重组III型人源化胶原蛋白在乳腺癌治疗中的用途

重组iii型人源化胶原蛋白在乳腺癌治疗中的用途
1.优先权和相关申请
2.本技术要求于2023年2月9日提交中国专利局、申请号为202310115958.4、发明名称为“重组iii型人源化胶原蛋白在乳腺癌治疗中的用途”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本技术中。
技术领域
3.本发明属于生物医药领域，具体涉及重组iii型人源化胶原蛋白在乳腺癌治疗中的用途。


背景技术：

4.目前，在全世界癌症发病率中位居第一的是乳腺癌(breast carcinoma，bc)，其治疗方式有限，主要包括外科手术切除、放射治疗、化学治疗和激素治疗等。
5.乳腺癌有多种分型，三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，tnbc)即为乳腺癌中的一种亚型，其是指癌组织免疫组织化学检查结果为雌激素受体(estrogen receptor，er)、孕激素受体(progesterone receptor，pr)和人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor 2，her2)均为阴性的乳腺癌。其复发转移率高，并且由于缺少有效的治疗靶点，导致目前针对三阴性乳腺癌的治疗手段较为单一，主要为化学治疗，因此急需开发对其更为有效安全的治疗手段。
6.胶原蛋白是动物体内含量最丰富的蛋白质，约占总蛋白质的30％，在细胞粘附等生理过程中发挥着重要作用。胶原蛋白具有良好的生物相容性和生物降解安全性，因此其已被广泛的应用于医药领域。直至目前，各种研究使用的胶原蛋白绝大多数来自于动物组织、皮肤提取物。然而，从动物体提取胶原蛋白水溶性差，可加工性很弱，直接限制了许多潜在用途的开发。进而人们开始利用基因工程技术生产胶原蛋白，以期克服上述缺点。
7.申请号为cn201811438582.6、发明名称为“多肽、其生产方法和用途”的专利申请记载了本发明的发明人在之前研究并生产的重组人源iii型胶原蛋白，重组iii型人源化胶原蛋白具有高水溶性和高生物活性的特点。目前尚未有报道记载重组iii型人源化胶原蛋白与乳腺癌治疗之间的联系。


技术实现要素：

8.发明要解决的问题
9.本发明拟应用申请号为cn201811438582.6的专利申请中的重组iii型人源化胶原蛋白作为原材料，评价其在乳腺疾病例如乳腺癌治疗中的有效性。具体而言，本发明拟利用重组iii型人源化胶原蛋白抑制乳腺癌细胞的增殖活性和/或迁移能力，并促进乳腺癌细胞休眠，从而达到预防和/或治疗乳腺癌的效果。
10.用于解决问题的方案
11.本发明提供了重组iii型人源化胶原蛋白在制备用于预防和/或治疗乳腺疾病的
药物中的用途；
12.其中，所述重组iii型人源化胶原蛋白包含以seq id no.1所示的序列的n个重复，n为大于等于1的整数，其中当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的。
13.进一步地，所述重组iii型人源化胶原蛋白包含以seq id no.2所示的序列或者不含以seq id no.2所示的序列。
14.进一步地，所述重组iii型人源化胶原蛋白包含：
15.a)seq id no.3的氨基酸序列；
16.b)与seq id no.3的氨基酸序列具有90％同一性的氨基酸序列，其保留seq id no.3的氨基酸序列的细胞黏附效果；
17.c)seq id no.3的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，其保留seq id no.3的氨基酸序列的细胞黏附效果；或
18.d)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码seq id no.3的氨基酸序列在严格条件条件下杂交，所述氨基酸序列保留seq id no.3的氨基酸序果，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。
19.优选地，所述重组iii型人源化胶原蛋白包含以seq id no.3所示的氨基酸序列。
20.进一步地，所述乳腺疾病为乳腺癌。
21.进一步地，所述乳腺癌包括管腔a型乳腺癌、管腔b型乳腺癌、her-2过表达型乳腺癌、基底细胞样型乳腺癌、三阴性乳腺癌和正常乳腺样型乳腺癌。
22.进一步地，所述乳腺癌为管腔a型乳腺癌、her-2过表达型乳腺癌、基底细胞样型乳腺癌或三阴性乳腺癌。
23.进一步地，所述重组iii型人源化胶原蛋白通过抑制乳腺癌细胞的增殖能力、抑制乳腺癌细胞的迁移能力和/或促进乳腺癌细胞进入休眠来预防和/或治疗乳腺癌。
24.进一步地，所述抑制乳腺癌细胞的增殖能力包括抑制乳腺癌细胞的dna复制活性。
25.发明的效果
26.本发明的研究结果表明，重组iii型人源化胶原蛋白可以明显抑制乳腺癌细胞(既包括非三阴性乳腺癌细胞，还包括三阴性乳腺癌细胞)的dna复制活性，进一步抑制生长增殖能力，并可以抑制肿瘤细胞(既包括非三阴性乳腺癌细胞，还包括三阴性乳腺癌细胞)的迁移特性，同时还可以促进乳腺癌细胞进入休眠，从而为治疗乳腺癌的药物制备奠定了基础，也为重组iii型人源化胶原蛋白在临床上用于乳腺癌患者的安全性和有效性提供了一定的理论基础。
附图说明
27.图1为不同浓度重组iii型人源化胶原蛋白在不同时间对mcf-7细胞增殖活性影响统计结果。
28.图2为不同浓度重组iii型人源化胶原蛋白在不同时间对mda-mb-231细胞增殖活性影响统计结果。
29.图3为不同浓度重组iii型人源化胶原蛋白在不同时间对sk-br-3细胞增殖活性影响统计结果。
30.图4为本发明提供的重组iii型人源化胶原蛋白在不同时间对mcf-7细胞迁移能力
影响统计结果。
31.图5为本发明提供的重组iii型人源化胶原蛋白在不同时间对mda-mb-231细胞迁移能力影响统计结果。
32.图6为本发明提供的重组iii型人源化胶原蛋白在不同时间对sk-br-3细胞迁移能力影响统计结果。
33.图7为edu细胞增殖实验中本发明提供的重组iii型人源化胶原蛋白对mcf-7细胞dna复制活性的影响的检测结果。
34.图8为edu细胞增殖实验中本发明提供的重组iii型人源化胶原蛋白对mda-mb-231细胞dna复制活性的影响的检测结果。
35.图9为edu细胞增殖实验中本发明提供的重组iii型人源化胶原蛋白对sk-br-3细胞dna复制活性的影响的检测结果。
36.图10为本发明提供的重组iii型人源化胶原蛋白对mda-mb-231细胞细胞周期的影响的检测结果。
37.图11为本发明实施例中使用的重组iii型人源化胶原蛋白成品。
38.图12为不同浓度rh-col3对正常乳腺上皮细胞以及三种类型的bcc的存活率影响分析统计结果；其中，数据以三个独立实验的平均值
±
sd表示，与对照组相比，符号*、**和***分别显示p《0.05、0.01和0.001。
39.图13为不同浓度rh-col3对mcf-7细胞增殖率影响分析统计结果；其中，数据以三个独立实验的平均值
±
sd表示，符号*、**和***显示与对照组相比p《0.05、0.01和0.001。
40.图14为不同浓度rh-col3对sk-br-3细胞增殖率影响分析统计结果；其中，数据以三个独立实验的平均值
±
sd表示，符号*、**和***显示与对照组相比p《0.05、0.01和0.001。
41.图15为不同浓度rh-col3对mda-mb-231细胞增殖率影响分析统计结果；其中，数据以三个独立实验的平均值
±
sd表示，符号*、**和***显示与对照组相比p《0.05、0.01和0.001。
42.图16为不同浓度rh-col3处理后乳腺癌细胞克隆数量统计结果；其中，数据以三个独立实验的平均值
±
sd表示，符号*、**和***显示与对照组相比p《0.05、0.01和0.001。
43.图17为不同浓度rh-col3处理后乳腺癌细胞凋亡率统计结果；其中，流式细胞术检测图中左下象限表示活细胞，其他三个象限表示具有不同程度凋亡的细胞；数据以三个独立实验的平均值
±
sd表示，符号*、**和***显示与对照组相比p《0.05、0.01和0.001。
44.图18为不同浓度rh-col3处理后mcf-7细胞在伤口愈合实验中的代表性图像及迁移率分析结果；其中，代表性图像为放大100倍图像，数据以三个独立实验的平均值
±
sd表示，符号*、**和***显示与对照组相比p《0.05、0.01和0.001。
45.图19为不同浓度rh-col3处理后sk-br-3细胞在伤口愈合实验中的代表性图像及迁移率分析结果；其中，代表性图像为放大100倍图像，数据以三个独立实验的平均值
±
sd表示，符号*、**和***显示与对照组相比p《0.05、0.01和0.001。
46.图20为不同浓度rh-col3处理后mda-mb-231细胞在伤口愈合实验中的代表性图像及迁移率分析结果；其中，代表性图像为放大100倍图像，数据以三个独立实验的平均值
±
sd表示，符号*、**和***显示与对照组相比p《0.05、0.01和0.001。
47.图21为不同浓度rh-col3处理后乳腺癌细胞在transwell分析中的代表性图像及
侵袭能力分析结果；其中，代表性图像为放大100倍图像，数据以三个独立实验的平均值
±
sd表示，符号*、**和***显示与对照组相比p《0.05、0.01和0.001。
48.图22为对照组和rh-col3组分析样本的pca评分3d图。
49.图23为对照组和rh-col3组之间差异表达基因的火山图(log2foldchange＞1，padj＜0.05)和热图。
50.图24为rh-col3处理下乳腺癌细胞上调基因和下调基因的go分析结果。
51.图25为rh-col3处理下乳腺癌细胞上调基因和下调基因的kegg通路分析结果。
52.图26为rh-col3处理下乳腺癌细胞下调基因的do分析结果。
53.图27为对照组和rh-col3组乳腺癌细胞中ddr1基因和sqstmq/p62基因表达的western blot检测结果及分析结果；其中，数据以三个独立实验的平均值
±
sd表示，符号*、**和***显示与对照组相比p《0.05、0.01和0.001。
54.图28为tcga数据库中bc患者rfs的kaplan-meier分析，通过kaplan-meiser绘图仪分析ddr1的不同mrna水平。
55.图29为bccs tcga数据库中ddr1与肿瘤增殖特征、emt标志物和肿瘤炎症特征的spearman相关性；其中，p值和spearman相关(rho)。
56.图30为阻断ddr1后，通过cck-8测定rh-col3处理下的乳腺癌细胞的存活率。
57.图31为不同处理下乳腺癌细胞增殖能力的edu分析结果；其中，细胞图比例尺为100μm，数据以三个独立实验的平均值
±
sd表示，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，#p《0.05、#p《0.01、##p《0.001。
58.图32为伤口愈合实验中不同处理下乳腺癌细胞的迁移能力分析结果；其中，代表性图像为放大100倍图像，数据以三个独立实验的平均值
±
sd表示，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，#p《0.05、#p《0.01、##p《0.001。
59.图33为通过流式细胞术对不同处理下乳腺癌细胞细胞周期的分析结果。
60.图34为不同处理下乳腺癌细胞自噬相关蛋白表达水平的蛋白质印迹分析结果；其中，β-actin作为负荷对照，数据以三个独立实验的平均值
±
sd表示，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，#p《0.05、#p《0.01、##p《0.001。
61.图35为不同处理下感染mcherry-gfp-lc3的乳腺癌细胞的自噬通量的共聚焦显微镜检测结果及分析结果；其中，细胞图比例尺为5μm，数据以三个独立实验的平均值
±
sd表示，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，#p《0.05、#p《0.01、##p《0.001。
62.图36为rh-col3对乳腺癌细胞肿瘤生长的影响分析结果；其中，a为两组处死的balb/c裸鼠，b为小鼠解剖肿瘤，c为在整个28天的实验中每只裸鼠的体重变化，d为在整个28天的实验中两组小鼠肿瘤体积的变化，e为对照组和rh-col3组中肿瘤重量的量化结果，f为对照组和rh-col3组中肿瘤重量的量化结果，数据以三个独立实验的平均值
±
sd表示。与对照组相比，符号*、**和***显示p《0.05、0.01和0.001。
63.图37为对照组和rh-col3组肿瘤组织中ddr1、lc3和p62表达水平的蛋白质印迹分析结果；其中，数据以三个独立实验的平均值
±
sd表示。与对照组相比，符号*、**和***显示p《0.05、0.01和0.001。
具体实施方式
64.以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。
65.在本发明中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
66.在本发明中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
67.在本发明中，术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”可以指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
68.在本发明中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
69.在本发明中，使用“数值a～数值b”或“数值a-数值b”表示的数值范围是指包含端点数值a、b的范围。
70.在本发明中，术语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
71.在本发明中，术语“个体”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。
72.在本发明中，“预防”是指：在罹患疾病之前，通过使受试者接触本发明中所述的重组iii型人源化胶原蛋白，从而与不接触时相比降低罹患疾病的概率和/或减轻罹患疾病后的症状，并不意味着必需完全抑制患病。
73.在本发明中，“治疗”是指：在罹患疾病之后，使受试者接触(例如给药)本发明中所述的重组iii型人源化胶原蛋白，从而与不接触时相比使该疾病的症状减轻，并不意味着必需完全抑制疾病的症状。罹患疾病是指：身体出现了疾病症状。
74.在本发明中，“重组人源iii型胶原蛋白”和“重组iii型人源化胶原蛋白”通用，所述重组iii型人源化胶原蛋白为申请号为cn201811438582.6、发明名称为“多肽、其生产方法和用途”的专利申请记载。
75.在一些实施方案中，本发明所述的重组iii型人源化胶原蛋白包含以seq id no.1所示的序列的n个重复，n为大于等于1的整数，其中当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的。
76.在本发明中，使用的seq id no.1重复序列为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap(seq id no.1)。
77.优选地，重复序列的数目是16个，即重组iii型人源化胶原蛋白包含以seq id no.3所示的序列的多肽：gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpager
gapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergap(seq id no.3)。
78.本发明的重组iii型人源化胶原蛋白的氨基酸序列可以包含c端序列gppgpccggg(seq id no.2)。本领域技术人员在表达包含多个重复序列的蛋白时通常考虑添加该序列来增加表达多肽的稳定性。优选地，蛋白序列可以不包含该c端序列，保持了序列和人源iii型胶原蛋白的序列一致性，不引入额外的氨基酸。
79.在本发明中，氨基酸添加指在氨基酸序列，例如seq id no.3的c端或n端添加氨基酸，只要本发明的重组iii型人源化胶原蛋白保留seq id no.3的氨基酸序列的活性。
80.在本发明中，氨基酸取代指在氨基酸序列，例如seq id no.3的序列的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代，只要本发明的重组iii型人源化胶原蛋白保留seq id no.3的氨基酸序列的活性。
81.在本发明中，氨基酸插入指在氨基酸序列，例如seq id no.3的序列的适当位置插入氨基酸残基，插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻，或插入的氨基酸之间都不彼此相邻，只要本发明的重组iii型人源化胶原蛋白保留seq id no.3的氨基酸序列的活性。在本文中氨基酸的插入位置不在各重复序列之间。
82.在本发明中，氨基酸缺失指可以从氨基酸序列，例如seq id no.3的序列中删除1、2或3个以上氨基酸，只要本发明的重组iii型人源化胶原蛋白保留seq id no.3的氨基酸序列的活性。
83.在本发明中，氨基酸取代可以是保守氨基酸取代，指与seq id no.3的氨基酸序列相比，有3个，更佳地2个氨基酸或1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成肽。这些保守性变异肽可以根据下列氨基酸替换而产生：val、leu或ile对ala的取代，lys、gln、asn或his对arg的取代，gln、his、lys或arg对asn的取代，glu或asn对asp的取代，ser或ala对cys的取代，asn或glu对gln的取代，asp或gln对glu的取代，ala对gly的取代，asn、lys、gln或arg对his的取代，leu、met、ala、val、phe或正亮氨酸对ile的取代，ile、met、ala、val、phe或正亮氨酸对leu的取代，asn、gln或arg对lys的取代，ile、leu或phe对met的取代，leu、val、ile、ala或tyr对phe的取代，ala对pro的取代，thr对ser的取代，ser或val对thr的取代，phe或tyr对trp的取代，trp、phe、thr或ser对tyr的取代，及phe、ala、met、ile、leu或正亮氨酸对val的取代。氨基酸替换也可以是非保守氨基酸替换。
84.如本文所使用的，术语“中等严格条件”，“中-高严格条件”，“高严格条件”或“非常高严格条件”描述了核酸杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导参见current protocols in molecular biolog y，john wiley&sons，n.y.(1989)，6.3.1-6.3.6，其通过引用并入本文。在该文献中描述了含水的和非含水的方法，且可以使用任一种。例如，具体的杂交条件如下：(1)低严格性杂交条件在6
×
氯化钠/柠檬酸钠(ssc)中，在约45℃，然后在至少50℃，在0.2
×
ssc，0.1％sds中洗涤2次(对于低严格性条件，可以将洗涤温度升高到55℃)；(2)中等严格性杂交条件在6
×
ssc，在约45℃，然后在60℃，在0.2
×
ssc，0.1％sds中洗涤1次或多次；(3)高严格性杂交条件在6
×
ssc，在约45℃，然后在65℃，在0.2
×
ssc，0.1％sds中洗涤1次或多次且优选；(4)非常高的严格性杂交条件是0.5m磷酸钠，7％sds，在65℃，然后在65
℃，在0.2
×
ssc，1％sds中洗涤1次或多次。
85.除非另有定义，本发明所用的其他技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。
86.实施例
87.本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
88.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。
89.实验材料：
90.乳腺癌细胞：mcf-7细胞、mda-mb-231细胞、sk-br-3细胞来源于atcc。
91.fbs来源于：sigma。
92.无血清培养基来源于：sigma。
93.重组iii型人源化胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
94.cck-8试剂盒来源于：glpbio。
95.edu及细胞周期检测试剂盒来源于：碧云天。
96.实施例1：重组iii型人源化胶原蛋白对细胞增殖的影响
97.实验方法：
98.实验组：乳腺癌细胞+10％fbs培养基+重组iii型人源化胶原蛋白共培养。
99.阴性对照组：乳腺癌细胞+10％fbs培养基，无胶原蛋白共培养。
100.空白对照组：无细胞，10％fbs培养基，无胶原蛋白共培养。
101.设置实验分组后根据需要接种合适密度的三种乳腺癌细胞(mcf-7细胞、mda-mb-231细胞和sk-br-3细胞)于96孔板中，体积为100μl/孔，待细胞贴壁后加入重组iii型人源化胶原蛋白，终浓度分别为0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml、10mg/ml(图中标记为0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml、10mg/ml)，阴性对照组不加胶原蛋白(图中标记为0mg/ml)；细胞与胶原蛋白共培养24h及48h后，将96孔板转移至细胞房超净台，弃去培养基，吸净残留液体，避光条件下每孔加入100μl无血清培养基及10μl cck-8，并在96孔板外围加入pbs防止试剂挥发；将96孔板放于37℃孵箱中避光培养1小时，使用酶标仪测吸光度值od
450nm
，重复测量3次取均值。依据cck-8试剂盒说明书公式计算：细胞存活率＝(实验组od值-空白对照组od值)/(阴性对照组od值-空白对照组od值)
×
100％。
102.实验结果：
103.结果如图1～3所示，重组iii型人源化胶原蛋白可以抑制乳腺癌细胞的增殖活性。
104.分组培养后，和对照组相比，重组iii型人源化胶原蛋白处理后的三种乳腺癌细胞的增殖活性均显著降低，说明重组iii型人源化胶原蛋白对乳腺癌细胞的增殖能力有抑制
作用。
105.实施例2：重组iii型人源化胶原蛋白对细胞迁移的影响
106.实验方法：
107.实验分组同实施例1。
108.将乳腺癌细胞接种于六孔板中，体积为2ml/孔，待细胞贴壁后于实验组加入利用10％fbs培养基配制的重组iii型人源化胶原蛋白进行共培养(图中标记为实验组)，胶原蛋白终浓度为10mg/ml，对照组则加入10％fbs培养基(图中标记为对照组)。当每孔细胞铺满95％形成单层细胞时，用200μl移液枪枪头在单层细胞上呈“一”字划痕，用pbs清洗3次，继续于实验组加入利用无血清培养基配制的重组iii型人源化胶原蛋白培养，胶原蛋白终浓度为10mg/ml，对照组则加入无血清培养基，培养箱孵育24h后吸去培养液，用pbs清洗3次后，在倒置荧光显微镜下观察并拍照，同时统计细胞相对迁移率。
109.实验结果：
110.结果如图4～6所示，重组iii型人源化胶原蛋白可以抑制乳腺癌细胞的迁移能力。
111.分组培养后，和对照组相比，重组iii型人源化胶原蛋白处理后的三种乳腺癌细胞的迁移率均显著下降，说明重组iii型人源化胶原蛋白对乳腺癌细胞的迁移能力有抑制作用。
112.实施例3：重组iii型人源化胶原蛋白对细胞dna复制活性的影响
113.实验方法：
114.实验分组同实施例1，胶原蛋白共培养终浓度为10mg/ml。
115.取对数生长期的乳腺癌细胞，以每孔8
×
103个细胞接种于96孔板中。待第二天贴壁培养至正常生长阶段，使用edu试剂盒进行染色。首先，将37℃预热的1
×
的edu工作液(10μm)，等体积加入6孔板中，置于37℃孵箱孵育2h；edu标记细胞完成后，去除培养液，并加入0.1ml 4％(w/v)的多聚甲醛进行固定，常温固定15min后，去除固定液，每孔用0.1ml洗涤液洗涤细胞3次，每次3-5分钟。去除洗涤液后，每孔用0.1ml通透液(0.3％(v/v)triton x-100的pbs)，室温孵育10-15分钟。去除通透液，每孔用0.1ml洗涤液洗涤细胞1-2次，每次3-5分钟，再每孔加入0.05ml click反应液，室温避光孵育30分钟后吸除click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。用hoechst 33342进行细胞核染色，室温避光孵育10分钟。随后即可进行荧光检测。
116.实验结果：
117.结果如图7～9所示，重组iii型人源化胶原蛋白可以抑制乳腺癌细胞的dna复制活性，从而抑制乳腺癌细胞的增殖能力。
118.分组培养后，和对照组相比，重组iii型人源化胶原蛋白处理后处于增殖活性的乳腺癌细胞(红色荧光)比例显著下降，说明重组iii型人源化胶原蛋白对乳腺癌细胞的增殖(包括dna复制活性)有抑制作用。
119.实施例4：重组iii型人源化胶原蛋白对细胞周期的影响
120.实验方法：
121.实验分组同实施例1，胶原蛋白共培养终浓度为10mg/ml。
122.将mda-mb-231乳腺癌细胞用胰酶消化后，加入1ml冰浴预冷70％乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定30分钟。以1000g离心3-5分钟，沉淀细胞。加入1ml冰浴预冷的pbs，重悬细胞。
再次离心沉淀细胞，吸除上清,每管细胞样品中加入0.5ml碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30分钟后完成流式检测。
123.实验结果：
124.结果如图10所示，重组iii型人源化胶原蛋白可以影响乳腺癌细胞的分裂周期。
125.分组培养后，和对照组相比，重组iii型人源化胶原蛋白处理后，处于休眠周期(g1/g0期)的乳腺癌细胞比例显著上升，处于增殖活性周期(g2/m期)的乳腺癌细胞比例显著下降，说明重组iii型人源化胶原蛋白能够促进乳腺癌细胞进入休眠周期(g1/g0期)。
126.实施例5：重组iii型人源化胶原蛋白通过ddr1调节自噬抑制乳癌症细胞恶性肿瘤
127.实验方法：
128.1细胞系和细胞培养
129.人正常乳腺上皮细胞系mcf-10a，人腔型乳腺癌症细胞系mcf-7、人类her2阳性乳腺癌细胞系sk-br-3和本研究中包含的人类三阴性乳腺癌症细胞系mda-mb-231均购自中国科学院。mcf-10a细胞和sk-br-3细胞分别保持在含5％马血清、20ng/ml egf、5μg/ml皮质醇、10μg/ml胰岛素、1％青霉素-链霉素(p/s)的dmem/f12完全培养基中(procell，中国)和含有10％胎牛血清(fbs)和1％p/s的mccoy’s 5a完全培养基(procell，中国)。此外，mcf-7和mda-mb-231细胞均在补充有10％fbs(gibco，美国)和1％p/s(beyotime，中国)的dmem培养基(gibco(美国))中培养。所有细胞在37℃，5％ co2下孵育。
130.2重组iii型人源化胶原蛋白(简称rh-col3)的制备
131.具体制备方法参考申请号为cn201811438582.6、发明名称为“多肽、其生产方法和用途”的专利申请记载。rh-col3来源于人iii型胶原α1链(hcol3α1)，是山西锦波生物医药股份有限公司获得国家药品监督管理局批准得iii类医疗器械产品，注册证编号：国械注准20213130488。(图11)。rh-col3是由hcol3α1的三螺旋片段的16个串联重复组成(gly483-pro512)。含有rh-col3的重组表达载体将基因转化到大肠杆菌bl21(de3)菌株中。用iptg诱导后，用镍螯合物层析柱进行纯化，冻干后保存。
132.3体外ddr1阻断实验
133.在一些实验中，用10μm ddr1受体酪氨酸激酶抑制剂(ddr1-in-1，美国新泽西州，medchemexpress)预处理24小时，阻断乳腺癌细胞(bcc)中ddr1的激活。(实验参考：chen,y.l.,et al.,discoidin domain receptor-1(ddr1)is involved in angiolymphatic invasion in oral cancer.cancers,2020.12(4).)
134.4实验分组
135.在检测rh-col3对乳腺癌细胞生物学行为影响的实验中，对rh-col3进行浓度分组(0mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml，10mg/ml)。在研究rh-col3抑制bcc机制的实验中，细胞分为四组：对照组(未处理细胞)、rh-col3组(细胞在10mg/ml的rh-col3中培养48h)、ddr1-in-1组(细胞用ddr1-in-1预培养)和ddr1-in-1+rh-col3组(细胞用ddr1-in-1预培养，然后在10mg/ml的rh-col3中培养48h)。
136.5细胞活性测定
137.通过cck-8(glpbio，美国)评估细胞活力。在cck-8中分为实验组、空白组和阴性对照组，然后将每个细胞系接种在96孔板(每个孔2000个细胞)中，每组5个重复孔。24h后，加入不同浓度的rh-col3，分别培养24h和48h。最后，按照说明书加入cck-8试剂，并在黑暗条
件，37℃下孵育2h，并且使用酶标仪(thermo scientific，美国)测定在波长为450nm(a450)的吸光度。
138.6 edu测定
139.edu实验采用beyoclick
tm
edu细胞增殖试剂盒，根据说明书使用alexa fluor 555(beyotime，中国)测定不同浓度rh-col3处理下bcc的增殖活性。图像由zoe荧光细胞成像拍摄(美国，bio-rad)。细胞增殖率按以下公式计算：细胞增殖率＝edu荧光细胞数/hoechst荧光细胞。
140.7菌落形成实验
141.将bcc均匀接种在6孔板中(每个孔500个细胞)，24h后分别向每个孔中加入不同浓度的rh-col3。孵育14天后，细胞用4％多聚甲醛固定15min后，用0.1％结晶紫染色。最后，计数大于50个细胞的菌落，并通过以下公式计算：相对菌落形成率＝菌落数/接种细胞数。
142.8细胞凋亡分析
143.在用不同浓度的rh-col3培养后，先用含0.05％edta的胰蛋白酶消化，然后离心(4℃,1000g,5min)。接下来，将细胞重新悬浮在pbs中，再次离心，加入5μl annexin v-fitc和10μl碘化丙啶(beyotime,china)，黑暗孵育20min。最后在1小时内用流式细胞仪(cytoflex,beckman coulter,us)定量凋亡细胞。
144.9伤口愈合实验
145.将bccs接种在6孔板(5
×
105个/孔)并培养24h。然后用200μl无菌针尖垂直划痕每孔。pbs洗涤3次后，根据分组设置加入不同浓度无血清培养基制备的rh-col3。用倒置显微镜(nikon eclipse ts2f，日本)分别于0h、24h、48h对每个孔进行拍照，细胞迁移活性计算公式为：相对迁移率＝(24h或48h面积-0h面积)/0h面积。
146.10细胞侵袭实验
147.用matrigel基质(bd biosciences，美国)涂覆后，将8μm孔的transwell腔室(corning，us)放置在24孔板中。然后用200μl无血清培养基将bcc接种到上腔(每孔2
×
104cells)，下腔为500μl添加10％胎牛血清的培养基。24h后，用棉签去除上腔内残留的细胞，4％多聚甲醛固定细胞15分钟，0.1％结晶紫染色。最后用显微镜采集图像，计数染色细胞，测定细胞的侵袭能力。
148.11单细胞rna测序分析和生物信息学分析
149.单细胞rna测序(scrna-seq)由北京诺禾致源科技股份有限公司(中国北京)完成，用于鉴定rh-col3处理mda-mb-231细胞与对照mda-mb-231细胞之间表达差异的mrna转录本。此外，scrna-seq的rna制备和文库制备均按照厂商说明书进行。此外，乳腺癌的rna测序表达谱从tcga数据集(https://portal.gdc.com)下载。采用r软件gsva包进行分析，参数选择为method＝'ssgsea'。通过spearman相关分析基因与通路得分之间的相关性。所有分析方法和r包均采用r 4.0.3版本实现。
150.12细胞周期分析
151.收集各组处理后的bccs并离心(4℃，1000g，5min)用胰蛋白酶消化后，用70％(v/v)乙醇溶液4℃下固定24h。然后，将细胞离心，并用低温pbs清洗，再次离心以获得细胞沉淀，然后用0.5ml pi溶液在黑暗，37℃下孵育30min。最后，通过流式细胞仪，flowjo软件进行细胞周期分析。
152.13免疫印迹实验
153.细胞接受不同处理后，用低温pbs洗涤细胞，用ripa裂解液(beyotime,china)和pmsf(beyotime,china)按100:1的比例进行细胞裂解，在4℃，12000r/min离心15min。用bca试剂盒(beyotime,china)测定蛋白浓度后，将提取的蛋白与上样缓冲液(solarbio,china)混合，100℃变性5min。并在100℃下变性5min。蛋白质样品用10％sds-page分离，然后将凝胶电泳转移到0.22μm孔的pvdf膜上(millipore，美国)。用5％脱脂奶阻断2小时后，用兔抗β-肌动蛋白(1:1000,proteintech,china)、lc3(1:1000,cst,us)、sqstmq/p62(1:1000,proteintech,china)、atg3(1:1000,proteintech,china)、atg5(1:1000,proteintech,china)、ddr1(1:1000,cst,us)的一级抗体孵育膜过夜，然后用山羊抗兔igg抗体孵育90min。最后，通过ecl(beyoecl,beyotime，中国)和chemidoc mp成像系统(bio-rad，美国)显示膜上的蛋白表达水平。用imagej软件分析各组蛋白的相对表达量。
154.14串联mcherry-gfp-lc3荧光
155.串联单体mcherry gfp标记的lc3用于监测自噬通量，用腺病毒mcherry-gfp-lc3感染处理后的bccs 48h，用4％多聚甲醛固定细胞15min，用dapi(beyotime，中国)染色细胞核，观察细胞自噬通量，用共聚焦激光扫描显微镜(nikon eclipse ti，日本)随机捕获。最后用image pro plus软件分析每个细胞的gfp和mcherry点状蛋白的数量。
156.15动物实验
157.从常州卡文斯实验动物有限公司(中国江苏)购买5周龄雌性balb/c裸鼠，随机分为对照组和rh-col3组(每组6只)。首先，将对照组，mda-mb-231细胞消化，并以浓度为2
×
107个/ml的pbs悬液中重悬，而治疗组，将细胞重悬在浓度为10mg/ml的rh-col3中。用1％戊巴比妥钠(0.1ml/20g)麻醉小鼠后，将100μl细胞(2
×
106细胞)皮下接种到每只小鼠的一个乳腺脂肪垫中。实验期间，每4天测量小鼠体重和体积。采用公式(length
×
width2)/2计算肿瘤体积。接种后第28天实验结束，戊巴比妥钠麻醉小鼠，扭颈处死。最后，用无菌手术器械从小鼠皮下分离肿瘤后，测量小鼠体重、肿瘤体积和肿瘤重量。所有实验步骤均经重庆医科大学实验动物伦理委员会批准，所有实验小鼠均严格按照机构动物护理指南(《实验动物护理和使用指南》nih publication no.85-23,revised 1996)处理。
158.实验结果：
159.1rh-col3抑制bccs的存活和增殖能力，但不抑制正常乳腺上皮细胞的存活和增殖能力
160.为了研究rh-col3对bccs活性的影响，首先在不同浓度的rh-col3处理下进行cck-8测定三种类型的bcc和正常乳腺上皮细胞mcf-10a。结果表明，rh-col3在浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml和0.5mg/ml时开始对mcf-7、sk-br-3和mda-mb-231的存活率表现出有效抑制作用。结果表明，rh-col3处理48h对bcc的抑制效果优于24h，且随着rh-col3浓度的升高，抑制效果越显著，尤其是10mg/ml浓度时效果最好(图12)。此外，由于mcf-10a细胞的活性和增殖速度较癌细胞弱，本研究目前仅对mcf-10a进行了cck-8测定。同时，edu的结果显示，rh-col3浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml时，显著抑制mcf-7、sk-br-3和mda-mb-231细胞的增殖率(图13-15)。此外，rh-col3在5mg/ml和10mg/ml浓度下显著减少bcc形成的克隆数量(图16)。并有效促进bcc的凋亡(图17)。这些结果表明，rh-col3对bcc的活性有明显的抑制作用，而不影响正常乳腺上皮细胞的生长。
161.2rh-col3抑制基底细胞癌的迁移和侵袭
162.细胞迁移实验显示，rh-col3浓度分别不低于1mg/ml、2mg/ml和1mg/ml时，也能抑制mcf-7、sk-br-3和mda-mb-231的迁移(图18-20)。transwell实验显示，rh-col3浓度分别不低于0.5mg/ml、1mg/ml和0.5mg/ml时，可以缓解mcf-7、sk-br-3和mda-mb-231的侵袭(图21)。上述结果表明，rh-col3可影响bcc的各种生物学行为。此外，为了保证rh-col3良好的溶解度，再加上rh-col3是人体col3功能区的串联重复序列，价格昂贵，浓度高于10mg/ml的rh-col3并没有在上述实验中得到广泛应用。本研究后续实验也选择了10mg/ml的浓度。
163.3rh-col3处理下bccs差异表达基因的筛选
164.为了进一步探索rh-col3对bcc的抑制机制，我们对3个rh-col3处理过的细胞和对照细胞进行scrna-seq。首先，主成分分析(pca)评分图显示rh-col3治疗组和对照组之间有明显的分离(图22)。tnbc mda-mb-231在rh-col3处理下共发现2280个基因差异表达(log2foldchange》1,p《0.05)，其中1779个基因上调，501个基因下调(图23)。基因本体(go)分析显示，差异表达基因富集在细胞外基质成分、细胞外结构组织、整合素复合物等基因簇中(图24)。京都基因与基因组百科(kegg)分析表明，差异表达基因与ecm-受体相互作用、细胞粘附分子、tgf-β信号通路、癌症中的micrornas、病毒致癌、hif-1信号通路、轴突引导等相关(图25)。疾病本体论(disease ontology,do)分析显示，下调基因与乳腺癌、肾癌、肾癌等相关(图26)。在2280个差异表达基因中，结合rna-seq表达和文献回顾，发现了两个有趣的基因ddr1和sqstm1/p62，这两个基因分别与肿瘤细胞休眠和自噬有关。western blot分析证实ddr1和p62在mcf-7、sk-br-3和mda-mb-231三种类型的bcc中表达。结果显示，rh-col3处理的bcc中ddr1和p62的表达水平高于对照组(图27)。此外，tcga数据库显示，ddr1 mrna高表达的bc患者无复发生存期(rfs)更长(图28)。在富集分析中，我们发现ddr1表达与肿瘤增殖、emt、肿瘤炎症呈负相关(图29)。因此，根据上述结果，rh-col3可能通过ddr1抑制bcc的恶性，这一过程也可能与自噬有关。
165.4阻断ddr1可抵消rh-col3抑制基底细胞恶性肿瘤和保持基底细胞休眠的作用
166.为了验证ddr1(rh-col3的靶基因)在bccs中的作用，我们进行了各种实验，以研究ddr1-in-1阻断ddr1通路后bccs的生物学行为。首先，cck-8测定结果表明，阻断ddr1后，不同浓度的rh-col3不再抑制mcf-7、sk-br-3和mda-mb-231的存活率(图30)。同时，基于edu实验的结果，我们发现与对照组相比，rh-col3处理下mcf-7、sk-br-3和mda-mb-231细胞的增殖比率显著降低。相比之下，ddr1-in-1+rh-col3组的增殖细胞比率与ddr1-in-1组相比没有显著差异，这表明rh-col3通过上调ddr1表达并激活其途径来抑制bcc的增殖活性(图31)。此外，在伤口愈合试验中，rh-col3组中mcf-7、sk-br-3和mda-mb-231细胞的迁移率显著低于对照组。相反，ddr1-in-1+rh-col3组和ddr1-in-1组之间的迁移率没有差异(图32)。此外，ddr1促进肿瘤细胞进入并保持休眠，从而抑制恶性肿瘤，因此我们随后进行了细胞周期实验。结果表明，与对照组相比，rh-col3处理组g0/g1期的mcf-7、sk-br-3和mda-mb-231细胞比例增加(p《0.05)，s和g2/m期的细胞比例减少(p《0.05)。然而，在阻断ddr1的情况下，ddr1-in-1+rh-col3组和ddr1-in-1组之间每个周期的细胞比例没有显著差异(图33)。上述结果表明，rh-col3降低了bcc的增殖和迁移能力，并在休眠细胞周期中保留了肿瘤细胞，而阻断ddr1途径可以抵消这些影响。
167.5rh-col3通过激活bccs中的ddr1抑制自噬
168.值得注意的是，rna seq结果和western blot验证也表明，自噬相关基因sqstm1/p62在rh-col3组中显著升高(图27)。结合上述实验的结果，尽管在低浓度rh-col3(0.5mg/ml)的处理下，bcc的增殖和迁移活性表现出高敏感性(图12～图20)，但在高浓度rh-coo3(5-10mg/ml)处理下，凋亡率才显著增加(图17)，提示rh-col3可能不会直接促进bccs的广泛凋亡，而是由于其与自噬过程相关的功能调节。因此，我们继续研究了rh-col3处理下bccs中自噬的变化，同时确定了ddr1在其中的作用。western blot分析表明，rh-col3处理下mcf-7、sk-br-3和mda-mb-231细胞中lc3-ii/i的比率显著降低，而ddr1-in-1+rh-col3组和ddr1-in-1组的lc3-ii/i比值无显著差异。同时，在rh-col3处理下，p62蛋白的表达水平显著增加，而在阻断ddr1的情况下，ddr1-in-1+rh-col3组和ddr1-in-1组之间没有显著差异。此外，在rh-col3处理下，atg3和atg5蛋白的表达水平显著降低，而ddr1-in-1+rh-col和ddr1-in-1组之间没有显著差异(图34)。由于自噬的激活和抑制与lc3的积累和消耗密切相关，我们在用串联mcherry-gfp-lc3感染细胞后，通过共聚焦显微镜监测了mcf-7、sk-br-3和mda-mb-231细胞的自噬通量。特别是，gfp表示自噬早期的自噬体，mcherry表示晚期的自溶体。结果显示，在rh-col3处理下，每个细胞中的gfp和mcherry puncta显著减少，而ddr1-in-1+rh-col3和ddr1-in-1组之间没有显著差异(图35)。结果表明，rh-col3通过激活ddr1抑制bccs中的自噬，而阻断ddr1抵消了这种作用。
169.6rh-col3通过体内激活ddr1抑制bccs的肿瘤生长
170.最后，我们在体内验证了rh-col3对bccs肿瘤生长的影响。将tnbc mda-mb-231接种在pbs中，该pbs与rh-col3混合或不混合。根据结果，与对照组相比，rh-col3组的肿瘤生长明显较慢，解剖肿瘤的大小和质量显著减少(图36)。此外，western blot结果表明rh-col3组肿瘤组织中ddr1蛋白水平显著高于对照组。同时，rh-col3组肿瘤组织中自噬相关蛋白lcii/i比率低于对照组，而p62蛋白表达水平高于对照组(图37)。这些结果表明，rh-col3通过激活ddr1抑制体内mda-mb-231细胞的肿瘤生长，其机制可能与自噬过程的调节有关。
171.总结：
172.乳腺癌目前在全世界癌症发病率中位居第一，治疗方式有限，尤其是三阴性乳腺癌，治疗手段单一，复发转移率高，急需更有效安全的治疗手段。重组ⅲ型人源化胶原蛋白具有高水溶性，高生物活性的特点。现有实验证实，重组ⅲ型人源化胶原蛋白可以抑制乳腺癌细胞的生长增殖能力，并且可以抑制肿瘤细胞的迁移特性，且其机制可能依赖于促进肿瘤细胞进入休眠周期。这将为重组ⅲ人源化型胶原蛋白在临床上应用于乳腺癌患者的安全性和有效性提供一定的理论基础。
173.进一步，实验不仅证实了rh-col3对三种类型的基底细胞癌的抑制作用：luminal型、her2阳性型和tnbc型。随后，为了探索rh-col3的抗癌机制，通过scrna-seq分析鉴定了效应器ddr1，并分析了该过程与自噬调节相关。接下来，阐明了rh-col3如何通过激活ddr1抑制bcc的自噬。最后，在体内验证了rh-col3对裸鼠肿瘤生长的抑制作用。上述发现表明，rh-col3的应用可能是bc患者的潜在治疗方法，有望减少复发转移并改善患者的预后。

技术特征：
1.重组iii型人源化胶原蛋白在制备用于预防和/或治疗乳腺疾病的药物中的用途；其中，所述重组iii型人源化胶原蛋白包含以seq id no.1所示的序列的n个重复，n为大于等于1的整数，其中当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述重组iii型人源化胶原蛋白包含以seq id no.2所示的序列或者不含以seq id no.2所示的序列。3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述重组iii型人源化胶原蛋白包含：a)seq id no.3的氨基酸序列；b)与seq id no.3的氨基酸序列具有90％同一性的氨基酸序列，其保留seq id no.3的氨基酸序列的细胞黏附效果；c)seq id no.3的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，其保留seq id no.3的氨基酸序列的细胞黏附效果；或d)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码seq id no.3的氨基酸序列在严格条件条件下杂交，所述氨基酸序列保留seq id no.3的氨基酸序果，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。4.根据权利要求1～3中任一项所述的用途，其特征在于，所述乳腺疾病为乳腺癌。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述乳腺癌包括管腔a型乳腺癌、管腔b型乳腺癌、her-2过表达型乳腺癌、基底细胞样型乳腺癌、三阴性乳腺癌和正常乳腺样型乳腺癌。6.根据权利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述乳腺癌为管腔a型乳腺癌、her-2过表达型乳腺癌、基底细胞样型乳腺癌或三阴性乳腺癌。7.根据权利要求4～6中任一项所述的用途，其特征在于，所述重组iii型人源化胶原蛋白通过抑制乳腺癌细胞的增殖能力、抑制乳腺癌细胞的迁移能力和/或促进乳腺癌细胞休眠来预防和/或治疗乳腺癌。8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述抑制乳腺癌细胞的增殖能力包括抑制乳腺癌细胞的dna复制活性。

技术总结
本发明属于生物医药领域，具体涉及重组III型人源化胶原蛋白在乳腺癌治疗中的用途。本发明重组III型人源化胶原蛋白在制备用于预防和/或治疗乳腺疾病的药物中的用途；其中，所述重组III型人源化胶原蛋白包含以SEQ ID No.1所示的序列的n个重复，n为大于等于1的整数，其中当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的。研究结果表明，重组III型人源化胶原蛋白可以明显抑制乳腺癌细胞的DNA复制活性，进一步抑制生长增殖能力，并可以抑制肿瘤细胞的迁移特性，同时还可以促进乳腺癌细胞进入休眠。胞进入休眠。胞进入休眠。


技术研发人员：杨霞 胡丽娜 李虎 明佳 刘潇蔚 董晓静 胡建国
受保护的技术使用者：重庆医科大学附属第二医院
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/7/13