸亚铁为核心药物替代抗生素药物，制备的亚铁离子的抗菌型水凝胶，能够有效治疗表皮和眼部感染，并能够显著降低肺部mrsa感染的风险，及时有效地阻止微生物在体内的繁殖和传播。
23.3、本发明的水凝胶制备方法简单，但具有较强的材料适应性，能够与卡拉胶、黄原胶、低酰基胶体、透明质酸、卡波姆等多种材料结合，发挥强大的杀菌潜力。
附图说明
24.图1为实施例1水凝胶的tem图(a)，实施例1水凝胶的元素分布图(b)，不包含硫酸亚铁的透明质酸水凝胶的sem图(c)，实施例1水凝胶的sem图(d)，不包含硫酸亚铁的透明质酸水凝胶的流变性能图(e)，实施例1水凝胶的流变性能图(f)；
25.图2为不包含硫酸亚铁的海藻酸钠水凝胶的sem图(a-b)，实施例2水凝胶的sem图(c-d)；实施例2水凝胶的tem图(e-f)，实施例2水凝胶的元素分布图(g)，不包含硫酸亚铁的海藻酸钠水凝胶的流变性能图(h)，实施例2水凝胶的流变性能图(i)；
26.图3为实施例1水凝胶对亚铁离子释放率的示意图(a)和实施例2水凝胶对亚铁离子释放率的示意图(b)；
27.图4为实施例1水凝胶对pi和syto 9染色的mrsa细胞杀菌分布图(a)，实施例1水凝胶的杀菌活性效果图(b)，实施例2水凝胶对pi和syto 9染色的mrsa细胞杀菌分布图(c)，实施例2水凝胶杀菌活性效果图(d)；
28.图5为不同处理组小鼠存活率示意图(a)，不同处理组小鼠炎性因子il-1变化示意图(b)，不同处理组小鼠炎性因子il-6变化示意图(c)；
29.图6为小鼠眼球组织学切片结果和各组处理后的大体图(a)和小鼠肺部组织学切片结果和各组处理后的大体图片(b)；
30.图7为水凝胶处理3天后感染小鼠肺部细菌数量示意图(a)和小鼠伤口愈合大体图(b)；
31.图8为9种铁离子对金黄色葡萄球菌的抑菌结果示意图(a)，硫酸亚铁对6种致病菌的抑菌效果示意图(b)，硫酸亚铁对金黄色葡萄球菌的抑菌效果示意图(c)。
具体实施方式
32.下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
33.实施例1
34.一种水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
35.s1、将硫酸亚铁和抗坏血酸溶于无菌超纯水，制得混合溶液，加热至50℃，该混合溶液中硫酸亚铁的浓度为1mm，抗坏血酸与硫酸亚铁的浓度比为1:1；
36.s2、在加热的过程中加入透明质酸粉末，搅拌至透明质酸粉末溶解，形成稳定的胶体，得到所述水凝胶，透明质酸的添加量为混合溶液质量的2％。
37.由上述方法制得的水凝胶。
38.所述水凝胶用于治疗细菌性角膜炎的应用。
39.实施例2
40.一种水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
41.s1、将硫酸亚铁和抗坏血酸溶于无菌超纯水，制得混合溶液，加热至50℃，该混合溶液中硫酸亚铁的浓度为1mm，抗坏血酸与硫酸亚铁的浓度比为1:1；
42.s2、在加热的过程中加入海藻酸钠粉末，搅拌至海藻酸钠粉末溶解，形成稳定的胶体，得到所述水凝胶，海藻酸钠的添加量为混合溶液质量的2％。
43.由上述方法制得的水凝胶。
44.所述水凝胶用于治疗皮肤创口感染的应用。
45.实施例3
46.实施例3与实施例1的不同之处在于，亚铁化合物为氯化亚铁。
47.实施例4
48.实施例4与实施例1的不同之处在于，亚铁化合物为葡萄糖酸亚铁。
49.实施例5
50.实施例5与实施例1的不同之处在于，亚铁化合物为乳酸亚铁1份。
51.为验证亚铁离子对金黄色葡萄球菌的抗菌活性，做以下试验
52.1、分别配置5种亚铁盐，包括：硫酸亚铁、氯化亚铁、葡萄糖酸亚铁、乳酸亚铁和亚铁氰化钾与4种铁盐，包括：氯化铁、柠檬酸铁、右旋糖酐铁和铁氰化钾的水溶液至终浓度为100μm。96孔板法对108cfu/ml金黄色葡萄球菌进行9种铁盐的药敏性测试。12h药物处理后，滴板实验测定细菌菌落总数，进一步探究铁离子对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。
53.结果：通过图8a结果显示，相同浓度下(100μm)，5种不同的fe
2+
盐对金黄色葡萄球菌的抑菌效果要远高于fe
3+
盐，表明亚铁离子在杀死金黄色葡萄球菌的进程中，起到重要的
作用。特别是硫酸亚铁(feso4)能够抑制几乎100％的金黄色葡萄球菌的生长。这表明了fe
2+
可以有效抑制金黄色葡萄球菌的生长。
54.2、配置硫酸亚铁的水溶液至终浓度为16μm；并分别准备108cfu/ml的大肠杆菌(escherichia coli)，单增李斯特菌(listeria monocytogenes)，副溶血性弧菌(vibrio parahemolyticus)，阪崎肠杆菌(enterobacter sakazakii)，金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)。96孔板法对6种致病菌进行硫酸亚铁的药敏性测试，12h药物处理后，滴板实验测定细菌菌落总数，进一步探究亚铁离子对其抑菌效果。
55.结果：进一步选择杀菌效果最优的硫酸亚铁作为研究所用的铁剂，并分别对6种不同的致病菌进行药敏性检测。通过图8b结果显示，16μm硫酸亚铁对这六种致病菌均能彰显出较强的杀菌效果，表明亚铁离子具备广谱的杀菌的效力，能够有效的杀灭常见的诱导感染的致病菌。值得注意的是，硫酸亚铁对金黄色葡萄球菌的抑菌效果显著优于其他致病菌(大肠杆菌，单增李斯特菌，副溶血性弧菌，阪崎肠杆菌)，其存活率小于0.001％。值得注意的是，硫酸亚铁对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)同样展现出了较好的抑菌活性，经16μm硫酸亚铁处理后，其存活小于0.01％。
56.3、配置硫酸亚铁的水溶液至终浓度分别为1，4，16，64μm，配置100μg/ml的ampicillin和vancomycin作为阳性对照，并设置没有硫酸亚铁的超纯水为空白对照组。准备108cfu/ml的金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)。96孔板法对金黄色葡萄球菌进行不同浓度的硫酸亚铁的药敏性测试，12h药物处理后，滴板实验测定细菌菌落总数，进一步探究硫酸亚铁对其的最小杀菌浓度(mbc)。
57.结果：如图8c结果显示，通过涂板再培养发现硫酸亚铁处理的金黄色葡萄球菌不能够再生长，说明菌体很可能已经死亡，而且死亡程度与硫酸亚铁的浓度紧密相关。硫酸亚铁对金黄色葡萄球菌的mbc值为16μm，在此浓度下，杀菌率可达到99.99％，具备很好的杀菌应用前景。
58.为了验证本发明的水凝胶的性能，特进行如下分析：
59.试验中所用ampicillin和vancomycin售自sigma-aldrich。
60.一、水凝胶中的亚铁离子的分布分析
61.分别将实施例1水凝胶与实施例2水凝胶放置于一次性培养皿中进行6h，冷冻处理(-20℃)，随后，放置于冷冻干燥机中进行48h干燥处理，干燥后进行液氮研磨至粉末，取粉末样品进行测试。
62.(1)通过x射线光电子谱法(xps)对水凝胶中的元素有效成分进行分析；
63.(2)通过场发射扫描电镜(sem)对水凝胶的表型结构进行分析；
64.(3)通过旋转流变仪对水凝胶的流变特性进行分析：使用40毫米板的几何形状与1000μm的间隙，在测试之前，在疏水阀周围涂上一层硅油薄膜，以消除水分蒸发的影响。平衡时间设定为7分钟，使水凝胶达到稳定状态。以0.1-100 1/s的剪切速率测试粘度。在振荡频率为1hz的1-2000pa范围内进行屈服性能测试。振荡应变行为在1hz范围内的应变范围为0.01％至100％。蠕变和恢复试验在线性粘弹性范围180度内，及在恒定的10pa应力下进行。
65.结果：如图1和图2所示，亚铁离子均成功装载到两种水凝胶基质中，且在水凝胶中分布均匀。sem图表明，负载亚铁离子的水凝胶具有非均质表面和多孔结构，这些结构有利
于水凝胶中水分的保存，也有利于fe
2+
从水凝胶中扩散和释放；两种水凝胶的流变性能对比结果表明，负载亚铁离子水凝胶的g'(弹性模量)和g
″
(损失模量)在高剪切速率下，在几秒钟内均可恢复至100％，说明feso4负载水凝胶具有有利于药物扩散的潜在流动性和回弹性。
66.以上结果表明，负载亚铁离子的水凝胶具有潜在医学应用前景。
67.二、水凝胶中的亚铁离子释放速率分析
68.(1)分别将10毫升的水注入实施例1水凝胶与实施例2水凝胶装入透析袋(8000-14000da)中。
69.(2)透析袋放入100毫升超纯水，并通过磁力搅拌器在37℃，200rpm条件下，搅拌12h。
70.(3)利用邻菲啰啉分子吸收光谱比色法测定亚铁离子的浓度，每30min测定一次，共测定12h。
71.结果：亚铁离子释放实验证实结果如图3所示，水凝胶中的fe
2+
均可以以时间依赖性的方式从水凝胶中释放出来，且feso4水凝胶具有铁离子缓慢而长期释放的特点，其中，12h后，水凝胶中fe
2+
的释放率分别约78.3％、73.6％。
72.三、水凝胶的体外抑菌活性效果分析
73.(1)分别将实施例1水凝胶、实施例2水凝胶、硫酸亚铁透明质酸水凝胶、抗坏血酸透明质酸水凝胶、ampicillin透明质酸水凝胶、vancomycin透明质酸水凝胶、硫酸亚铁海藻酸钠水凝胶、抗坏血酸海藻酸钠水凝胶、ampicillin海藻酸钠水凝胶和vancomycin海藻酸钠水凝胶倒入无菌的一次性培养皿中待用；
74.(2)108cfu/ml的金黄色葡萄球菌细胞用生理盐水清洗两次，并收集到1cm的无菌滤纸中；
75.(3)带有收集细胞的滤纸的正面朝上，放置在各水凝胶上，并将其密封，放置于37℃的培养箱中培养；
76.(4)培养12h后，无菌镊子小心取出滤纸片，无菌棉签擦去滤纸片背面的多余水凝胶后，将其置于无菌ep管中，向管中加入1ml无菌生理盐水，超声30s，收集滤纸上细胞；
77.(6)采用滴板法测定细菌菌落总数。
78.为确定负载feso4水凝胶的抗菌方式，将实施例1水凝胶(100μl)、实施例2水凝胶(100μl)分别加入玻片中心，将5μl的清洗好的金黄色葡萄球菌细胞(108cfu/ml)垂直滴加在feso4水凝胶表面，37℃孵育3h后，将转载pi(终浓度为1μg/ml)滴于含金黄色葡萄球菌细胞的feso4水凝胶上，37℃孵育20min。利用激光共聚焦扫描显微镜测定feso4水凝胶的抗菌模型。
79.结果：通过模拟mrsa与亚铁离子水凝胶的体外表面接触实验，发现实施例1水凝胶与实施例2水凝胶均具有良好的杀菌效果。图4a为实施例1水凝胶处理后，pi和syto 9染色的mrsa细胞在激光共聚焦显微镜下死亡分布情况，由其结果可知，含有asc和feso4的水凝胶具有较大的杀菌活性，杀菌率基本上达到100％，由图4b所示，用仅含feso4的水凝胶处理仅能降低3lgcfu，且仅含asc的水凝胶对mrsa没有杀菌作用，说明，添加asc可使负载亚铁离子的水凝胶具有最大的杀菌活性，重要的是，与实施例1水凝胶相比，含有ampicillin的水凝胶杀死mrsa的能力要低得多。
80.图4c为实施例2水凝胶处理后，pi和syto 9染色的mrsa细胞在激光共聚焦显微镜下死亡分布情况，其结果显示，水凝胶同样具有较大的杀菌活性，且由图4d可知，含有vancomycin的水凝胶比实施例2水凝胶杀死mrsa的能力低。这些结果表明，同时含有硫酸亚铁和抗坏血酸的水凝胶可用于mrsa感染的治疗。
81.四、进行以下动物学试验，以进一步说明其效果：
82.1、实施例1的效果验证
83.(1)金黄色葡萄球菌悬浮液的准备
84.mrsa(来自中科院)过夜菌转接(1:200)，长至od
600
＝0.3，收集1
×
108～1
×
10
10
cfu/ml，脱去培养基重悬于生理盐水中，备用。
85.(2)构建小鼠金黄色葡萄球菌性角膜炎动物模型
86.小鼠准备：40只，balb/c小鼠，8周龄左右，雄性。
87.模型构建：
88.a.麻醉：每只小鼠肌内注射0.125ml的盐酸氯胺酮(100mg/ml)：氧拉嗪(20mg/ml)＝1:1混合物用于麻醉，约3～5分钟眼局部出现轻度麻醉表现(眼睑反射消失、角膜反射微弱)后，眼角膜处滴1％盐酸丁卡因1滴；
89.b.切口：利用25-30号针在角膜上皮中央作三条相互平行的划痕，每条2毫米，不穿透表层基质，造成小鼠角膜损伤；
90.c.接菌：对准小鼠眼球，滴加两滴制备好的金黄色葡萄球菌悬浮液(108cfu/ml，每滴50μl，共100μl)，用手轻按眼睑10秒，使菌液和角膜充分接触，然后轻轻复原眼睑；
91.d.鉴定：接种处理24/48h后(取决于小鼠眼部感染情况)，手电筒进行外眼观察，血管充血，角膜混浊，眼部有积脓可视为造模成功。
92.e.分级：分为两级：轻微、严重。轻微：轻微不透明分泌物，部分或全部覆盖瞳孔、眼前节；严重：密集的不透明分泌物，部分或全部覆盖瞳孔或完全覆盖眼前节，甚至角膜穿孔。
93.(3)动物分组及给药
94.a.分组：小鼠金黄色葡萄球菌性角膜炎动物模型构建成功后，对其进行分组给药处理分成四组，每组8只，即：
95.空白组(8只)：小鼠眼睛划痕，但是不接种细菌，对其眼部滴加无菌生理盐水，共100μl；
96.模型对照组(8只)：构建好的小鼠模型，对其眼部滴加100μl无菌生理盐水，再进行透明质酸水凝胶处理，共1ml；
97.处理组1(8只)：构建好的小鼠模型，对其眼部用1mm asc水溶液和1mm feso4水溶液，共100μl进行处理，再进行装载实施例1水凝胶处理，共1ml；
98.处理组2(8只)：构建好的小鼠模型，对其眼部用100μl 1mm asc水溶液处理，再进行装载asc(1mm)的透明质酸水凝胶处理，共1ml；
99.阳性对照组(8只)：构建好的小鼠模型，对其眼部用共100μl 1mg/ml氨苄西林(ampicillin)进行处理，再进行装载氨苄西林(1mg/ml)的透明质酸水凝胶处理，共1ml；
100.b.给药：每组小鼠按照划分好的组别分别进行给药处理，每天两次，每次先用含有药物的生理盐水进行清洗，随后进行水凝胶上药处理，两次滴加中间间隔10min，共处理7d；
101.c.观察：试验期间每天给药前需用手持手电筒对每只眼睛进行观察，记录。并每日
拍照记录小鼠眼球情况。
102.d.眼部菌落计数：用无菌生理盐水湿棉球轻轻涂抹上下眼睑后投入内装5ml无菌生理盐水中，混匀，抽取100μl，梯度稀释，滴板，培养并计数；
103.e.血液指标检测：检测并鉴定血液中的细菌类型及数量，并检测相关血液指标
104.f.肺部菌落计数：将处理7d后的小鼠处死，并解剖取出小鼠肺部，置于5ml pbs中，超声，混匀，吸取上清液100μl，梯度稀释，滴板，培养并计数；
105.g.眼部组织病理学检测：将处理7d后的小鼠处死，摘取眼球，固定于10％福尔马林中，石蜡包埋，he染色，光镜检查，观察其病理组织学改变。
106.结果：感染后48h，用实施例1水凝胶治疗mrsa感染小鼠眼球7天，经过对其存活率、细胞炎症因子以及眼部与肺部病理学切片等分析来评估自组装的亚铁水凝胶的杀菌活性，结果如图5a所示，与对照组水凝胶组小鼠的35％的存活率相比，feso4+asc水凝胶组小鼠的存活率显著提高，其存活率为100％。同时，未感染的对照组血清细胞因子il-1和il-6水平分别为25pg/ml和35pg/ml。空白水凝胶组血清细胞因子il-1、il-6水平分别为30pg/ml、40pg/ml。asc水凝胶处理组il-1、il-6水平较空白水凝胶处理组稍低。氨苄西林水凝胶组和feso4+asc水凝胶组血清il-1、il-6水平显著低于空白水凝胶组，且feso4+asc水凝胶组中的il-6和il-1的下降最为显著。提示feso4+asc水凝胶可降低金黄色葡萄球菌感染过程中的炎症反应，且其效果大于氨苄西林水凝胶(图5b、c)。不同水凝胶处理7天后的小鼠眼球和肺he染色显微镜图像和组织学分析显示，对于小鼠眼球方面，如图6a所示，空白水凝胶组小鼠眼球有脓液和血分泌，角膜水肿明显，可见大量中性粒细胞；ampicillin水凝胶组小鼠角膜炎症细胞明显减少，角膜厚度恢复正常，然而，小鼠角膜仍有部分修复的缺陷；而自组装的亚铁水凝胶组，小鼠角膜组织基本恢复正常：膜水肿消失；无炎症反应，新生血管减少，结果表明实施例1水凝胶对小鼠角膜炎金黄色葡萄球菌感染具有较好的治疗效果。如图6b所示，经feso4+asc水凝胶处理后的小鼠同其他处理组相比，小鼠肺部损伤情况得到显著的缓解，其肺支气管大小正常，肺泡结构完整，肺内未见中性粒细胞、吞噬细胞等炎症细胞，同未被感染组的小鼠基本一致。这些结果表明，实施例1水凝胶除了在治疗角膜炎方面具备潜在的优势，同时还可有效防止角膜感染向肺部传播。
107.2、实施例2的效果验证
108.(1)金黄色葡萄球菌悬浮液的准备
109.mrsa(来自中科院)过夜菌转接(1:200)，长至od
600
＝0.3，收集1
×
108～1
×
10
10
cfu/ml，脱去培养基重悬于生理盐水中，备用。
110.(2)构建小鼠金葡菌感染表皮创伤动物模型
111.小鼠准备：30只，balb/c小鼠，8周龄左右，雄性。
112.模型构建：
113.a.麻醉：每只小鼠肌内注射0.125ml的盐酸氯胺酮(100mg/ml)：氧拉嗪(20mg/ml)＝1:1混合物用于麻醉，约3～5分钟观察小鼠呼吸状态与心脏跳动频率(呼吸节奏变缓，心跳频率下降)来判断小鼠麻醉是否成功；
114.b.背部创伤切口：脱毛膏对小鼠背部脱毛处理，用盐水纱布刮擦背部，75％乙醇擦拭小鼠背部。在每只小鼠的背部皮肤上创建一个全层伤口(10mm
×
10mm)，直到皮下组织的深处，并保持开放，造成小鼠背部皮肤损伤缺失；
115.c.接菌：对准小鼠背部创伤表面，滴加两滴制备好的金黄色葡萄球菌悬浮液(108cfu/ml，每滴50μl，共100μl)，并用无菌纱布进行伤口包扎；
116.d.感染：接种处理24/48h后，观察小鼠伤口表面的脓肿情况；
117.(3)动物分组及给药
118.a.分组：小鼠金葡菌感染表皮创伤动物模型构建成功后，对其进行分组给药处理分成5组，每组6只，即：
119.空白组(6只)：小鼠背部有创伤口，但是不接种细菌，对伤口滴加无菌生理盐水，共100μl；
120.模型对照组(6只)：构建好的小鼠模型，不加药处理，对伤口滴加100μl无菌生理盐水，再进行海藻酸钠水凝胶处理，共1ml；
121.处理组1(6只)：构建好的小鼠模型，对伤口用1mm asc水溶液和1mm feso4水溶液，共100μl，进行处理，再进行装载实施例2的水凝胶处理，共1ml；
122.处理组2(6只)：构建好的小鼠模型，对其伤口用100μl 1mm asc水溶液进行处理，再进行装载asc(1mm)的海藻酸钠水凝胶处理，共1ml；
123.阳性对照组(6只)：构建好的小鼠模型，对其伤口用100μl 1mm万古霉素(vancomycin)水溶液进行处理，再进行装载万古霉素(vancomycin)的海藻酸钠水凝胶处理，共1ml；
124.b.给药：每组小鼠按照划分好的组别分别进行给药处理，每天两次，每次先用含有药物的生理盐水进行清洗，随后进行水凝胶上药处理，两次中间间隔10min，随后再次用无菌的纱布进行伤口包扎，共处理3d；
125.c.观察：试验期间每天给药前需用手持手电筒对每只小鼠伤口进行观察，记录。并每日拍照记录小鼠伤口愈合情况。
126.d.伤口表面菌落计数：用无菌生理盐水湿棉球轻轻涂抹伤口表面投入内装5ml无菌生理盐水中，混匀，抽取100μl，梯度稀释，滴板，培养并计数；
127.e.血液指标检测：检测并鉴定血液中的细菌类型及数量，并检测相关血液指标
128.f.肺部菌落计数：将处理7d后的小鼠处死，并解剖取出小鼠肺部，置于5ml pbs中，超声，混匀，吸取上清液100μl，梯度稀释，滴板，培养并计数；
129.结果：金黄色葡萄球菌是一种常见的人类病原体，临床上以细菌感染最为常见。特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染，可引起皮肤化脓性感染，严重危及生命。因此，评估feso4潜在应用前景的重要指标是mrsa细胞从创面上的巨大清除能力和促进创面愈合的能力。如图7b所示，小鼠表皮感染模型观察到实施例2水凝胶处理组在第3天的伤口愈合能力优于其他组，未感染治疗组创面仍有少量脓汁。在其他5个mrsa感染组中，仅含asc的海藻酸钠水凝胶处理组和含vancomycin的水凝胶处理组均未能有效缓解创面愈合，创面脓血严重，与vancomycin水凝胶组相比，实施例2水凝胶有利于创面愈合，其创面未见脓血，且创伤面积小于在第0天的创伤面积。解剖各处理组小鼠肺部进行金黄色葡萄球菌检测发现，如图7a所示，feso4+asc水凝胶可消除至少99.9％的mrsa细胞，而其余处理组的杀菌效果则明显弱于亚铁水凝胶，feso4水凝胶表皮处理对mrsa细胞向肺部的感染具有潜在的预防作用。
130.因此，证实了含feso4的水凝胶具有潜在的抗菌活性，可以对抗体内微生物的耐药性。
131.需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
132.尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
133.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：
1.亚铁化合物在制备治疗细菌感染的产品中的应用，其特征在于，所述亚铁化合物来自氯化亚铁、葡萄糖酸亚铁和乳酸亚铁中的任意一种，所述细菌感染是由金黄色葡萄球菌引起的。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述亚铁化合物中亚铁离子的浓度为100μm。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以亚铁化合物、抗坏血酸和化合物a为原料制备得到水凝胶，所述化合物a为透明质酸。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述水凝胶的制备方法包括以下步骤：s1、将亚铁化合物和抗坏血酸溶于无菌超纯水，制得混合溶液，加热至50℃，该混合溶液中亚铁化合物的浓度为1mm，抗坏血酸与亚铁化合物的浓度比为1:1；s2、在加热的过程中加入透明质酸粉末，搅拌至透明质酸粉末溶解，形成稳定的胶体，得到所述水凝胶，透明质酸的添加量为混合溶液质量的2％。5.根据权利要求1～4任意一项所述的应用，其特征在于，所述细菌感染为眼球感染或表皮感染。6.根据权利要求1～4任意一项所述的应用，其特征在于，所述细菌感染为细菌性角膜炎。7.根据权利要求1～4任意一项所述的应用，其特征在于，所述细菌感染为金黄色葡萄球菌性角膜炎。8.一种治疗细菌感染的水凝胶，其特征在于，所述细菌感染是由金黄色葡萄球菌引起的，以亚铁化合物、抗坏血酸和化合物a为原料制备得到水凝胶，所述化合物a为透明质酸；所述亚铁化合物来自氯化亚铁、葡萄糖酸亚铁和乳酸亚铁中的任意一种，所述水凝胶的制备方法包括以下步骤：s1、将亚铁化合物和抗坏血酸溶于无菌超纯水，制得混合溶液，加热至50℃，该混合溶液中亚铁化合物的浓度为1mm，抗坏血酸与亚铁化合物的浓度比为1:1；s2、在加热的过程中加入透明质酸粉末，搅拌至透明质酸粉末溶解，形成稳定的胶体，得到所述水凝胶，透明质酸的添加量为混合溶液质量的2％。

技术总结
本发明公开了亚铁离子在制备治疗细菌感染产品中的应用，属于医药技术领域。将亚铁离子用于金黄色葡萄球菌的抗菌活性试验，显示出较强的杀菌效果，对金黄色葡萄球菌杀菌时，其存活率小于0.001％，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)杀菌时，其存活率小于0.01％，将含亚铁离子水凝胶用于治疗角膜炎和皮肤创口感染，可显著降低肺部MRSA感染的风险，并及时有效地阻止微生物在体内的繁殖和传播，揭示了含亚铁化合物的药物可用来治疗包括MRSA在内的金黄色葡萄球菌感染。金黄色葡萄球菌感染。金黄色葡萄球菌感染。


技术研发人员：胡梁斌 莫海珍 周晓辉 李红波 徐丹 刘振彬 王贞
受保护的技术使用者：陕西科技大学
技术研发日：2022.04.25
技术公布日：2023/7/13