益蝽多肽Ple1及其应用的制作方法

益蝽多肽ple1及其应用
技术领域
1.本发明属于生物防治技术领域，具体来说涉及一种益蝽多肽，同时还涉及该益蝽多肽在制备烟蚜、斜纹夜蛾、二化螟杀虫剂中的应用。
2.

背景技术：

3.生物农药因其自然资源丰富和生产成本低廉和相对较好的环境相容性是目前农药发展的重点。动物毒素是高效杀虫剂开发的重要来源，尤其是昆虫天敌的毒素，比传统农药更具靶特异性，是高效安全杀虫剂开发的优质资源(king and hardy, 2013; senji laxmeet al., 2019)。目前杀虫剂开发研究最多的昆虫天敌毒素是蛛毒(king and hardy, 2013; luddecke et al., 2022)。在全世界所有现存蜘蛛毒液中估计就有超过千万种杀虫毒素物质(luddeckeet al., 2022)，但仅有少数蜘蛛毒素具有较高的杀虫选择性。例如目前唯一面市的来源于蛛毒的杀虫剂是基于澳大利亚漏斗形蜘蛛hadronyche versuta的一个多肽毒素gs-ω/κ-hexatoxin-hv1a，其对害虫高效的同时对蜜蜂和脊椎动物比较安全。
4.相对于蜘蛛等其它天敌，捕食性昆虫的食性更窄，其毒素具有更高的选择性。目前毒素研究较多的捕食性昆虫有捕食性蝽、寄生蜂和捕食蝇等。已知捕食性蝽毒液具有很强的杀虫活性。如猎蝽毒液注入昆虫体内导致瘫痪、组织液化和死亡 (walker et al., 2016)；益蝽picromerus nigrispinus毒腺提取样品对大豆夜蛾的ld
50
约为2 ul/头 (martinez et al., 2016)。
5.动物毒液中最普遍存在的毒肽是knottin毒肽(king, 2019; matsubara et al., 2017)。knottin是指具有3对及以上的二硫键串成的扭结状结构（knottin）的小肽，在生物体内非常稳定。knottin多肽结构具有非凡的可塑性，不同生物进化出丰富多样的knottin多肽行使着不同功能(king, 2019)。例如已商品化的蛛毒杀虫剂有效成分gs-ω/κ-hexatoxin-hv1a就是一个knottin多肽。捕食性蝽猎蝽毒液中的knottin毒肽，具有抑制电压门控钙离子通道（cav2.2）的活性，但是尚未发现其具有杀虫活性(corzo et al., 2001; rugen et al., 2021)。
6.同为捕食性蝽科的益蝽picromerus lewisi (scott)可捕食鳞翅目、鞘翅目如斜纹夜蛾、草地贪夜蛾、叶甲等40多种农林害虫，是优良的捕食性天敌，目前已进行人工规模化繁育和应用。然而目前尚无关于益蝽毒液及毒素的研究报道。由于益蝽一直处于田间生态系统中，且与植食性蝽在进化上高度同源，益蝽毒素可能具有高选择性，因此基于益蝽毒液开发具杀虫活性的knottin毒肽更适用于害虫绿色防控。
7.

技术实现要素：

8.本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种对烟蚜、斜纹夜蛾、二化螟具有杀虫活性的益蝽多肽ple1。
9.本发明的另一目的在于提供该益蝽多肽ple1在制备烟蚜、斜纹夜蛾、二化螟杀虫剂中的应用。
10.本发明的益蝽多肽ple1基因的编码序列区域（cds）的全长序列为atgaagttctatctccttctgttcctcgtcatcgtcgtcctcgcctgcggggtcctggctcttcaagagcccaactgcatacagagaggaaaggaatgcgttggcgcatccatgggatgctgtaagggcttgaggtgcctgtactacgccaacaggtgtgttgggccgtga，成熟肽序列为lqepnciqrgkecigasmgcckglrclyyanrcvgp，具有6个半胱氨酸形成3个二硫键，二硫键的方式为c1-c4，c2-c5，c3-c6。
11.本发明的益蝽多肽ple1在制备烟蚜、斜纹夜蛾、二化螟杀虫剂中的应用。
12.本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：利用人工饲料饲喂法测定益蝽多肽对烟蚜二龄若虫的杀虫活性，发现ple1多肽10μmol/l处理5天死亡率为86.7%，表明益蝽ple1多肽测试浓度对烟蚜的毒杀活性较高。利用微量注射法测定益蝽多肽对斜纹夜蛾二龄幼虫的杀虫活性，发现ple1多肽浓度10μmol/l处理72h死亡率为66.7%，表明ple1多肽测试浓度对斜纹夜蛾的毒力较高。利用微量注射法测定益蝽多肽对二化螟四龄幼虫的杀虫活性，发现ple1多肽40μmol/l处理二化螟7d后的死亡率为80%，表明益蝽ple1多肽测试浓度对二化螟的毒力较高。
13.附图说明
14.图1为益蝽多肽ple1、猎蝽毒肽ptu1和蜘蛛毒肽hv1a的序列比对分析图（ptu1：乌黑盗猎蝽，p58606.1、hv1a：漏斗网蜘蛛，p56207）；图2为益蝽多肽ple1的三维结构（利用swiss-model在线网站进行同源建模，模板为lmr.1.a（toxin ado1），图中深色标示半胱氨酸）；图3为益蝽多肽ple1的化学合成制备样品质谱检测图图4为益蝽多肽ple1的化学合成制备样品hplc分析图图5为益蝽多肽ple1对烟蚜的毒力（人工饲喂法，阳性对照为阿维菌素abamectin 8.87 mg/l）图6为益蝽多肽ple1对斜纹夜蛾的毒力（注射法，阳性对照为阿维菌素abamectin 0.89 ng/头）图7为益蝽多肽ple1对二化螟的毒力（注射法）
具体实施方式
15.实施例1：益蝽多肽ple1的合成方法，包括以下步骤：（1）蠋蝽多肽基因的设计和构建方法解剖益蝽成虫毒腺50对，提取总rna，三个重复样品，送至测序公司进行rna-seq转录组测序分析。根据注释信息和blast来查找益蝽多肽基因。提取益蝽成虫总rna，反转录获得cdna模板，之后通过pcr扩增目的基因，进行测序验证。
16.在益蝽毒腺转录组数据中，发现一个富含半胱氨酸的小肽基因，命名为益蝽多肽ple1。
17.在蠋蝽毒腺转录组数据中，将一个富含半胱氨酸的小肽基因命名为益蝽多肽
ple1。经基因克隆测序验证，该益蝽多肽ple1基因的编码序列区域（cds）的全长序列为atgaagttctatctccttctgttcctcgtcatcgtcgtcctcgcctgcggggtcctggctcttcaagagcccaactgcatacagagaggaaaggaatgcgttggcgcatccatgggatgctgtaagggcttgaggtgcctgtactacgccaacaggtgtgttgggccgtga。益蝽多肽ple1的成熟肽序列为lqepnciqrgkecigasmgcckglrclyyanrcvgp，与已知猎蝽毒肽ptu1和蜘蛛毒肽hv1a一样，都含有具有6个半胱氨酸形成3个二硫键，二硫键的方式为c1-c4，c2-c5，c3-c6，但是氨基酸序列相似度较低（25%-35%）（图1）。通过基因克隆测序验证该毒肽基因序列是正确的。
18.（2）益蝽多肽ple1的化学合成益蝽ple1多肽（lqepnciqrgkecigasmgcckglrclyyanrcvgp），有效成分含量为93.78％，由强耀生物科技有限公司通过9-芴甲氧羰基（fmoc）固相化学合成技术生产。保证二硫键定向连接，即n端第一个和第四个、第二个和第五个、第三个和第六个半胱氨酸分别形成二硫键（c1-c4, c2-c5和c3-c6)。
19.合成步骤如下：将fmoc保护的c端第一个氨基酸与树脂连接；去除fmoc保护基，茚三酮检测是否成功连接；加入第二个fmoc保护氨基酸进行缩合，茚三酮检测；然后依次加入不同氨基酸进行连接直到最后一个氨基酸为止；最后加入切割液切除fmoc和树脂；加入乙醚后离心和吹干；利用dmso氧化法进行定向二硫键修改得到粗产物；利用高效液相色谱（hplc）进行分离纯化，冻干得到成品。最后进行质谱确认（图3）和hplc纯度鉴定（图4）。
20.试验例1：益蝽多肽ple1对烟蚜的杀虫活性测定采用人工饲料饲喂法测定益蝽多肽对烟蚜二龄若虫的杀虫活性。用dmso将多肽原样配制成1mmol/l的多肽母液，再用人工饲料稀释成测试浓度溶液。用1%dmso的人工饲料溶液作为对照。处理试虫转移至一个装有烟草叶碟的培养皿（直径为10cm，皿底倒入2%琼脂）中。每隔一天更换一次人工饲料，每个重复10头，共3个重复。培养皿置在温度21
±1°
c、湿度50%
±
10%和光照周期16:8 (l: d) h的培养室中。
21.试验中溶剂对照组5天死亡率为30%。ple1多肽10μmol/l处理5天死亡率为86.7%（图5）。结果表明益蝽ple1多肽测试浓度对烟蚜的毒杀活性较高。
22.试验例2：益蝽多肽ple1对斜纹夜蛾的杀虫活性测定利用微量注射法测定益蝽多肽对斜纹夜蛾二龄幼虫的杀虫活性。利用显微注射仪将不同毒肽溶液分别注射至2龄斜纹夜蛾幼虫体内，注射部位为斜纹夜蛾幼虫中胸背部。用含1%dmso水溶液作为对照。每头注射量为100nl，注射流速20nl/s。每头注射处理试虫转移至一个装有烟草叶碟的培养皿（直径为10cm，皿底倒入2%琼脂）中。每个处理10头，三组重复共30头。温度27
±1°
c、湿度50%
±
10%和光照周期16:8 (l: d) h的培养室中。注射24h、48h、72h后观察试虫的死亡情况。死亡症状判定标准为毛笔轻触无自主反应。
23.试验对照组72h内的死亡率均不超过20%。ple1多肽浓度10μmol/l处理72h死亡率为66.7%（图6）。结果表明ple1多肽测试浓度对斜纹夜蛾的毒力较高。
24.试验例3：益蝽多肽ple1对二化螟的杀虫活性测定利用微量注射法测定益蝽多肽对二化螟四龄幼虫的杀虫活性。利用显微注射仪将测试多肽溶液注射至4龄二化螟幼虫体内，注射部位为二化螟幼虫背板腹面第二节和第三节的节间膜。用含4%dmso水溶液作为溶剂对照。每头注射量为100nl，注射流速20nl/s。将注射完成后的二化螟幼虫转移至圆锥形塑料小盒内（底部直径为3cm，顶部直径为3.7cm，高为
3.3cm，盒子底部放置适量人工饲料，顶部扎小孔方便二化螟透气）。每个处理共10头。培养皿置在温度27
±
1℃、湿度70
±
10%和光暗周期16h:8h的培养室中。注射后每天观察死亡情况。死亡症状判定标准为毛笔轻触无自主反应。
25.溶剂对照组7d的死亡率为20%，ple1多肽40μmol/l处理二化螟7d后的死亡率为80%（图7）。结果表明益蝽ple1多肽测试浓度对二化螟的毒力较高。
26.通过生测实验发现益蝽多肽ple1对烟蚜、斜纹夜蛾和二化螟均具有较高的毒力。
27.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

技术特征：
1.一种益蝽多肽ple1，其基因的编码序列区域的全长序列为atgaagttctatctccttctgttcctcgtcatcgtcgtcctcgcctgcggggtcctggctcttcaagagcccaactgcatacagagaggaaaggaatgcgttggcgcatccatgggatgctgtaagggcttgaggtgcctgtactacgccaacaggtgtgttgggccgtga。2.如权利要求1所述的益蝽多肽ple1，其成熟肽序列为lqepnciqrgkecigasmgcckglrclyyanrcvgp，具有6个半胱氨酸形成3个二硫键，二硫键的方式为c1-c4，c2-c5，c3-c6。3.一种益蝽多肽ple1在制备烟蚜、斜纹夜蛾、二化螟杀虫剂中的应用。

技术总结
本发明公开了一种益蝽多肽Ple1及其应用，属于生物防治技术领域，该益蝽多肽Ple1基因的编码序列区域的全长序列为ATGAAGTTCTATCTCCTTCTGTTCCTCGTCATCGTCGTCCTCGCCTGCGGGGTCCTGGCTCTTCAAGAGCCCAACTGCATACAGAGAGGAAAGGAATGCGTTGGCGCATCCATGGGATGCTGTAAGGGCTTGAGGTGCCTGTACTACGCCAACAGGTGTGTTGGGCCGTGA，成熟肽序列为LQEPNCIQRGKECIGASMGCCKGLRCLYYANRCVGP，具有6个半胱氨酸形成3个二硫键，二硫键的方式为C1-C4，C2-C5，C3-C6。本发明益蝽多肽Ple1的对烟蚜、斜纹夜蛾、二化螟具有杀虫活性。二化螟具有杀虫活性。二化螟具有杀虫活性。


技术研发人员：何月平 李文红 黄纯杨 王忻怡 杨明未
受保护的技术使用者：贵州省植物保护研究所
技术研发日：2023.04.12
技术公布日：2023/7/13