一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法与流程

1.本发明涉及一种紫外比色可视化定量分析方法及其在生化检验中的应用，特别是涉及一种pd
2+
掺杂agau-agi纳米酶的分析监测方法及其在尿酸和尿酸氧化酶检测中的应用，属于功能生物材料和生物传感技术领域。


背景技术：

2.尿酸(ua)是嘌呤(核酸的一种成分)在肝脏中代谢的最终分解产物，尿液中正常值为1.49至4.46mm，血样中为0.13至0.46mm，临床上证明其表达水平异常可引起各种病理症状，如高尿酸血症、神经和心血管疾病等，也是阿尔茨海默病和帕金森病的征兆。目前已经存在各种检测ua的分析方法，如高效液相色谱法、气相色谱-质谱法、电化学法、比色法和荧光法。其中，比色法由于其时效性、快速性、简单性等更具有吸引力和前景，但是由于体液及血液的复杂性、机体的个体差异性等阻力，可视化比色法仍然存在需要改进的地方，才能满足临床的需求。另一方面，ua能够被尿酸氧化酶(urate oxidase，uox)水解产生尿囊素和过氧化氢，但是目前对于uox的分析检测具有很大的空白(未见相关检测方法)，为了实现ua及其生物通路的精准分析和全面分析，本专利以ua和uox分析对象，聚焦于紫外比色分析方法，开发了一种新颖的监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法，这对临床上疾病诊断和相关并发症的预防具有重要意义。
3.天然酶具有制备费力、易变性、难回收等固有缺陷，限制了其实际应用。因此，基于纳米材料的酶模拟物备受关注，尤其是贵金属纳米酶，它的活性与天然过氧化物酶相当，生物相容性和固有的稳定性也很优秀。其中，pd纳米材料具有独特的电子性能和较高的催化活性，被认为是一种很有前途的过氧化物酶类纳米酶。此外，由于不同金属纳米颗粒之间的协同作用，双金属合金(如：pd-au、pd-ag和pd-pt等)对h2o2的催化活性优于单金属纳米颗粒。这为用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法的构建提供了新思路。
4.本发明设计了一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法。首先，制备了具有较好的电子传递速率及催化性能的pd
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/agau-agi纳米酶，在酸性环境中可以对h2o2进行催化还原，将无色tmb氧化成蓝色ox-tmb，紫外吸收增加。在一定的浓度范围内，h2o2浓度越高，产生的
·
oh越多，氧化tmb也就越多，溶液蓝色程度越深，吸光度值越大；uox能够催化ua生成一定量的h2o2，基于此，本专利利用h2o2作为信号输出，实现ua(uox)的可视化定量分析方法的设计。检测时，分别固定uox或ua浓度，可实现不同浓度的目标物(h2o2、ua和uox)的可视化定量分析。ua(uox)在临床疾病诊断中具有重要意义，目前尚未发现基于新型pd
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/agau-agi纳米酶实现ua(uox)分析检测的可视化定量方法，尤其是uox。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的问题是提供一种快速、灵敏度高、成本低的用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法。
6.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶
变化的可视化定量分析方法，具体步骤如下：
7.(1)pd
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/agau-agi纳米酶的制备
8.依次将25～35ml浓度为0.15m的ki溶液与5～15ml浓度为0.15m的agno3溶液，0.3～1ml浓度为0.015m的haucl4溶液混合，然后将1～5ml浓度为25％的氨水逐滴加入以上溶液，先超声10～30min混匀溶液后继续搅拌18～24h(200～500rpm，25℃)，反应完成后用超纯水/无水乙醇交替洗涤2～5次(3000～6000rpm，25℃)，在50～80℃电热恒温鼓风干燥箱中干燥6～8h后即得agau-agi纳米复合材料。将0.5～1g上述agau-agi纳米复合材料溶解于30～35ml浓度为0.075m的pd(no3)2溶液中室温搅拌60～80min，经过滤、清洗后于真空干燥箱50～80℃中干燥得到pd
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/agau-agi纳米酶，用超纯水超声分散得到1mg/ml的溶液，备用。
9.(2)紫外比色传感方法的构建
10.a.将96孔石英酶标板放入超声仪中依次用乙醇和蒸馏水分别清洗2～5次，每次超声10～15min，然后晾干备用。
11.b.取1mg/ml 5～10μl pd
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/agau-agi纳米酶、10mm 5～10μl tmb、0～10mm 1～10μl h2o2依次加入到70～89μl 0.1m ph 4.0醋酸缓冲液(hac-naac)中，维持每个测试样本最终体积为100μl，利用酶标仪测试其紫外吸收曲线，波长范围500～800nm，并通过高清相机进行比色拍照。
12.c.基于pd
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掺杂agau-agi纳米酶的紫外比色传感器在ua及uox分析检测中的应用：总体积为50μl的ua及uox反应液：ua(50μm)、uox(50u/l)、磷酸缓冲溶液(na2hpo4/nah2po4，0.1m，ph 7.0)，于25～45℃下反应10～30min，随后取1mg/ml 5～10μl pd
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/agau-agi纳米酶、10mm 5～10μl tmb、5～10μl的ua及uox反应液依次加入到70～85μl 0.1m ph 4.0醋酸缓冲液中，维持每个测试样本最终体积为100μl，利用酶标仪测试其紫外吸收曲线，波长范围500～800nm。利用酶的反应液用于反应后生成的h2o2分析，间接实现ua及uox分析检测。
13.利用上述一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法，采用紫外分光光度法，设置波长500～800nm，测定上述总体积100μl溶液的吸光度的值，取652nm的吸光度值，实现可视化定量分析。
14.利用上述一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法，更改ua浓度(终浓度：0～100μm)或是uox(终浓度：0～100u/l)，实现不同浓度的ua(uox)可视化定量分析。
15.发明原理：本发明设计了一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法，首先将pd
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掺杂在纳米材料制备pd
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/agau-agi纳米酶以改善其电子转移速率及提高催化剂的催化效率，能够催化还原h2o2分解释放
·
oh，
·
oh进一步氧化显色底物tmb，紫外吸收增加，底物产生无色到蓝色的变化，实现h2o2的可视化响应。其次利用uox能够催化ua生成h2o2，通过分别固定uox或ua浓度，以h2o2的吸光度值作为信号输出，实现对ua和uox的可视化定量分析。通过紫外分光光度法，建立吸光度与h2o2、ua和uox浓度之间的定量关系，通过颜色变化监测实现对h2o2、ua和uox的比色检测。基于此，构建了一种分析快速、操作简便、成本低的h2o2、ua和uox可视化定量检测方法。
16.与现有的技术相比，本发明的优点在于：本发明设计了一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法。首先，制备具有较好的电子传递速率及催化性能的pd
2+
/agau-agi纳米酶，在一定的浓度范围内，h2o2浓度越高，溶液蓝色程度越深，吸光度值越
大。其次，利用uox能够催化ua生成h2o2，通过分别固定uox或ua浓度，间接实现ua及uox分析检测。因此通过紫外方法和比色方法的协调对照试验可快速并方便地实现h2o2、ua和uox的分析检测。其优点在于：
17.(1)pd
2+
/agau-agi纳米酶的制备。相较于agau-agi材料掺杂了pd
2+
，具有较好的电子传递速率及催化性能，并将其第一次用于ua及uox定量分析方法的设计，具有较好的创新性。
18.(2)灵敏度高。本发明是一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法，分别得到3条线性方程：吸光度与h2o2线性相关方程为r2＝0.9969，检测限是0.036μm；吸光度与ua线性方程为y＝0.091lgc
ua
+0.101，r2＝0.9931，检测限是0.024μm；吸光度与uox线性方程为y＝0.107lgc
uox
+0.069，r2＝0.9901，检测限是0.033u/l，说明该传感器可实现对h2o2、ua、uox的高灵敏度检测。
19.(3)操作简便且肉眼可识别。本发明利用pd
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/agau-agi纳米酶可以实现h2o2、ua和uox的可视化定量分析检测，结果直观，方法简单。
20.(4)抑制剂筛选。本发明第一次将pd
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/agau-agi纳米酶用于uox定量分析，并用于它的抑制剂筛选，随着k
+
的引入，uox活性收到很大的抑制，表现出较好的抑制效应。
21.综上所述，本发明是构建了一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法并应用于h2o2、ua、uox的检测，具有灵敏度高、操作简单、成本低、等优点，具有良好的应用前景。
附图说明
22.图1为本发明传感器的可行性分析及比色图；
23.图2为本发明传感器对ua(uox)分析检测的可行性实验及比色图；
24.图3为本发明传感器对不同浓度h2o2吸光度对浓度的线性关系及比色图；
25.图4为本发明传感器对不同浓度ua吸光度对浓度的线性关系及比色图；
26.图5为本发明传感器对不同浓度uox吸光度对浓度的线性关系及比色图；
27.图6为本发明传感器不同浓度k
+
对uox活性的抑制作用及比色图。
具体实施方式
28.以下结合附图实施例对本发明进一步详细描述。
29.实施例1 pd
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/agau-agi纳米酶的制备
30.将30ml浓度为0.15m的ki溶液与10ml浓度为0.15m的agno3溶液混合，再加入0.5ml浓度为0.015m的haucl4溶液，然后将2.5ml浓度为25％的氨水逐滴加入以上溶液，先超声20min后继续搅拌24h(300rpm，25℃)，反应完成后用超纯水离心清洗3次(4000rpm，25℃)，在70℃真空干燥箱干燥后即得agau-agi纳米复合材料。将0.5g上述agau-agi纳米复合材料溶解于32ml浓度为0.075m的pd(no3)2溶液中室温搅拌60min，经过滤、清洗后于真空干燥箱70℃于燥得到pd
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/agau-agi纳米酶，用超纯水超声分散得到1mg/ml的溶液，备用。
31.实施例2紫外比色传感方法的构建
32.a.将96孔石英酶标板放入超声仪中依次用乙醇和蒸馏水分别清洗3次，超声10min，然后晾干备用。
33.b.取1mg/ml 10μl pd
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/agau-agi纳米酶、10mm 10μl tmb、0～10mm 1～10μl h2o2依次加入到70～89μl 0.1m ph 4.0醋酸缓冲液中，维持每个测试样本最终体积为100μl，利用酶标仪测试其紫外吸收曲线，波长范围500～800nm。
34.一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法：
35.上述步骤2b不同浓度的h2o2为：0，0.0001，0.0003，0.0005，0.001，0.003，0.005，0.01，0.03，0.05，0.1，0.3，0.5，1，3，5mm。基于此能够应用于h2o2的检测分析。
36.一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法在ua及uox分析检测：总体积为50μl的ua及uox反应液终浓度：ua(0，0.1，0.2，0.5，0.7，1，2，5，7，10，20，50，70，100μm)、uox(0，0.1，0.2，0.3，0.5，1，2，3，5，10，20，30，50，100u/l)、磷酸缓冲溶液(na2hpo4/nah2po4，0.1m，ph7.0)，于25～45℃下反应10～30min，随后取1mg/ml 10μl pd
2+
/agau-agi纳米酶、10mm 10μl tmb、10μl的ua及uox反应液依次加入到70μl 0.1m ph 4.0醋酸缓冲液中，维持每个测试样本最终体积为100μl，利用酶标仪测试其紫外吸收曲线，波长范围500～800nm。利用酶的反应液用于反应后生成的h2o2分析，间接实现ua及uox分析检测。
37.按照上述步骤制备传感器，结果如图1所示，曲线1是溶液中依次加入pd
2+
/agau-agi纳米酶、tmb、h2o2，溶液呈蓝色；曲线2是溶液中依次加入pd
2+
/agau-agi纳米酶和tmb，吸光度值较低，溶液颜色呈现微微蓝色；曲线3是溶液中依次加入pd
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/agau-agi纳米酶和h2o2，吸光度值很低，溶液无色：曲线4是溶液中依次加入agau-agi纳米材料、tmb、h2o2，吸光度值比曲线1小，溶液呈现微蓝色；曲线5是溶液中依次加入agau-agi纳米材料和tmb，吸光度值很小，溶液呈现无色；曲线6是溶液中依次加入agau-agi纳米材料和h2o2，吸光度值很小，溶液呈无色。因此，加入pd
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/agau-agi纳米酶、tmb、h2o2的混合溶液吸光度最大、比色图蓝色最深。
38.按照上述步骤制备传感器，结果如图2所示，曲线1是依次加入pd
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/agau-agi纳米酶、tmb、包含ua及uox反应液的吸光度值，溶液颜色呈现蓝色；曲线2溶液中依次加入pd
2+
/agau-agi纳米酶、tmb、ua，吸光度值很低，溶液无色；曲线3溶液中依次加入pd
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/agau-agi纳米酶、tmb、uox，吸光度值很低，溶液无色。可以看出，传感器对ua和uox有良好的紫外比色响应，可以应用于ua(uox)的检测。
39.实施例3 h2o2的分析检测
40.一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法，基于实施例1制备我们的比色传感器。见图3，按上述实施例1的传感器制备步骤，通过改变h2o2浓度(终浓度：0，0.0001，0.0003，0.0005，0.001，0.003，0.005，0.01，0.03，0.05，0.1，0.3，0.5，1，3，5mm)，最后反应的总体积100μl，其他步骤不变，基于此得到一系列h2o2传感器，并应用于h2o2的传感分析。传感器对h2o2的吸光度与浓度呈现良好的关系，线性方程为r2＝0.9969，线性范围为0.0001～3mm，检测限是0.036μm。从图中可以看出在线性范围内随h2o2浓度的增大，吸光度的值增大，此时可通过肉眼观察到溶液颜色从无色到蓝色，可以实现对h2o2的可视化检测。
41.实施例4 ua的分析检测
42.按照上述实施例1步骤制备传感器，通过改变ua浓度(终浓度：0，0.1，0.2，0.5，0.7，1，2，5，7，10，20，50，70，100μm)，维持每个测试样本最终体积为100μl，其他步骤不变，基于此得到一系列ua传感器，并应用于ua的传感分析。ua浓度与吸光度的关系如图4，传感
器对ua的吸光度与浓度呈现良好的关系，线性方程为y＝0.091lgc
ua
+0.101，r2＝0.9931，线性范围为0.1～50μm，检测限是0.024μm。从图中可以看出在线性范围内随ua浓度的增大，吸光度的值增大，图中的比色图颜色和ua浓度对应，溶液由无色逐渐变为蓝色，可以实现对ua的可视化检测。
43.实施例5 uox的分析检测
44.按照上述实施例1传感器制备步骤，通过改变uox浓度(终浓度：0，0.1，0.2，0.3，0.5，1，2，3，5，10，20，30，50，100u/l)，维持每个测试样本最终体积为100μl，其他步骤不变，基于此得到一系列uox比色传感器，并应用于uox的传感分析。uox浓度与吸光度的关系如图5，传感器对uo
x
的吸光度与浓度呈现良好的关系，线性方程为y＝-0.107lgc
uox
+0.069，r2＝0.9901，线性范围为0.1～30u/l，检测限是0.033u/l。从图中可以看出在线性范围内随uox浓度的增大，吸光度的值逐渐增大，图中的比色图和uox的浓度对应，其溶液蓝色程度随着aa浓度的增加而增强，可以实现对uox的可视化检测。
45.实施例6 uox抑制剂k
+
的检测
46.一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法，传感器的制备步骤同具体实施例1，相同条件下，uox的浓度为50u/l，加入不同浓度的k
+
：0，0.001，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5，1，3，10，30，50，70，100μm，维持每个测试样本最终体积为100μl，其他步骤不变，其他步骤同上，可实现对抑制剂的检测。结果如图6，随着k
+
浓度的增大，相对应的吸光度强度抑制得越明显，说明k
+
对uox活性的抑制作用越强。对于构建的传感器，k
+
半抑制浓度为1.14μm。
47.以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法，其机理如下：首先，制备了具有较好的电子传递速率及催化性能的pd
2+
/agau-agi纳米酶，在酸性环境中可以对h2o2进行催化还原，将无色tmb氧化成蓝色ox-tmb，紫外吸收增加。在一定的浓度范围内，h2o2浓度越高，产生的
·
oh越多，氧化tmb也就越多，溶液蓝色程度越深，吸光度值越大；uox能够催化ua生成一定量的h2o2，基于此，本专利利用h2o2作为信号输出，实现ua(uox)的可视化定量分析方法的设计。检测时，分别固定uox或ua浓度，可实现不同浓度的目标物(h2o2、ua和uox)的可视化定量分析。ua(uox)在临床疾病诊断中具有重要意义，目前尚未发现基于新型pd
2+
/agau-agi纳米酶实现ua(uox)分析检测的可视化定量方法，尤其是uox。2.根据权利要求1所述的一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法，其特征在于：第一次将pd
2+
/agau-agi应用于ua和uox检测的定量分析领域，对疾病诊断和相关并发症的预防具有重要意义；随后将其用于uox抑制剂的筛选(k
+
)，对相关疾病的药物开发及治疗具有一定的指导意义。3.根据权利要求1-2所述的一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法，其特征在于：该可视化定量分析方法实现了h2o2、ua和uox的灵敏检测，该方法具有较好的灵敏度，h2o2、ua和uox的检测限分别为0.036μm、0.024μm和0.033u/l。

技术总结
本发明公开了一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法，首先将Pd


技术研发人员：张顺 胡宇芳 任信信 王鹤儒 张沛瑶
受保护的技术使用者：宁波市第二医院
技术研发日：2023.05.09
技术公布日：2023/7/13