一种DNAMarker制备的紧凑型质粒的构建方法及其应用与流程

一种dna marker制备的紧凑型质粒的构建方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及分子生物学技术，具体涉及一种dna marker制备的紧凑型质粒的构建方法及其应用。


背景技术：

2.dna marker是一种包含不同已知长度的dna片段的混合物，常用于核酸电泳，用于指示未知dna样品的大小、型态和相对质量。作为一种最基础的分子生物学和生物技术研究工具，dna marker具有不可替代的作用和应用市场。
3.目前用于dna marker制备的dna片段主要有通过三种方法获得：第一种方法是化学合成法，该方法通常仅适用于碱基对数目小于100bp的dna片段；第二种方法是pcr扩增法，该方法通常适用于碱基对数目在100bp～5000bp之间的dna片段，采取pcr扩增法获得dna片段，由于dna片段配比需要反复优化，导致工作量极大，此外，pcr扩增法还存在扩增产物不专一、引物难以去除、长片段扩增效率低等一系列缺点；第三种方法是酶切法，该方法是目前dna marker制备时获得dna片段的主流方法，能够适用于大小不同碱基对数目的dna片段，同时酶切法还具有目标片段配比固定、可通过发酵大量制备等优点。
4.采用酶切法制备dna片段时，设计用于酶切的质粒至关重要，设计该质粒时应当满足以下要求：第一，质粒应包含高效复制起点和压力筛选基因，碱基对数目应当尽可能的少，以利于质粒高效扩增；第二，在有限大小的质粒上，在保证酶切反应能够顺利进行的前提下，设置尽可能多的同种限制性内切酶切点，提高质粒的利用率，使得质粒的结构紧凑；第三，酶切位点的数目和位置要合理，能够保证不同大小的dna片段具有合适的比例。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种dna marker制备的紧凑型质粒的构建方法及其应用，该方法设计过程中首先在参考质粒中最不易改变的筛选标记基因中找到或引入第一个目标限制酶的切点，并以该位点为锚点，通过插入、删除、编辑等方式引入更多目标限制酶切点完成目标质粒序列的设计，并以设计序列为蓝本获得目标质粒，可以解决现有技术中用于制备dna marker的质粒利用率低的问题。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于dna marker制备的紧凑型质粒的构建方法，其特征在于，该方法为：
7.步骤1、目标质粒的设计：
8.步骤1.1、确定一个用于目标质粒设计的参考质粒，命名为p1，所述p1上的筛选标记基因为s1，所述筛选标记基因的核苷酸序列为s1序列；
9.选择一种目标限制性内切酶x，所述目标限制性内切酶x识别的序列为s2；
10.步骤1.2、第一酶切位点q1的确定：
11.当步骤1.1所述s1序列中有s2序列时，按照如下步骤进行：
12.在步骤1.1所述s1序列中寻找s2序列，所述s1序列中包含n个s2位点，标记为rs-1
～rs-n，n为≥1的自然数；
13.当n＝1时，位点rs-1标记为步骤1.1中所述p1中限制性内切酶x的第一酶切位点q1；当n＞1时，从所述rs-1～rs-n中选择一个位于所述s1序列中部的位点，标记为步骤1.1中所述p1中限制性内切酶x的第一酶切位点q1，同时若所述s1序列中除q1外包含不符合预设位置的限制性内切酶x识别位点，则通过同义突变在不改变所述s1序列对应氨基酸序列的基础上移除不符合预期的酶切位点；
14.当步骤1.1所述s1序列中无s2序列时，按照如下步骤进行：
15.所述s1序列对应的蛋白序列根据密码表进行反向翻译，获得候选dna序列；从所述候选dna序列中筛选出一个序列s3，所述序列s3仅包含一个s2序列，且所述s2序列处于所述序列s3中部，所述s2序列在所述s3序列中的位置标记为rs-1；s3与s1序列的唯一区别在于s3中包含s2序列，而s1中不包含s2序列，所述s2序列在所述s1序列中的对应序列为预突变序列s4；将步骤1.1中所述参考序列p1中的s1序列用s3序列进行替换，修改后的参考序列p1中的rs-1位点标记为限制性内切酶x的第一酶切位点q1；
16.步骤1.3、以步骤1.2确定的第一酶切位点q1为基础，以最终要获得的dna片段的种类和数目为依据，以不改变筛选标记基因s1对应蛋白序列和复制起始点序列ori为前提，以最大限度保留p1中原有的限制性内切酶x识别位点为考量，以第一酶切位点q1为锚定点，通过插入、删除或定点编辑改变步骤1.1中所述参考序列p1，引入m个预设酶切位点q1-qm，m为≥1的自然数，最终设计出目标质粒p2序列；
17.步骤2、目标质粒的获得：
18.以步骤1.3得到的目标质粒p2序列为蓝本，通过分子生物学手段获得目标质粒，即为紧凑型质粒。
19.优选地，步骤1.1所述参考质粒p1为pm5500，来自发明专利“一种人工设计质粒pm5500及其在dna marker制备中的应用”(cn111705071a)，核苷酸序列如seq id no：1所示；
20.优选地，步骤1.3所述目标质粒p2为pm4850，核苷酸序列如seq id no：5所示。
21.本发明以参考质粒pm5500为骨架，该质粒具有经典的高拷贝复制起始点，以参考质粒pm5500为基础改造的质粒pm4850保留了上述的高拷贝复制起始点，使得质粒pm4850结构紧凑，具有极强扩增性和稳定性，有利于大规模发酵制备。
22.优选地，步骤1.1所述的筛选标记基因为氨苄青霉素抗性基因，核苷酸序列如seq id no：2所示。
23.优选地，步骤1.1所述目标限制性内切酶x为bamh i，所述目标限制性内切酶x识别的序列s2如seq id no：3所示。
24.优选地，步骤1.2所述预突变序列s4如seq id no：4所示。
25.优选地，步骤2所述分子生物学手段包括化学合成、扩增及拼接，具体为：通过化学合成方法全合成p2质粒；或将目标序列分段化学合成，然后拼接为完整的目标质粒p2；或以参考质粒p1为模板扩增片段并通过重叠pcr或无缝克隆技术拼接获得p2质粒。
26.本发明还具有如下技术特征：
27.具体的，通过所述步骤1.2在s1中找到一个s2位点并设定为p1中第一酶切位点q1，s1中的其它s2序列位点通过同义突变消除。
28.具体的，通过所述步骤1.2找到的s3序列中包含一个且仅有一个s2序列，除了s2序列所处位置外，其它部分序列与s1完全一致，s3和s1编码蛋白的氨基酸序列完全一致；s1中对应s3中s2的序列为预突变序列s4。
29.本发明还提供了一种上述质粒的应用，所述质粒用于制备小片段dna marker。
30.优选地，所述小片段dna marker是指dna marker中各个条带的dna片段均小于或等于700bp，特别是包含了100bp以下的75bp、50bp和25bp片段对应条带。
31.优选地，所述质粒为pm4850，长度为4850bp，核苷酸序列如seq id no：5所示。
32.优选地，所述质粒pm4850结构紧凑，利用率高，在碱基对数目为4850bp的质粒序列中包含了36个限制性内切酶bamh i的酶切位点，所述的36个bamh i的酶切位点分别位于质粒pm4850的17bp、417bp、1017bp、1092bp、1392bp、1592bp、2292bp、2442bp、2517bp、2542bp、2567bp、2592bp、2642bp、2692bp、2717bp、2767bp、2792bp、2817bp、3067bp、3167bp、3267bp、3367bp、3417bp、3617bp、3817bp、3892bp、3967bp、3992bp、4017bp、4067bp、4092bp、4117bp、4167bp、4192bp、4217bp和4367bp处。
33.优选地，使用bamh i对质粒pm4850进行酶切后，可获得12种特征片段，大小分别为700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、75bp、50bp和25bp，酶切反应产物中各片段的相对质量比为7:6:5:4:3:2.5:6:3:3:3:3:3。
34.优选地，将所述质粒pm4850的bamh i酶切产物直接作为小片段dna marker，或作为制作dna marker的原料，应用于生物学研究或生物技术领域。
35.本发明与现有技术相比具有以下优点：
36.1、本发明的构建方法，将目标限制酶x的第一酶切位点q1引入在筛选标记基因内，并以q1为锚点，在不影响筛选标记基因蛋白序列和复制起始点序列ori的基础上，引入更多目标限制酶x切点，实现了质粒的紧凑化设计和序列的高效率利用。
37.2、本发明的质粒pm4850结构紧凑，利用率高，在碱基对数目为4850bp的质粒序列中，包含了36个不同大小的bamh i酶切dna片段。
38.3、本发明以参考质粒pm5500为骨架，具有经典的高拷贝复制起始点，以此骨架质粒pm5500为基础改造的质粒pm4850保留了上述的高拷贝复制起始点，使得质粒pm4850具有极强扩增性和稳定性，有利于大规模发酵制备。
39.4、本发明的质粒pm4850进行酶切反应后，能够获得碱基对数目25bp～700bp之间的小片段dna混合物，酶切产物可直接制备成小片段dna marker，该小片段dna marker带型独特齐全，便于目标dna片段的相对定量，其中200bp条带为易于分辨的特征条带，便于迅速推断目标dna片段的长度。
40.5、本发明的质粒pm4850进行酶切反应后，可在酶切产物中额外添加不同大小的dna片段，制备出不同于原有带型的其它dna marker。
41.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
42.图1为实施例1的长片段l1的示意图。
43.图2为实施例1的长片段l2构建过程的示意图。
44.图3为实施例2中质粒pm4850的质粒图谱。
45.图4为实施例2的小片段dna marker的电泳图。
具体实施方式
46.实施例1
47.本实施例为一种用于dna marker制备的紧凑型质粒的构建方法，该方法包括如下步骤：
48.步骤1、设计目标质粒序列：
49.步骤1.1、确定一个用参考质粒，命名为p1，所述p1上的筛选标记基因为s1，所述筛选标记基因的核苷酸序列为s1序列；
50.选择一种限制性内切酶x，所述限制性内切酶x所识别的序列片段为s2；
51.本实施例中，所述参考质粒p1为pm5500，来自发明专利“一种人工设计质粒pm5500及其在dna marker制备中的应用”(cn111705071a)，核苷酸序列如seq id no：1所示；
52.所述筛选标记基因s1为氨苄青霉素抗性基因，核苷酸序列如seq id no：2所示；
53.所述限制性内切酶x为bamh i，所述限制性内切酶x所识别的序列s2如seq id no：3所示；
54.步骤1.2、第一酶切位点q1的确定：
55.在步骤1.1中s1序列内搜索s2，本实例中s1中不包含s2序列位点；
56.将步骤1.1中所述s1基因对应蛋白序列根据密码表进行反向翻译，获得所有可能编码s1对应蛋白的dna序列集；从中筛选出一个序列s3，s3中包含1个限制性内切酶bamh i切点s2序列，如seq id no：3所示，位于s3序列中部；s2序列在s1中的对应序列为预突变序列s4，所述s4序列具体如seq id no：4所示；所述s2序列在所述s3序列中所处的位置标记为rs-1；将步骤1.1中所述参考序列pm5500中的s1序列用s3序列进行替换，这种替换不改变筛选标记基因s1对应的蛋白序列；将修改后的pm5500序列中的rs-1位点标记为限制性内切酶bamh i的第一酶切位点q1；该位点在修改后的参考质粒pm5500序列的416bp～421bp处；
57.步骤1.3、以步骤1.2获得的修改后的参考质粒pm5500和第一酶切位点q1为基础，以最终构建的质粒需包含25～700bp的12大小不同片段且各片段质量比例协调为依据，以不改变氨苄青霉素抗性基因对应氨基酸序列和复制起始点ori序列为前提，以最大限度保留p1中原有的bamh i切点为考量，以q1为参考点，通过插入、删除或定点编辑获得设计好的目标质粒pm4850序列，如seq id no：5所示。
58.步骤2、目标质粒pm4850的获得：
59.以步骤1.3中设计好的质粒pm4850序列为蓝本，首选获得两个末端重叠的长片段：长片段l1和长片段l2，然后通过无缝克隆将两个片段拼接获得紧凑型质粒pm4850。
60.所述长片段l1的长度为1894bp，包括26个预设bamh i识别的位点，26个识别位点中10个存在于参考序列pm5500中，另外16个在重新设计时引入；所述长片段l1由北京擎科生物科技有限公司直接合成，如图1所示。
61.所述长片段l2的长度为2994bp，包括了10个预设的bamh i识别位点，其中2个原本就存在于质粒pm5500序列中，另外8个在引物设计时引入。长片段l2通过重叠pcr获得，l2的构建过程如图2所示，首先设计多对特异性引物，并在该特异性引物中包含bamh i所识别的序列s2，以质粒pm5500为模板，通过pcr扩增获得9个片段，大小分别为720bp、620bp、515bp、
415bp、315bp、215bp、165bp、95bp、70bp，使用重叠pcr法将上述9个片段拼接成长片段l2。
62.所述pcr、重叠pcr扩增采用dna聚合酶为hs dna polymerase(货号：r010q，takara)。
63.采取无缝克隆法，将长片段l1和长片段l2拼接到一起，获得目标质粒p2，即为所述用于制备小片段dna marker的质粒。具体方法为：长片段l1和长片段l2的两端设置有19bp重叠序列作为拼接时的同源臂序列，将长片段l1和长片段l2以相等的摩尔量混合，加入无缝克隆试剂，在37℃下反应30分钟后，将反应产物转化至top10感受态细胞，筛选阳性克隆并提取质粒进行酶切验证和测序验证，最终获得用于小片段dna marker制备的紧凑型质粒pm4850。
64.所述无缝克隆试剂为clonexpress ii one step cloning kit(货号：c112-01，南京诺唯赞公司)，用于目标质粒的拼接。
65.本实施例以参考质粒pm5500为骨架，具有经典的高拷贝复制起始点，以质粒pm5500为基础改造的目标质粒pm4850保留了上述的高拷贝复制起始点，使得质粒pm4850结构紧凑，具有极强扩增性和稳定性，有利于大规模发酵制备。
66.本实施例的目标质粒设计和构建过程中，还可以采用其它种类的限制性内切酶，如ecor i、hindⅲ、pst i等；其它的骨架质粒，如puc19、pbr322、puc57等；构建的过程可采用上述或其它各种流行的dna片段获得和拼装技术，如化学合成、pcr扩增、重叠延伸拼接、in-fusion克隆、gibson assembly克隆等方法。
67.实施例2
68.本实施例为一种用实施例1所述构建方法得到的质粒的应用，所述紧凑型质粒pm4850的bamh i酶切产物可直接作为小片段dna marker，或作为制作dna marker的原料，应用于生物学研究或生物技术领域。
69.所述质粒pm4850，长度为4850bp，核苷酸序列如seq id no：5所示。
70.所述小片段dna marker是指dna marker中各个条带的dna片段均小于或等于700bp，特别是包含了100bp以下的75bp、50bp和25bp片段对应条带。
71.将所述质粒酶切制备小片段dna marker使用的限制性内切酶为quickcut
tm bamh i(简写为bamh i，货号：1605，takara)。
72.本实施例中，质粒pm4850结构紧凑，利用率高，在碱基对数目为4850bp的质粒序列中包含了36个bamh i的酶切位点，如图3所示。36个bamh i的酶切位点分别位于质粒pm4850的17bp、417bp、1017bp、1092bp、1392bp、1592bp、2292bp、2442bp、2517bp、2542bp、2567bp、2592bp、2642bp、2692bp、2717bp、2767bp、2792bp、2817bp、3067bp、3167bp、3267bp、3367bp、3417bp、3617bp、3817bp、3892bp、3967bp、3992bp、4017bp、4067bp、4092bp、4117bp、4167bp、4192bp、4217bp和4367bp处。
73.本实施例中，使用bamh i对质粒pm4850进行酶切后，获得的dna片段大小分别为700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、75bp、50bp和25bp，各片段在酶切反应产物中的相对质量比为7:6:5:4:3:2.5:6:3:3:3:3:3。
74.如上所述，紧凑型质粒pm4850进行酶切反应后，能够获得碱基对数目在25bp～700bp之间的小片段dna混合物；该酶切产物可直接制备成小片段dna marker，得到的小片段dna marker带型独特齐全，便于目标dna片段的相对定量，其中200bp条带为易于分辨的
特征条带，便于迅速推断目标dna片段的长度。
75.另外，本发明的紧凑型质粒pm4850进行酶切反应后，可在酶切产物中额外添加不同大小的dna片段，用于制备不同于原有带型的其它dna marker。
76.本实施例中还提供了获得质粒pm4850酶切反应产物的方法，该方法具体步骤如下：
77.(1)收集含pm4850质粒的菌体：
78.将pm4850质粒通过电击转化法导入克隆菌株top10、dh5α或类似菌株，挑取单克隆到20ml含有氨苄青霉素(终浓度100μg/ml)的lb培养基中过夜培养；然后将上述过夜培养后的菌液以0.2％的体积比接种至500ml含有氨苄青霉素(终浓度100μg/ml)的lb培养基中，在温度为37℃、转速为250rpm的条件下培养20h，8000g离心8min，收集菌体。
79.(2)提取pm4850质粒dna：
80.在(1)得到的菌体中加入18ml包含rnasea的溶液i，使菌体悬浮，然后加入2ml 10mg/ml的溶菌酶，室温放置10min，再加入40ml溶液ii混匀放置5min，加入30ml溶液iii中和，4℃下14000g离心15min，过滤、收集上清液，室温加入0.6倍体积异丙醇，4℃下14000g离心15min，弃去上清，加入30ml体积分数为70％的乙醇溶液洗涤沉淀，4℃下14000g离心5min，弃去上清，开盖，室温放置15min，待乙醇挥发完后，加入2ml te缓冲液溶解质粒dna。
81.所述碱裂解法提取质粒所用的溶液i、溶液ii、溶液iii及te缓冲液的配制方法参考《分子克隆实验指南》(第三版)(科学出版社，2002)。
82.(3)进行酶切反应：
83.取16μg的pm4850质粒dna，加入5μl酶切缓冲液、2μl限制性内切酶bamh i，最后加入纯水，将酶切体系的总体积补足至50μl；在温度为30℃的条件下反应2h，获得酶切反应产物。
84.本实施例的酶切反应产物中包含1个700bp的片段、1个600bp的片段、1个500bp的片段、1个400bp的片段、1个300bp的片段、1个250bp的片段、3个200bp的片段、2个150bp的片段、3个100bp的片段、4个75bp的片段、6个50bp和12个25bp的片段。
85.在上述的酶切反应产物中加入1/5体积的6
×
loading buffer，混匀即可直接获得包含12种片段的小片段dna marker，大小分别为700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、75bp、50bp、25bp，该小片段dna marker电泳结果如图4所示，电泳采用2％tbe琼脂糖凝胶，eb染色。
86.所述电泳用的6
×
loading buffer的配制方法参考《分子克隆实验指南》(第三版)(科学出版社，2002)。
87.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

技术特征：
1.一种用于dnamarker制备的紧凑型质粒的构建方法，其特征在于，该方法为：步骤1、目标质粒的设计：步骤1.1、确定一个参考质粒，命名为p1，所述p1上的筛选标记基因为s1，所述筛选标记基因的核苷酸序列为s1序列；选择一种目标限制性内切酶x，所述目标限制性内切酶x识别的序列为s2；步骤1.2、第一酶切位点q1的确定：当步骤1.1所述s1序列中有s2序列时，按照如下步骤进行：在步骤1.1所述s1序列中寻找s2序列，所述s1序列中包含n个s2位点，标记为rs-1～rs-n，n为≥1的自然数；当n＝1时，位点rs-1标记为步骤1.1中所述p1中限制性内切酶x的第一酶切位点q1；当n＞1时，从所述rs-1～rs-n中选择一个位于所述s1序列中部的位点，标记为步骤1.1中所述p1中限制性内切酶x的第一酶切位点q1，若所述s1序列中除q1外包含不符合预设位置的限制性内切酶x识别位点，则通过同义突变在不改变所述s1序列对应氨基酸序列的基础上移除不符合预期的酶切位点；当步骤1.1所述s1序列中无s2序列时，按照如下步骤进行：将所述s1序列对应的蛋白序列进行反向翻译，获得候选dna序列；从所述候选dna序列中筛选出一个序列s3，所述序列s3仅包含一个s2序列，且所述s2序列处于所述序列s3中部，所述s2序列在所述s3序列中的位置标记为rs-1，所述s2序列在所述s1序列中的对应序列为预突变序列s4；将步骤1.1中所述参考序列p1中的s1序列用所述s3序列进行替换，修改后的参考序列p1中的rs-1位点标记为限制性内切酶x的第一酶切位点q1；步骤1.3、以步骤1.2确定的第一酶切位点q1为锚定点，通过插入、删除或定点编辑改变步骤1.1中所述参考序列p1，引入m个预设酶切位点q1-qm，m为≥1的自然数，最终设计出目标质粒p2序列；步骤2、目标质粒的获得：以步骤1.3得到的目标质粒p2序列为蓝本，通过分子生物学手段获得目标质粒p2，即为紧凑型质粒。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1.1所述参考质粒p1为pm5500，核苷酸序列如seq id no：1所示；所述筛选标记基因s1为氨苄青霉素抗性基因，核苷酸序列如seq id no：2所示。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1.1所述目标限制性内切酶x为bamhi，所述目标限制性内切酶x识别的序列s2如seq id no：3所示。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1.2所述预突变序列s4如seq id no：4所示。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1.3所述目标质粒p2为pm4850，核苷酸序列如seq id no：5所示。6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2所述分子生物学手段包括化学合成、扩增及拼接，具体为：通过化学合成方法全合成p2质粒；或将目标序列分段化学合成，然后拼接为完整的目标质粒p2；或以参考质粒p1为模板扩增片段，并通过重叠pcr或无缝克隆技术拼接获得p2质粒。
7.一种如权利要求1～6中任一权利要求所述质粒的应用，其特征在于，所述质粒用于制备小片段dnamarker；所述小片段dnamarker是指dnamarker中各个条带的dna片段均小于或等于700bp。8.根据权利要求7所述的质粒的应用，其特征在于，所述质粒为pm4850，长度为4850bp，核苷酸序列如seq id no：5。9.根据权利要求8所述的质粒的应用，其特征在于，所述质粒pm4850上包括36个限制性内切酶bamhi的酶切位点，单酶切后可获得12种特征片段，大小分别为700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、75bp、50bp和25bp，各片段的相对质量比为7:6:5:4:3:2.5:6:3:3:3:3:3。10.根据权利要求9所述的质粒的应用，其特征在于，将所述质粒pm4850的bamhi酶切产物直接作为小片段dnamarker，或作为制作dnamarker的原料，应用于生物学研究或生物技术领域。

技术总结
本发明提供了一种用于DNAMarker制备的紧凑型质粒的构建方法，该构建方法为：在参考质粒P1中的筛选标记基因S1内找到或引入一个目标限制性内切酶X的切点Q1，在不改变筛选标记基因S1对应蛋白序列和复制起始点序列Ori的前提下，以Q1为锚定点，引入更多限制性内切酶X识别位点，设计出目标质粒P2序列；以P2序列为蓝本，通过化学合成及扩增拼接方法获得目标质粒P2，即紧凑型质粒pM4850。本发明还提供了所述质粒的应用，该质粒长度4850bp，核苷酸序列为SEQ ID NO：5，包含36个限制性内切酶BamHI切点，单酶切可获得12种特征片段，大小依次为700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、75bp、50bp和25bp，各片段的相对质量比为7:6:5:4:3:2.5:6:3:3:3:3:3，可作为小片段DNAMarker应用于科学研究和生物技术领域。技术领域。技术领域。


技术研发人员：范三红 檀秋林 单丽伟 胡小平
受保护的技术使用者：西安赛恩泽生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.12
技术公布日：2023/7/13