一种鉴定藤本状和灌木状两面针种质的EST-SST分子标记、引物对和鉴定方法与流程

一种鉴定藤本状和灌木状两面针种质的est-sst分子标记、引物对和鉴定方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及est-sst分子标记，具体涉及一种鉴定藤本状和灌木状两面针种质的est-sst分子标记、引物对和鉴定方法。


背景技术：

2.两面针是一味著名的中药材，其药用历史悠久，以“蔓椒”之名始载于秦汉时期的《神农本草经》，来源于是芸香科花椒属的植物两面针zanthoxylum nitidum(roxb.)dc.的根，主产于中国广西、广东等地。由于两面针这一物种包含1个原变种zanthoxylum nitidum var.nitidum(roxb.)dc.和1个毛叶变种zanthoxylum nitidum var.tomentosum huang，原变种又根据植株各部是否被毛、刺的多少、小叶的大小形态等分成3个类型，3个类型的两面针苗期均表现出灌木性状，成年后类型1偏木质藤本性状，类型2和类型3偏灌木性状。近年来，两面针人工驯化引种工作虽取得了较大成功，但驯化过程中出现很多种质表型相似，类型特征不明显，遗传背景不清晰的问题，不利于种质资源的鉴定、评价、研究和利用。灌木性状是两面针重要性状之一，灌木性状的种质较木质藤本的种质木质化程度更高，株型更紧凑，人工种植时不需要搭设支架，因此选择灌木性状的种质可提高种植密度、节约种植成本。而现有的文献里并没有关于如何快速准确筛选灌木性状的两面针的方法，专利cn102191318a公开了一种基于rdna its-d3区核苷酸序列鉴别药用植物的方法，给出了利用rdna its-d3区核苷酸序列鉴别不同药用植物亲缘关系的思路，该方法后期需要大量的生物信息学分析；该思路在如何鉴别藤本状和灌木状两面针种质上并不适用。
3.ssr分子标记具有灵敏度强、操作简单、分布较广、多态性丰富等优点，为药用植物功能基因鉴定、品种鉴定、分子标记辅助育种等提供了新的思路，但关于两面针灌木性状和藤本性状的ssr分子标记尚未见报道。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提出一种鉴定藤本状和灌木状两面针种质的est-sst分子标记、引物对和鉴定方法。
5.本发明的技术方案是这样实现的：
6.本发明提供一种鉴定两面针灌木性状和藤本性状的est-sst分子标记，所述1个分子标记所针对的ssr位点包括zyx31，各位点核苷酸序列所包含的重复单元分别为(ata)6。
7.所述分子标记的上下游引物序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
8.本发明还提供了一种鉴定鉴定藤本状和灌木状两面针种质的方法，包括如下步骤：提供待鉴定品种，提取样品基因组dna；采用上述分子标记的上下游引物，通过荧光pcr扩增，得扩增产物；将所述扩增产物进行电泳检测荧光pcr扩增产物。
9.再将扩增产物稀释，加入包含染料片段标准品的去离子甲酰胺，进行毛细管电泳检测；将所述毛细管电泳检测结果进行峰图分析，得到等位基因分型表及分型峰图，根据编
码形成的指纹图谱，判断待测样本的种质。
10.具体的，所述荧光pcr的反应体系为：1μl 10ng/μl的模板，0.5μl 10pm上游引物，0.5μl10pm下游引物，5μl 2
×
taq pcr master mix和超纯水3μl。
11.具体的，所述荧光pcr的扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62～52℃梯度退火30s，72℃延伸30s，运行10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，运行25个循环；72℃延伸20min。
12.进一步，所述荧光毛细管电泳检测体系为：1μl 10ng/μl稀释后的荧光pcr产物、0.5μl染料片段标准品(genescan
tm
500 liz)、8.5μl高度去离子甲酰胺(hi-di
tm formamide)。
13.待测样本为藤本状两面针种质时，在127bp处等位基因均显示阴性，在133bp、134bp、136bp处有1或2个等位基因显示阳性。
14.待测样本为灌木状两面针种质时，在127bp处等位基因显示阳性，在133bp、134bp、136bp处的等位基因均显示阴性。
15.本发明具有以下有益效果：
16.与现有形态鉴定技术相比，本发明首次发现鉴定两面针灌木性状和藤本性状的est-sst分子标记位点，并设计1对特异性的引物组，通过荧光pcr以及毛细管电泳检测峰图，得到基因分型情况，藤本状两面针种质，在127bp处等位基因均显示阴性，在133bp、134bp、136bp处有1或2个等位基因显示阳性。而灌木状两面针种质，在127bp处等位基因显示阳性，在133bp、134bp、136bp处的等位基因均显示阴性。根据该特点，可以实现快速、准确判断待测样本的种质；本技术的鉴定方法在种间通用性更好，有快速、准确、专属性强、可靠等优点，也可为两面针遗传多样性分析、与近缘属种的亲缘关系鉴定、系统进化等研究提供重要的工具和有价值的信息。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为实施例2中部分参与检测样品的电泳图示例。
19.图2为实施例2中部分样品pcr产物凝胶电泳检测胶图。
20.图3为实施例2中部分藤本种质获得的xyz31检测数据图示例。
21.图4为实施例2中部分灌木种质获得的xyz31检测数据图示例。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.实施例1
24.发明人团队依据两面针简化基因组数据设计合成了192对ssr引物，初步对10个不同来源的两面针种质的鉴定效果进行筛选，192对引物组及鉴定结果统计如下表，结果显示107对ssr引物扩增失败，43对ssr引物扩增成功单杂峰明显，仅有39对ssr引物多态性良好。进一步从多态性良好的ssr引物中筛选到15对引物如表1所示，在51个种群的142个样本进行扩增。
25.表1 15对ssr引物的信息
[0026][0027][0028]
扩增结果使用genaiex软件计算分析得出15对引物的遗传多样性，结果如表2所示：
[0029]
表2 15对ssr引物扩增产物的指标
[0030][0031]
可知：共检测出245个等位基因(na)，其中，最小等位基因数目为9，最大等位基因数目为37，平均每个位点等位基因数目为16.333。有效等位基因(ne)总数为85.828，数值变化范围为2.271(zyx092)-13.464(zyx137)，平均每个位点有效等位基因数目为5.722，有效等位基因所占比例为35.03％。香农指数(i)的数值范围为1.313(zyx092)-2.994(zyx137)，平均值1.984。观测杂合度(ho)的数值范围为0.114(zyx092)-0.681(zyx006)，平均值0.481。期望杂合度(he)的数值范围为0.565(zyx092)-0.926(zyx137)，平均值0.777。多态信息含量(pic)的数值范围为0.531(zyx092)-0.922(zyx137)，平均值0.756。文献指出多态性信息指数(pic)等指标是衡量ssr分子标记多态性高低的重要指标，当pic》0.5时，表现为高度多态性，本研究中pic范围为0.531～0.922，平均值为0.756，说明所筛选的15对引物具有较高的多态性，能有效揭示两面针的遗传多样性。
[0032]
进一步从15对能将两面针种质区分开的ssr引物中筛选出了1对ssr引物能够鉴定两面针灌木性状和藤本性状，具体的操作方法包括如下步骤：
[0033]
s1，提供待检样品：
[0034]
从不同地区随机选择已知为藤本状和木本状的两面针样品(种质编号为采样时方便记录而进行的命名)，采集16个木质藤本两面针种群的44个个体样品，样品种质编号及采集来源地信息见下表3；28个灌木状两面针种群的78个个体样品，样本编号及采集来源地信息见下表4。
[0035]
表3木质藤本状两面针样品种质编号及采集信息
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表4灌木状两面针样品种质编号及采集信息
[0038]
[0039][0040]
s2，提取基因组dna：
[0041]
每份材料叠放整齐后用剪刀剪取适量叶片于2ml离心管中。低温冷冻采好样品的离心管，使用组织研磨仪将叶片充分研磨成粉末状，使用天根植物基因组dna提取试剂盒提取待检测样品基因组dna。用nanodrop one检测dna的浓度，用超纯水将dna稀释为10ng/μl备用。部分样品提取基因组dna电泳图如图1所示。
[0042]
s3，荧光pcr扩增：
[0043]
pcr反应体系，包括：1μl基因组dna，0.3μl上、下游引物(10pm)，5μl 2
×
taq pcr master mix，超纯水补足至10μl。
[0044]
反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，62～52℃退火30s，72℃延伸30s，运行10个循环，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，运行25个循环，最后72℃延伸20min。
[0045]
s4，毛细管电泳：
[0046]
取2ul荧光pcr扩增产物，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测荧光pcr扩增条带是否正常(部分样品抽检结果如图2所示)，并参照标准dna marker将荧光pcr产物稀释至相同浓度，分别取每个稀释后的荧光pcr产物1μl加入liz 500内标0.5μl(genescan
tm
500 liz)、去离子甲酰胺8.5μl(hi-di
tm formamide)，上abi 3730xl测序仪进行毛细管电泳检测，结果如表5所示。
[0047]
s5，数据处理：
[0048]
荧光毛细管电泳结果使用峰图分析软件genemarker 2.0读取荧光pcr扩增片段大小，得到等位基因分型表及分型峰，针对上述44个藤本状种质样品和78个灌木状种质样品的zyx31位点峰图进行逐一分析，可见ssr引物zyx31的等位基因有10个，从小到大排序为126、127、128、129、130、131、132、133、134、136。
[0049]
表5 zyx31引物扩增的pcr产物的毛细管电泳结果
[0050][0051]
藤本状的两面针种质在127bp处等位基因均显示阴性，在133bp、134bp、136bp处有1-2个等位基因显示阳性(图3可见部分藤本状种质的毛细管电泳峰图)。灌木状的两面针种质在127bp处等位基因均显示阳性，在133bp、134bp、136bp处的等位基因均显示阳性(图4可见部分灌木状种质的毛细管电泳峰图)。
[0052]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种鉴定藤本状和灌木状两面针种质的est-sst分子标记，其特征在于：所述est-sst分子标记针对的ssr位点包括zyx31，各ssr位点的核苷酸序列包含的重复单元为(ata)6。2.一组引物对，其特征在于：所述引物对用于检测权利要求1所述的est-sst分子标记。3. 根据权利要求2所述的引物对，其特征在于：所述引物对的核苷酸序列如seq id no.11和seq id no.12所示。4.利用权利要求2或3所述的引物对鉴定藤本状和灌木状两面针种质的方法，其特征在于，步骤如下：（1）以待测样本的基因组dna为模板，以权利要求3所述的引物对为上游引物和下游引物，进行荧光pcr扩增；（2）步骤（1）的荧光pcr扩增产物经电泳检测目标产物条带，并回收目标产物；（3）步骤（2）的目标产物经毛细管电泳检测后，进行峰图分析，得等位基因分型表和分型峰图，根据编码形成的指纹图谱，判断待测样本的种质。5. 根据权利要求4所述的鉴定藤本状和灌木状两面针种质的方法，其特征在于：所述步骤（1）中进行荧光pcr扩增的荧光pcr体系还包括2
×
taq pcr master mix和超纯水。6. 根据权利要求5所述的鉴定藤本状和灌木状两面针种质的方法，其特征在于，所述荧光pcr体系具体为：1μl 10ng/
µ
l的模板，0.5μl 10pm上游引物，0.5μl 10pm下游引物，5μl 2
×
taq pcr master mix和超纯水3μl。7. 根据权利要求5或6所述的鉴定藤本状和灌木状两面针种质的方法，其特征在于：所述荧光pcr的扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30 s，62~52℃梯度退火30 s，72℃延伸30 s，运行10个循环；95℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，运行25个循环；72℃延伸20 min。8. 根据权利要求7所述的鉴定藤本状和灌木状两面针种质的方法，其特征在于：所述步骤（3）中毛细管电泳检测体系为：1μl 10ng/
µ
l稀释后的目标产物、0.5μl染料片段标准品、8.5μl高度去离子甲酰胺。9.根据权利要求8所述的鉴定藤本状和灌木状两面针种质的方法，其特征在于：待测样本为藤本状两面针种质时，在127bp处等位基因均显示阴性，在133bp、134bp、136bp处有1或2个等位基因显示阳性。10.根据权利要求8所述的鉴定藤本状和灌木状两面针种质的方法，其特征在于：待测样本为灌木状两面针种质时，在127bp处等位基因显示阳性，在133bp、134bp、136bp处的等位基因均显示阴性。

技术总结
本发明属于生物技术领域，涉及EST-SST分子标记，具体涉及一种鉴定藤本状和灌木状两面针种质的EST-SST分子标记、引物对和鉴定方法。本发明首次发现鉴定两面针灌木性状和藤本性状的EST-SST分子标记位点，并设计1对特异性的引物组，通过荧光PCR以及毛细管电泳检测峰图，得到基因分型情况，藤本状两面针种质，在127bp处等位基因均显示阴性，在133bp、134bp、136bp处有1或2个等位基因显示阳性。而灌木状两面针种质，在127bp处等位基因显示阳性，在133bp、134bp、136bp处的等位基因均显示阴性。根据该特点，可以实现快速、准确判断待测样本的种质。准确判断待测样本的种质。准确判断待测样本的种质。


技术研发人员：朱艳霞 汤丹峰 林杨 韦坤华 马庆 张洪胜
受保护的技术使用者：华润三九医药股份有限公司
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/7/13